第二章 文獻回顧
第六節 第二型糖尿病與阿茲海默症
一、第二型糖尿病與阿茲海默症相關研究
已有許多研究指出，第二型糖尿病與阿茲海默症有許多相似的生理狀況，包 括老化、退化、高血膽固醇 (hypercholesterolemia)、代謝疾病以及一些第二傳信 者系統 (second messenger system) 表現異常，例如：glycogen synthase kinase 3 (GSK3) 過度表現及蛋白磷酸化不受到控制 (Doble & Woodgett, 2007; Ristow, 2004)。另外也與心血管疾病 (cardiovascular disease)有關 (Brands, Kessels, de Haan, Kappelle, & Biessels, 2004)、增加氧化壓力及發炎反應 (de la Monte &
Wands, 2006; Haan, 2006) 及 糖 化 終 產 物 (advanced glycation end products, AGEs)。
流行病學研究指出，第二型糖尿病會增加罹患阿茲海默症的風險 (Haan, 2006)，大約增加 2-5 倍的發生率。愈來愈多研究支持阿茲海默症和腦部葡萄糖 利用與能量製造的受損有關 (Frölich et al., 1998; S. Hoyer, 2002, 2004; Steen et al., 2005)。代謝的異常會導致腦部胰島素阻抗，使得調控神經細胞存活、能量製造、
基因表現及可塑性產生異常的現象。因此，探討兩者關聯機制是近年來探討的重 點。
二、連結阿茲海默症與第二型糖尿病的可能機制 (一) 類澱粉樣蛋白 (amylod peptide)
類澱粉樣蛋白 amyloid-β (Aβ) 的堆積會造成神經細胞退化 (Hölscher, 2005)，同樣地，第二型糖尿病期胰臟 β 細胞的流失一部份原因來自類澱粉 蛋白在胰島堆積 (Clark et al., 1988)，且研究發現 IAPP (islet amyloid polypeptide) 結構與 AβPP (Amyloid-β Protein Precursor) 的結構高 90% 相
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似 (J Janson et al., 1996)。 Aβ 為類澱粉蛋白前驅物 (amyloid precursor protein, APP) 裂解產物，裂解有兩個路徑，第一個路徑由 α-secretase 作用，
製造具有神經保護功能的可溶性 APPα 片段，此路徑並不會產生 Aβ。Aβ 由另一路徑產生，APP 先由 β-secretase 分解再由 γ-secretase 作用分解成 Aβ(40-42)，產生的 Aβ 會堆積形成斑塊 (plaques) (Hölscher, 2005)，進而影 響神經細胞突觸功能及誘發細胞死亡 (Small, Mok, & Bornstein, 2001;
Walsh & Selkoe, 2004)。
(二) 神經纖維糾結 (neurofibrillary tangles, NFTs) 及過度磷酸化的 tau 蛋白 過度磷酸化的 tau 堆積以後會形成 NFTs，第二型糖尿病與阿茲海默症 的磷酸化與 GSK-3 的活化有關，其中 GSK-3β 是形成 NFTs 的關鍵步驟。
胰島素的缺乏及胰島素阻抗會過度活化 GSK3β 及抑制磷酸酶，進而導致 tau 蛋白過度磷酸化。氧化壓力的增加使得 ROS 產生導致 tau 蛋白錯誤摺疊。
錯誤折疊的 tau 蛋白堆積並形成不可溶的神經纖維糾結 (neurofibrillary tangles, NFTs)，導致神經傳遞的中斷 (de la Monte, 2012)。
(三) 胰島素
愈來愈多研究顯示，胰島素訊息傳遞受損與阿茲海默症的認知能力受 損有關 (de la Monte & Wands, 2005; Gasparini & Xu, 2003; Watson & Craft, 2004)，在阿茲海默症中，因胰島素受器敏感性改變使得腦部胰島素阻抗。
胰島素可調控食物攝取與體重，由分布在下視丘的胰島素受器掌管；並影 響神經傳遞物質的釋放與再吸收，同時也改善學習與記憶能力，由分布在 海馬迴及皮質上的胰島素受器管控 (Biessels, Bravenboer, & Gispen, 2004;
Gispen & Biessels, 2000)。在第二型糖尿病病人，胰島素的缺乏及胰島素訊
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息傳遞的受損會導致老化有關的神經細胞退化及認知能力受損 (Zhao, Chen, Quon, & Alkon, 2004)。
從阿茲海默症病患的腦部可以發現，IR 表現下降、腦部胰島素與 IR 密度隨著年齡減少 (Frölich et al., 1998; Steen et al., 2005)，這種腦部胰島素 訊息傳遞受損被稱為「第三型糖尿病」(Type 3 Diabetes) (Lester-Coll et al., 2006)，稱阿茲海默症為「腦部胰島素阻抗狀態」(inuslin-resistant brain state) (S. Hoyer, 1998)。Watson and Craft (2004) 將胰島素與葡萄糖對阿茲海默症 病患記憶的影響整理如下：
1. 阿茲海默症通常與葡萄糖調節失控有關，他們的血液中葡萄糖與胰島素 濃度會上升。
