第二章 研究材料與方法
第三節 實驗方法
第三節 實驗方法
一、個體之挑選、配對及角色決定
本研究使用八個月大以上 (已達性成熟)，雌雄同體、外觀健康
之個體。所有個體都曾有過打鬥經驗，為了控制最近一次打鬥勝負 (前次打鬥勝負，last outcome) 的影響，所有個體在最後一次打鬥後 皆已獨自隔離至少一個月。研究開始前，依照品系、前次打鬥勝負結 果、標準體長 (吻端至尾鳍軀幹連接點，差異 < 1 mm) 將個體兩兩 配對，將各配對隨機分配至六個實驗組別中，各實驗組別的配對平均 標準體長及範圍見表二。各配對中，隨機選擇其一為實驗個體、另一 為配對個體 (matched opponent)：實驗個體接受實驗處理，配對個體 則為實驗個體打鬥測詴時的對手，由於同一對之實驗個體與配對個體 之品系與前次打鬥勝負結果相同而標準體長類似，本研究假設兩者的 打鬥能力相似，因此打鬥時實驗個體與配對個體的行為差異被預期是
實驗處理造成的影響。
二、荷爾蒙收集、萃取及保存
個體的基礎荷爾蒙與經驗後荷爾蒙於 11：00 開始收集，打鬥後 荷爾蒙則於打鬥結束後立即開始收集，所有收集皆持續一小時。
本研究以非侵入式 (non-invasive) 之方法收集魚體釋放於水中 的荷爾蒙分子。睪固酮、皮質醇屬於自由類固醇 (free steroid)，會自 魚鰓或皮膚自血液擴散至水中，其擴散速率與血液內的荷爾蒙濃度呈 顯著的正相關 (Scott & Ellis, 2007)。本研究的收集容器是裝有 200 毫 升乾淨人工海水的組合杯 (外層：玻璃燒杯；內層：玻璃漏杯)；收 集荷爾蒙時，實驗個體被小心地從飼養盒中撈出並被置入組合杯中，
靜置一小時後，實驗個體將與內層的玻璃漏杯一起被拿出，而含有荷 爾蒙分子的水樣則留在玻璃燒杯中。此收集方法的優點是：(1) 減少 麻醉、抽血等處理對實驗動物造成的壓力；(2) 能多次測量同一隻實 驗動物的荷爾蒙狀態；(3) 能測量動物於一段時間內的平均荷爾蒙狀 況；(4) 能藉著非犧牲的方式測量小體型生物 (如 K. marmoratus) 的 內分泌狀態 (Scott & Ellis, 2007；Earley & Hsu, 2008)。
荷爾蒙收集結束後，利用固相萃取法 (solid phase extraction, Scott
et al., 2001)，以 C18 固相萃取管 (C18 solid phase extraction columns, Lichrolut RP-18, 500mg, 3.0ml, Merck) 萃取水樣中的荷爾蒙分子
(Earley & Hsu, 2008)。其步驟為：(1) 活化：利用空氣幫浦及真空裝 置汲取詴藥級甲醇 (methanol, MEOH, 99.9%) 2mm 通過萃取管兩次 (2mm × 2 = 4mm)，再以 2mm 二次水 (ddH2O) 通過萃取管兩次；(2) 荷爾蒙抓取：將含有荷爾蒙之水樣通過萃取管，萃取管經活化步驟後，
管內產生之凡德瓦力能抓取荷爾蒙分子；(3) 清洗萃取管：以 2mm 二次水通過萃取管兩次，以洗去殘留於萃取管中的鹽類；(4) 保存：
以封模蠟 (parafilm) 將萃取管密封，保存入-80℃冰箱保存。
三、經驗處理
經驗處理固定於 10：00 至 11：00 間完成。給予獲勝經驗處理時，
本研究利用隨機選擇，讓實驗個體與同品系但體型較小 (差異 >
2mm)、且有多次落敗經驗 ( >2 次) 的對手 (standard loser, STL) 打鬥，
由於 STL 幾乎不主動攻擊且經常率先認輸，因此可強制使實驗個體 得到獲勝經驗 (Hsu & Wolf, 1999; Hsu & Wolf, 2001)；另一方面，對 照 組 的 實驗 個體在 經 驗 處理 時不會 遭 遇 對手 ，因此 可 強 制使 其 得到對照經驗。
本研究的經驗處理共持續三天，每天給予一次經驗，皆於打鬥缸 中完成。打鬥缸為玻璃材質 (12 × 8 × 20 cm3)，三面覆蓋黑色的珍珠 板或保麗龍板 (僅留一面觀察用)，上方照射日光燈，缸底鋪有 3 ~ 4
將打鬥缸區隔為兩個大小相同的空間 (6 × 8 × 20 cm3)，每個隔間的水 面浮有黑色保麗龍板 (1.5 × 2 cm2) 提供陰影遮蔽。給予獲勝經驗時，
實驗個體與 STL 被分別置於黑色隔板的兩側空間 (左右隨機)，餵食 少許新鮮豐年蝦並等待 20 分鐘後 (使魚適應打鬥缸)，抽開隔板使兩 者打鬥；滿足：(1) 實驗個體進行攻擊；(2) STL 認輸撤退且不再還擊 兩條件後，定義實驗個體得到一次獲勝經驗，隨即隔開實驗個體與 STL，並紀錄從隔板抽開至得到獲勝經驗間經過的時間 (經驗訓練時 間)。給予對照經驗時，實驗個體被隨機置於隔板的一側，餵食少許 新鮮豐年蝦，等待 20 分鐘後抽開隔板，滿足：(1) 實驗個體進行自 由游動；(2) 經過與實驗組相同的經驗訓練時間兩條件後，定義其 得到一次對照經驗。
