第六章 第六章
第六章 討論 討論 討論 討論
第一節第一節
第一節第一節 不同天然酚酸對不同天然酚酸對不同天然酚酸對不同天然酚酸對 Neuro 2a 細胞存活率細胞存活率細胞存活率、細胞存活率、、葡萄糖攝入之影響、葡萄糖攝入之影響葡萄糖攝入之影響 葡萄糖攝入之影響
一 一 一
一、、、、不同濃度天然酚酸對不同濃度天然酚酸對不同濃度天然酚酸對不同濃度天然酚酸對 Neuro 2a 細胞生長存活率的影響細胞生長存活率的影響細胞生長存活率的影響 細胞生長存活率的影響
細胞存活率試驗 (MTT assay) 是利用比色法來監測細胞增殖或生長的情形，
常被用於判定藥物或其他化學物質對細胞的生長抑制、毒殺效果等(Sargent, 2003)。酚酸為酚類化合物的一種，廣佈於蔬菜、水果中 (Bahorun et al., 2004;
Luximon-Ramma et al., 2003)，具有良好的抗氧化、抗癌、降血糖的功效 (C.-y.
Chao et al., 2010; Jung et al., 2006; Kampa et al., 2004; Scalbert, Manach, et al., 2005)，且已被證實可以通過腦血屏障 (Willis et al., 2009)，但濃度過高時可能會 造成細胞毒性；因此，本實驗先評估各種天然酚酸濃度對小鼠腦部神經母瘤細胞 存活率的影響。取濃度 12.5 µM、25 µM、50 µM、100 µM 之天然酚酸直接添加 於已培養 24 小時之 Neuro 2a 細胞培養液中，於 37℃，5% CO2環境下共培養 24 小時，利用 MTT 法測得其吸光值，再依生長抑制公式求得細胞存活率 (Cell viability)。
由表 5-1 之天然酚酸對 Neuro 2a 細胞存活率之測試結果可了解天然酚酸對 神經細胞之安全性，神經細胞對藥物刺激較為敏感，在 100 µM 濃度下肉桂酸、
阿魏酸、香豆酸、氯原酸、沒食子酸、原兒茶酸、迷迭香酸 Rosmarinic acid 均具 有生長抑制的情形產生，且在 12.5 µM 濃度下，香豆酸、氯原酸存活率即僅剩下 80%。將此結果做為下一步驟細胞試驗毒性劑量之參考，確定細胞於正常生長狀 態下，其生長反應不受樣品影響或阻礙而影響葡萄糖攝入試驗結果。
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二二
二二、、、、Neuro 2a 細胞對細胞對細胞對細胞對 2-NBDG 染劑攝入之結果染劑攝入之結果染劑攝入之結果染劑攝入之結果
由前述結果，本研究選用天然酚酸濃度為 12.5 µM，剔除在此較低濃度即對 生長具有抑制效果的香豆酸、氯原酸，進一步進行以高濃度胰島素誘導之胰島素 阻抗細胞模式及葡萄糖攝入實驗，以了解天然酚酸改善神經細胞胰島素阻抗之效 果。胰島素阻抗被認為是糖尿病發展過程中重要的因素，於糖尿病初期，細胞對 於胰島素刺激的葡萄糖攝入產生拮抗，使得血中葡萄糖濃度失衡，為了讓此濃度 再度維持恆定，胰臟 β 細胞製造更多的胰島素使血液中達到一種慢性高胰島素血 (hyperinsulinemia)的狀況；當高胰島素血也無法維持血糖恆定時，就會變成高血 糖 (Reaven, 1988)。
為模擬體內高胰島素血症的狀況，有研究使用胰島素誘導 mHypoE-46 細胞 及 Neuro 2a 細胞 (Mayer & Belsham, 2010; Van Der Heide, Hoekman, Biessels, &
Gispen, 2004)，發現 100 nM 胰島素誘導 24 小時可誘發細胞胰島素阻抗。神經細 胞以胰島素誘導成胰島素阻抗，會造成其胰島素訊息傳遞路徑受到影響而使得葡 萄糖攝入能力降低 (Gupta et al., 2011)。
2-NBDG (2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose) 屬 分子探針之一種，為葡萄糖經修飾後具螢光特性之葡萄糖衍生物 (D-glucose fluorescent derivative)，早期有學者將此探針運用於酵母菌及大腸桿菌細胞存活率 之分析(Yoshioka et al., 1996)，近年來有學者利用此染劑取代細胞葡萄糖攝入試驗 時使用之輻射染劑 (2-DG)來進行糖尿病相關之研究 (Zierath et al., 1998)。本研 究參考 Gupta et al., 2011 之方法誘導神經細胞胰島素阻抗，再進行細胞葡萄糖攝 入試驗，以細胞攝入之螢光含量評估 Neuro 2a 細胞之葡萄糖 (2-NBDG) 攝入能 力 (Chang & Shen, 2013)，以篩選出最具改善胰島素阻抗潛力之酚酸樣品進行後 續動物實驗。