2. 阿茲海默症會惡化原先就存在的胰島素異常。
3. 阿茲海默症病患其禁食胰島素濃度上升，且/或降低腦脊髓液胰島素濃 度，且/或降低腦脊髓液與血液中的胰島素濃度比值。
4. 急性注射葡萄糖可改善阿茲海默症病人與老年人之記憶能力。
(四) 糖化終產物
糖化終產物為非酵素性葡萄糖與蛋白質縮合反應及脂質與核酸暴露於 還原糖的衍生物 (S.-i. Yamagishi et al., 2002)，正常老化、糖尿病都會造成 糖化終產物在不同組織的形成與堆積 (Takeuchi & Yamagishi, 2004a, 2004b;
S. Yamagishi, Takeuchi, Inagaki, Nakamura, & Imaizumi, 2003)。高血糖及阿茲 海默症病人都可以發現糖化終產物加速形成，且造成 Aβ 增加累積及糖化 tau 蛋白加速過磷酸化的 tau 蛋白轉變為神經纖維糾結 (Ledesma, Bonay, Colaço, & Avila, 1994)。
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總結來說，胰島素阻抗所造成的胰島素受器不敏感對於神經細胞代謝及阿茲 海默症的關聯整理如下 (圖 2-9)：
1. 胰島素生長因子活性對於維持正常功能的基因轉譯蛋白受到影響，減少 細胞生長及再生。這些蛋白同時減少胰島素降解酵素 (insulin degrading enzyme, IDE) 的合成，胰島素降解蛋白除了分解胰島素外，也會分解 Aβ。
2. 突觸訊息傳遞及長期增益效果 (Long-term potentiation, LTP) 的形成能 力受損，進而影響記憶及訊息處理。
3. 組織中葡萄糖濃度上升會增加糖化終產物的形成。
4. 抑制胰島素訊息傳遞路徑，造成無法抑制細胞凋亡。同時也造成 GSK-3β 活性增加，使 tau 蛋白過度磷酸化而形成神經纖維糾結。
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三、高脂飲食及糖尿病對於阿茲海默症的影響
愈來愈多證據顯示，肥胖引起的胰島素阻抗、第二型糖尿病、代謝症候群及 非酒精性脂肪肝會影響腦部胰島素阻抗，進而造成老年輕微認知受損、失智症或 阿茲海默症 (de la Monte & Wands, 2005; S. Hoyer, 2002, 2004; Schubert et al., 2004) (圖 2-10)，但並非大部分阿茲海默症病人都有這些疾病，在阿茲海默症病 患腦部發現第二型糖尿病病患其腦部神經纖維糾結及斑塊情形與正常老化控制 組相同 (Juliette Janson et al., 2004)。Winocur and Greenwood (2005) 從動物實驗 發現高脂飲食造成的肥胖會導致認知能力受損、輕微腦萎縮、腦部胰島素阻抗、
神經 細胞發炎、氧化壓力等 (Lyn-Cook et al., 2009)，但並不會造成顯著的阿茲 海默症。這些研究指出第二型糖尿病、胰島素阻抗與神經細胞退化的進程為共同 因子，治療這些疾病可以減緩阿茲海默症惡化，但無法預防 (de la Monte, 2012)。
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第三章 第三章 第三章
第三章 研究動機與目的及實驗架構 研究動機與目的及實驗架構 研究動機與目的及實驗架構 研究動機與目的及實驗架構
第一節 第一節 第一節
第一節 研究動機與目的研究動機與目的研究動機與目的研究動機與目的
胰島素阻抗為第二型糖尿病病患之主要發病原因，且血糖中葡萄糖無法有效 被利用，身體長期處於高血糖、高胰島素狀態，導致體內氧化壓力增加，使身體 產生慢性發炎反應。周圍組織胰島素阻抗也會造成腦部胰島素阻抗，影響腦部能 量恆定，進而會影響神經細胞退化。
天然酚酸廣泛存於植物性食物中，本實驗室先前已證實 Gallic acid、Caffeic acid、Cinnamic acid 三種天然酚酸可以減輕以腫瘤壞死因子 (TNF-α) 處理之小鼠 肝臟細胞 (FL83B) 胰島素阻抗及改善醣類代謝。
細胞與人體之間的差異，相差甚大，故本研究之目的分為兩部分：先建立胰 島素阻抗神經細模式胞篩選出具有保護腦部胰島素阻抗能力較好之天然酚酸；再 探討此酚酸對高脂飼料誘導之高胰島素血大鼠之醣類代謝、胰島素訊息傳遞路徑 的影響進行探討。實驗架構圖如下：
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第二節 第二節 第二節
第二節 實驗架構實驗架構實驗架構實驗架構
Biochemical analysis of blood:
Fasten glucose OGTT
Behavioral tasks:
Passive avoidance task Phenolic acids
High insulin induced insulin-resistant Neuro 2a mouse neuroblastoma
Glucose uptake test
Insulin signal transduction：：：： -western blotting Carbohydrate mechanism：：：：
-western blotting Hexokinase
Phosphofructokinase Aldolase
Sprague-Dawley Rat
