第四章 實驗材料與方法
第一節 實驗材料
第四章 第四章
第四章 實驗材料與方法 實驗材料與方法 實驗材料與方法 實驗材料與方法
第一節第一節第一節
第一節 實驗材料實驗材料實驗材料 實驗材料
一、胰島素阻抗細胞模式 1. 樣品來源
Caffeic acid、Cinnamic acid、Ferulic acid、para-coumaric acid、Chlorogenic acid、Gallic acid、Protocatechuic acid、Syringic acid、Vanillic acid 、Rosmarinic acid、Sinapic acid 純品購自 Sigma (St. Louis, USA)。
2. 實驗細胞
解凍之小鼠腦部神經母瘤細胞 (Neuro 2a) 細胞二至三天進行一次繼代培 養。去除舊的培養基，以 PBS 容易清洗細胞，再以胰蛋白酶 (Trypsin) 處理，
吸除後加入培養液 (MEMα + 10%FBS)，打散並懸浮細胞後，將細胞懸浮液吸 至 15mL 無菌離心管中，以 200 g、5 min 之條件離心。倒除上清液再重新以培 養液均勻懸浮細胞，計數細胞並將細胞數調整至 5 × 10 cells/mL。取 1mL 懸浮液至 10 cm (10 cm dish) 培養瓶中，置於 37℃，5% CO2之培養箱內。待 確定 Neuro 2a 細胞長至七分滿後，進行細胞實驗。
3. 實驗藥品及試劑
3.1 Sigma (St. Louis, USA)：
Bovine serum albumin (BSA) 、 Insulin 、 NaOH 、 HCl 、 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl-tetrazolium bromide (MTT reagent)、
Dimethyl sulfoxide (DMSO)、Disodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)、
Potassium chloride (KCl)、Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)、Sodium chloride (NaCl)、Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)
3.2 Gibco BRL (NY, USA)：
50
Fetal bovine serum (FBS)、Minimum Essential Medium Eagle Alpha (MEMα) medium
3.3 JRS (Lenexa, KS, USA):
Trypsin
3.4 Invitrogen（Eugene, Oregon, USA）:
2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG)
二、胰島素阻抗動物模式 1. 實驗樣品來源
選用經細胞實驗篩選後，認為較具減緩細胞胰島素阻抗，而改善葡萄糖 攝入能力之酚酸試藥級藥品-咖啡酸 Caffeic acid (購自 Sigma) 進行動物實驗 以複驗細胞試驗之結果。
2. 實驗動物
雄性 Sprague-Dawley 大鼠，購自樂斯科生物科技股份有限公司，購入週 齡為 8 週，約為 200~250 公克。飼養於台大食科所五樓動物房中。馴養時間 為三週，馴養期間供應充分飲水及正常實驗用錠狀飼料 (Laboratory Rodent Diet)，並維持室溫於 25±2℃、相對溼度 40~60%、光照週期 (light-dark cycle) 維持在 12 小時光照，12 小時黑暗的狀態。及動物房中 12 小時光照、12 小時 黑暗。
3. 實驗動物飼料
大鼠飼料 (Rodent Chow diet) 購自台北市雍立公司，飼料成分組成為 60%碳水化合物、24%蛋白質、13.5%脂肪、0.4%鈉及 1.1%鉀 (Laboratory Rodent Diet 5001, The Richmond’s Standard, PM Feed Inc., Louis, MI, USA ) 。 3.1 正常飼料：飼料成分組成為 58%碳水化合物、28%蛋白質、14%脂肪、
0.4% 鈉 及 1.1% 鉀 (Laboratory Rodent Diet 5001, The Richmond’s Standard, PM Feed Inc., Louis, MI, USA ) 。
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4.1.1 Bio-Rad Laoboratories (Richmond, VA, USA) Bio-Rad protein assay dye reagent
30% Acrylamide/ Bis Solution, 37.5：1 4.1.2 CALBIOCHEM
CHAPS
4.1.3 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)
Anti-Akt antibody 、 Anti-IR antibody 、 Anti-IRS-1 antibody 、 Anti-PI3-Kinase antibody
4.1.4 Epitomics – an Abcam Company (California, USA) Anti-GLUT3 antibody、Anti-JAK2 antibody 4.1.5 Gene Tex (Irvine, CA, USA)
Anti-actin antibody、Anti-Aldolase antibody、Anti-HXK antibody、
Anti-PKKL antibody 、 Rabbit IgG antibody (HRP) 、 Mouse IgG antibody (HRP)
4.1.6 J.T. Baker (Philipsburg, NJ, USA) Sodium dodecyl sulfate (SDS) 4.1.7 Merck KgaA (Darmstadt, Germany)
Tween-20、1,4-Dithiothreit (DTE) 4.1.8 Millipore (Billerica, MA, USA)
Anti-p-JAK2(tyr813) antibody、Anti-IDE antibody、ECL 4.1.9 Roche (Mannheim, Germany)
Complete Mini (Protease Inhibitor Cocktail Tablets) 、 PhosSTOP (Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets)
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4.1.10 Sigma (St. Louis, MO, USA)
Ammonium peroxidisulphate (APS) 、 sodium chloride (NaCl) 、 sodium hydroxide (NaOH)、sodium carbonate (NaHCO3)、sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)、sulfuric acid(H2SO4)、Caffeic acid、
Urea、Thiourea
4.1.11 台灣武田藥品工業股份有限公司 Pioglitazone (愛妥糖)
4.1.12 景明化工 Methanol 4.2 酵素套組
4.2.1 Insulin kit (Mercodia AB, Sweden)
4.2.2 Mouse and Rat Leptin Elisa kit (BioVendor, Karásek, Česká republika) 4.2.3 Adiponectin (ASSAYPRO, Missouri, USA)
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100µM；Glucose uptake 使用之樣品濃度為 12.5µM。
二、實驗藥品配製
1. Phosphate-Buffered Saline (PBS)
8 g NaCl / 1.15g Na2HPO4‧2H2O / 0.2 g KH2PO4 / 0.2 g KCl / 1 L ddH2O。
2. Kerbs-Ringer Biocarbonate buffer (KRB buffer)
6.9 g NaCl / 2.1 g NaHCO3 / 0.163 g KH2PO4 / 0.35 g KCl / 0.28 g CaCl2‧2H2O / 0.29 g MgSO4‧7H2O / 3.574 g HEPES / 1% Albulium / 1 L ddH2O 調 pH 至 7.3 。
3. Minimum Essential Medium Eagle Alpha medium
MEMα Medium / 10% FBS / 1.5g NaHCO3 / 1 L ddH2O 調 pH 至 7.3。
4. MTT reagent
2 mg MTT / 1 mL ddH2O。
5. Insulin reagent
1000nM insulin。
6. 2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose reagent (2-NBDG reagent)
200 µM 2-NBDG reagent。
三、小鼠神經母瘤細胞 Neuro 2a 之保存與培養
購入之 Neuro 2a 細胞大量培養後利用液態氮將細胞冷凍保存。冷凍細胞方式 是將 5 × 10細胞加入，並提 0.9 mL FBS 中，再加入 0.1 mL dimethyl sulfoxide (DMSO)，混合均勻後置入無菌冷凍小管中，標明細胞名稱、冷凍日期、代數。之 後以慢速降溫的方式，先將冷凍小管放入保麗龍盒中，至於 -80℃ 冷凍櫃中隔夜，