根據實驗結果 (表 5-2)，沒食子酸與咖啡酸都有顯著改善葡萄糖攝入的效果。
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咖啡酸對葡萄糖攝入的改善效果，與實驗室以腫瘤壞死因子誘導 (tumor necrosis factor alpha, TNFα) 胰島素阻抗 FL83B 細胞，施予 12.5 µM 咖啡酸具有顯著改善 葡萄糖攝入的能力 (Huang et al., 2009)有相似結果。另外，也有研究指出，咖啡 酸具有抗糖化、抗發炎的效果 (C.-y. Chao et al., 2010)及透過調節神經傳遞物質 乙醯膽鹼酶 (acetylcholinesterase, AChE)改善記憶能力(Anwar et al., 2012)。沒食 子酸於 STZ 誘導第二型糖尿病大鼠之動物模式中，可有效增進細胞葡萄糖之利 用並且抑制肝臟之糖質新生作用而減少葡萄糖之產生 (Punithavathi, Prince, Kumar, & Selvakumari, 2011)。但與咖啡酸相較，沒食子酸對 Neuro 2a 細胞生存 抑制情形較強，故本研究選擇咖啡酸做為進行後續動物實驗之樣品。
107 知表現受損的現象 (Greenwood & Winocur, 2005; Kalmijn et al., 2004)。高脂飲食 會造成肥胖使得脂肪激素的釋放產生異常 (Hotamisligil, Shargill, & Spiegelman, 1993)而活化促發炎的訊息傳遞 (Xu et al., 2003)，因此成為許多疾病的風險因 子。
高脂飼料的誘導造成體重增加顯著高於正常飼料組 (圖 5-3)，主要因素之一 為一日平均熱量攝取顯著較高。除此之外，高脂飲食會誘發人類、齧齒類動物的 肥胖，且脂肪佔飲食熱量比例愈高體重增加速度愈快 (Buettner et al., 2007;
Rothwell & Stock, 1984; Warwick & Schiffman, 1992)。另外有研究指出，高脂飲食 造成體內血中三酸甘油酯及游離脂肪酸含量上升，進而導致脂肪組織生成增加，
使高脂飼料餵食大鼠的體重明顯上升 (Jensen, Haymond, Rizza, Cryer, & Miles, 1989)。
肥胖之起因為能量攝取大於能量消耗，使體脂肪變多，包括脂肪細胞變大 (hypertrophy)或脂肪細胞增多 (hyperplasia)的現象 (Avram, Avram, & James, 2005;
de Ferranti & Mozaffarian, 2008; Jéquier, 2002)。研究發現，脂肪細胞增大以後會 促進腫瘤壞死因子及類胰島素生長因子 (insulin-like growth factor, IGF)分泌，刺
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激脂肪細胞數量增加 (Sorisky, 1999)。從本實驗可發現 (表 5-4)，高脂飼料誘導 30 週之大鼠，其副腎脂、副睪脂重量皆有顯著增加的情況，且脂肪含量佔體重 百分比也都有顯著上升的情況。
Pioglitazone 是 thiazolidinedione (TZD)類的抗糖尿病藥物，能降低周邊組織 及肝臟胰島素阻抗以增加葡萄萄糖的攝入 (Hallakou et al., 1997)，透過 PPARγ (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma)增加脂肪堆積 (L. Chao et al., 2000)，使得高脂飼料誘導同時管餵 Pioglitazone 藥物的正控制組 (HF+Pio)體重 增加更為快速，推測可能為因改善胰島素阻抗，葡萄糖能有效進入細胞中提供能 量，減少組織脂肪分解作用，使得體重上升較 HF 組更多，而腹部脂肪部分與高 脂組比較有降低的趨勢但無顯著差異。
高脂飼料誘導同時每日管餵咖啡酸之大鼠其體重與 HF 組並無差異，但其脂 肪組織則有顯著降低的情況，脂肪佔體重之百分比也較低，推測咖啡酸並非藉由 PPARγ 路 徑 ， 而 是 從 胰 島 素 訊 息 傳 遞 透 過 5' 單 磷 酸 腺 苷 活 化 蛋 白 激 酶 (AMP-activated protein kinase, AMPK) 增加脂肪代謝，使內臟脂肪累積較少。