High fat diet co-adminstered with phenolic acid
Brain tissue: cortex, hippocampus
圖 3-1、實驗架構。
Figure 3-1. Experimental framework Leptin signal transduction：：： ：
-western blotting Leptin receptor Janus kinase 2
p-Janus kinase 2 (tyr813) screening
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第四章 第四章 第四章
第四章 實驗材料與方法 實驗材料與方法 實驗材料與方法 實驗材料與方法
第一節第一節第一節
第一節 實驗材料實驗材料實驗材料 實驗材料
一、胰島素阻抗細胞模式 1. 樣品來源
Caffeic acid、Cinnamic acid、Ferulic acid、para-coumaric acid、Chlorogenic acid、Gallic acid、Protocatechuic acid、Syringic acid、Vanillic acid 、Rosmarinic acid、Sinapic acid 純品購自 Sigma (St. Louis, USA)。
2. 實驗細胞
解凍之小鼠腦部神經母瘤細胞 (Neuro 2a) 細胞二至三天進行一次繼代培 養。去除舊的培養基，以 PBS 容易清洗細胞，再以胰蛋白酶 (Trypsin) 處理，
吸除後加入培養液 (MEMα + 10%FBS)，打散並懸浮細胞後，將細胞懸浮液吸 至 15mL 無菌離心管中，以 200 g、5 min 之條件離心。倒除上清液再重新以培 養液均勻懸浮細胞，計數細胞並將細胞數調整至 5 × 10 cells/mL。取 1mL 懸浮液至 10 cm (10 cm dish) 培養瓶中，置於 37℃，5% CO2之培養箱內。待 確定 Neuro 2a 細胞長至七分滿後，進行細胞實驗。
3. 實驗藥品及試劑
3.1 Sigma (St. Louis, USA)：
Bovine serum albumin (BSA) 、 Insulin 、 NaOH 、 HCl 、 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl-tetrazolium bromide (MTT reagent)、
Dimethyl sulfoxide (DMSO)、Disodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)、
Potassium chloride (KCl)、Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)、Sodium chloride (NaCl)、Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)
3.2 Gibco BRL (NY, USA)：
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Fetal bovine serum (FBS)、Minimum Essential Medium Eagle Alpha (MEMα) medium
3.3 JRS (Lenexa, KS, USA):
Trypsin
3.4 Invitrogen（Eugene, Oregon, USA）:
2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG)
二、胰島素阻抗動物模式 1. 實驗樣品來源
選用經細胞實驗篩選後，認為較具減緩細胞胰島素阻抗，而改善葡萄糖 攝入能力之酚酸試藥級藥品-咖啡酸 Caffeic acid (購自 Sigma) 進行動物實驗 以複驗細胞試驗之結果。
2. 實驗動物
雄性 Sprague-Dawley 大鼠，購自樂斯科生物科技股份有限公司，購入週 齡為 8 週，約為 200~250 公克。飼養於台大食科所五樓動物房中。馴養時間 為三週，馴養期間供應充分飲水及正常實驗用錠狀飼料 (Laboratory Rodent Diet)，並維持室溫於 25±2℃、相對溼度 40~60%、光照週期 (light-dark cycle) 維持在 12 小時光照，12 小時黑暗的狀態。及動物房中 12 小時光照、12 小時 黑暗。
3. 實驗動物飼料
大鼠飼料 (Rodent Chow diet) 購自台北市雍立公司，飼料成分組成為 60%碳水化合物、24%蛋白質、13.5%脂肪、0.4%鈉及 1.1%鉀 (Laboratory Rodent Diet 5001, The Richmond’s Standard, PM Feed Inc., Louis, MI, USA ) 。 3.1 正常飼料：飼料成分組成為 58%碳水化合物、28%蛋白質、14%脂肪、
0.4% 鈉 及 1.1% 鉀 (Laboratory Rodent Diet 5001, The Richmond’s Standard, PM Feed Inc., Louis, MI, USA ) 。
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4.1.1 Bio-Rad Laoboratories (Richmond, VA, USA) Bio-Rad protein assay dye reagent