每次經驗給予完成，將實驗個體置回其飼養盒中，靜置至下次處 理。過程中，沒有發生魚體外表明顯受傷的狀況。實驗個體與三個不 同的 STL 打鬥而得到三次獲勝經驗，如此可避免其在得到第一次獲 勝經驗時對 STL 建立個體認知而對第二、三次獲勝經驗造成影響。
四、衰退時間處理
經驗處理結束後，實驗個體被置於各自的飼養盒中，經過 0 小時
(0-hour delay)、或 24 小時 (24-hour delay)、或 7 天 (7-day delay) 後，
進行打鬥測詴。靜置期間，每天固定於 10: 00 餵食新鮮豐年蝦一次。
五、打鬥測詴
打鬥測詴固定於 14：00 開始進行。為了避免經驗後荷爾蒙收集 過程對實驗個體造成太大的壓力，過度影響其打鬥行為；經驗後荷爾 蒙收集完畢後 (12：00)，實驗個體與配對個體被分別置入打鬥缸中 隔板的兩側空間 (左右隨機，打鬥缸設置如上文所述)，待其適應一 個半小時後餵食少許豐年蝦 (約十隻)。14：00 時，將隔板抽開讓雙 方打鬥，並記錄打鬥行為及勝負 (現場紀錄及錄影)。勝負分曉五分 鐘後，打鬥將強制結束 (以隔板區隔雙方)。若一個小時內沒有打鬥，
亦將強制結束雙方互動，並將此類資料歸類於沒有結果 (no result)。
打鬥時，為辨識實驗個體及配對個體，於打鬥前一天對配對個體 進行標記 (mark)：利用消毒後的針，將配對個體的尾鰭薄膜組織劃 開 (Hsu et al., 2008)。標記後，配對個體沒有異常狀況，而薄膜組織 能兩至三天內再生。本研究從未發現魚體因標記而感染之情況。
打鬥行為的定義如下 (Hsu et al., 2009) (表三)：(1) 率先展示者 (display initiator)：於打鬥中先轉向或游向對手的個體；(2) 率先鰓蓋 展示者 (gill display initiator) ：於展示時先將鰓蓋外擴的個體；(3) 率 先攻擊者 (attack initiator)：先快速游向、咬擊或碰撞對手的個體；(4)
互咬上下顎並甩動身體；(6) 獲勝/落敗個體 (winner/loser)：持續追逐 或攻擊對手五分鐘且未遭對手回擊者/上述個體的對手 ；(7) 撤退時 間 (retreat time)：落敗者第一次快速游離獲勝者且從此不再回擊的時 間點；(8) 打鬥持續時間 (contest duration)：初次展示至落敗者撤退 間經過的時間；(9) 打鬥後追擊次數 (post-contest attacks)：落敗者 撤退後五分鐘內，獲勝者平均每分鐘對其攻擊的次數。
六、荷爾蒙定量分析
本研究採用酵素免疫分析套組 (Cayman Chemical; ACTTM EIA
Kits)，此套組已證實能有效分析 K. marmoratus 的睪固酮及皮質酮含 量 (Earley & Hsu, 2008)。步驟為：(1) 洗提 (elute)：先以 2mm 二次 水通過冰封的萃取管兩次以解凍，隨後將 2mm 詴藥級乙酸乙酯 (ethyl acetate, EAC) 通過萃取管兩次，透過乙酸乙酯將荷爾蒙分子溶出並收 集至硼酸矽酸鹽玻璃管 (borosilicate vials, 6ml)；(2) 乾燥：利用離心 濃縮機 (Savant SpeedVac system) 使乙酸乙酯溶液完全乾燥，留下玻 璃管內荷爾蒙分子的固態萃取物粉末；(3) 將荷爾蒙的分子固態萃取 物粉末溶於 800ml 的酵素免疫緩衝溶液 (EIA buffer)；(4) 根據酵素 免疫分析法 (enzyme immunoassay) 的標準步驟，利用酵素免疫分析 儀 (Bio-Tek ELx808TM series ultra microplate reader)，以 405nm 波長讀
取吸光值，計算荷爾蒙濃度。
本研究的各種荷爾蒙濃度範圍是：睪固酮 (8.38 ~ 164.53 ng/ml, 平均值 37.87 ~ 43.07 ng/ml, 中位數 32.63 ~ 39.31 ng/ml)；皮質醇 (1.70 ~ 1063.4 ng/ml, 平均值 70.73 ~ 87.43ng/ml, 中位數 40.4 ~ 50.23 ng/ml)。因不符合常態分布，分析時使用自然對數 (natural log) 轉換。
荷爾蒙的分析間變異係數 (intra-assay coefficient) 的範圍是：睪固酮 (0.86% ~ 26.38%, 中位數 4.40%)；皮質醇 (2.17% ~ 5.33%, 中位數 3.77%)。分析內變異係數 (inter-assay coefficient) 的範圍是：睪固酮 (13.43%)；皮質醇 (7.87%)。靈敏度 (sensitivity) 的範圍是：睪固酮 (1.52 ~ 5.14 ng/ml)；皮質醇 (2.90~6.86 ng/ml)。