30% Acrylamide/ Bis Solution, 37.5：1 4.1.2 CALBIOCHEM
CHAPS
4.1.3 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)
Anti-Akt antibody 、 Anti-IR antibody 、 Anti-IRS-1 antibody 、 Anti-PI3-Kinase antibody
4.1.4 Epitomics – an Abcam Company (California, USA) Anti-GLUT3 antibody、Anti-JAK2 antibody 4.1.5 Gene Tex (Irvine, CA, USA)
Anti-actin antibody、Anti-Aldolase antibody、Anti-HXK antibody、
Anti-PKKL antibody 、 Rabbit IgG antibody (HRP) 、 Mouse IgG antibody (HRP)
4.1.6 J.T. Baker (Philipsburg, NJ, USA) Sodium dodecyl sulfate (SDS) 4.1.7 Merck KgaA (Darmstadt, Germany)
Tween-20、1,4-Dithiothreit (DTE) 4.1.8 Millipore (Billerica, MA, USA)
Anti-p-JAK2(tyr813) antibody、Anti-IDE antibody、ECL 4.1.9 Roche (Mannheim, Germany)
Complete Mini (Protease Inhibitor Cocktail Tablets) 、 PhosSTOP (Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets)
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4.1.10 Sigma (St. Louis, MO, USA)
Ammonium peroxidisulphate (APS) 、 sodium chloride (NaCl) 、 sodium hydroxide (NaOH)、sodium carbonate (NaHCO3)、sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)、sulfuric acid(H2SO4)、Caffeic acid、
Urea、Thiourea
4.1.11 台灣武田藥品工業股份有限公司 Pioglitazone (愛妥糖)
4.1.12 景明化工 Methanol 4.2 酵素套組
4.2.1 Insulin kit (Mercodia AB, Sweden)
4.2.2 Mouse and Rat Leptin Elisa kit (BioVendor, Karásek, Česká republika) 4.2.3 Adiponectin (ASSAYPRO, Missouri, USA)
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100µM；Glucose uptake 使用之樣品濃度為 12.5µM。
二、實驗藥品配製
1. Phosphate-Buffered Saline (PBS)
8 g NaCl / 1.15g Na2HPO4‧2H2O / 0.2 g KH2PO4 / 0.2 g KCl / 1 L ddH2O。
2. Kerbs-Ringer Biocarbonate buffer (KRB buffer)
6.9 g NaCl / 2.1 g NaHCO3 / 0.163 g KH2PO4 / 0.35 g KCl / 0.28 g CaCl2‧2H2O / 0.29 g MgSO4‧7H2O / 3.574 g HEPES / 1% Albulium / 1 L ddH2O 調 pH 至 7.3 。
3. Minimum Essential Medium Eagle Alpha medium
MEMα Medium / 10% FBS / 1.5g NaHCO3 / 1 L ddH2O 調 pH 至 7.3。
4. MTT reagent
2 mg MTT / 1 mL ddH2O。
5. Insulin reagent
1000nM insulin。
6. 2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose reagent (2-NBDG reagent)
200 µM 2-NBDG reagent。
三、小鼠神經母瘤細胞 Neuro 2a 之保存與培養
購入之 Neuro 2a 細胞大量培養後利用液態氮將細胞冷凍保存。冷凍細胞方式 是將 5 × 10細胞加入，並提 0.9 mL FBS 中，再加入 0.1 mL dimethyl sulfoxide (DMSO)，混合均勻後置入無菌冷凍小管中，標明細胞名稱、冷凍日期、代數。之 後以慢速降溫的方式，先將冷凍小管放入保麗龍盒中，至於 -80℃ 冷凍櫃中隔夜，