Tsuda et al. (2012)指出，咖啡酸可活化 AMPK，並磷酸化下游乙醯輔酶 A 羧化酶 (acetyl CoA carboxylase, ACC)影響而去活化。不活化之 ACC 會減少 malonyl-CoA，
導致進入粒線體之脂肪增加，使脂肪氧化作用上升，減少脂肪累積。本研究結果 顯示，雖內臟脂肪含量有明顯減少的情況，但攝取咖啡酸 30 週後對大鼠體重與 HF 組並無顯著影響，此部分仍須深入探討。
109 sensitivity) 下降或胰島素接受器 (insulin receptor) 異常而導致血糖異常上升。已 有 許 多 研 究 報 告 指 出 以 高 脂 飲 食 餵 食 大 鼠 會 發 生 高 胰 島 素 血 症 (hyperinsulinemia)及胰島素阻抗 (insulin resistance) (Longato, Tong, Wands, & de la Monte, 2012; McNeilly, Williamson, Sutherland, Balfour, & Stewart, 2011)。本實 驗以熱量含 60% 高脂飼料誘導大鼠，餵食 30 週後，觀察到大鼠有高胰島素血 症但並未有高空腹血糖的現象 (圖 5-5、圖 5-8 )，實驗期間禁食血糖平均為 90~110 mg/dL，許多使用高脂飲食誘導之動物模式研究，也顯示高脂飼料誘導 15 周或 20 周其血糖並未有明顯上升的情況 (Jeon et al., 2012; Pintana, Apaijai, Pratchayasakul, Chattipakorn, & Chattipakorn, 2012)。
HOMA-IR Index 由 Matthews et al. (1985)等人提出，用以表示胰島素阻抗情
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index ( 圖 5-9) 。 由 圖 5-9 可 以 觀 察 到 以 高 脂 飼 料 誘 導 之 糖 尿 病 大 鼠 ， 其 HOMA-IR index 明顯較正常組與實驗組高，表示大鼠胰島素阻抗較為嚴重，此 結果與許多研究報告觀察到以高脂飼料餵食大鼠，會產生高胰島素血症與胰島素 阻抗結果相符 (de Ferranti & Mozaffarian, 2008; Lichtenstein & Schwab, 2000;
Longato et al., 2012; McNeilly et al., 2011)，即高脂飲食會造成葡萄糖耐受性受損 及胰島素對葡萄糖降低的能力下降 (Riccardi et al., 2004)。
口服葡萄糖耐量試驗 ( Oral glucose tolerance test，OGTT) 為臨床一糖尿病 診斷工具，在人類使用上，是使其口服葡萄糖 75 g 後測其於 0、30、60、90、
120 等時間點內血糖變化，觀察其對葡糖耐受的程度。未患糖尿病之健康人在口 服葡萄糖前，血糖約 100 mg/dL，口服葡萄糖後 2 小時會小於 140 mg/dL，約 3 小時即可恢復為正常值。糖尿病病患其血糖值會上升很快且血糖持續處於巔峰，
不易恢復。從高脂飼料誘導大鼠也可發現血糖上升很快，且其血糖顛峰時間會持 續到 60 分鐘才開始下降 (圖 5-6)。
計算口服葡萄糖耐受性試驗曲線下面積後，可以明顯看出高脂飼料誘導大鼠 其葡萄糖耐受程度。許多以高脂飼料誘導高胰島素血症大鼠之研究也指出此動物 模式會造成胰島素阻抗，而導致葡萄糖耐受性不良，口服葡萄糖耐受性試驗曲線 下面積增加，其結果與其他高脂飼料誘導動物模式有相似結果 (Jeon et al., 2012;
McNeilly, Williamson, Balfour, Stewart, & Sutherland, 2012; Pipatpiboon, Pintana, Pratchayasakul, Chattipakorn, & Chattipakorn, 2013; Pratchayasakul et al., 2011)。
根據研究指出，咖啡酸可藉由增進 IR、PI3K、GLUT2 及非胰島素依賴之葡 萄糖運送蛋白的蛋白表現而改善小鼠肝臟細胞 FL83B、小鼠或小鼠肌肉細胞的葡 萄涉入情況，使葡萄糖耐受程度上升 (Farrell, Ellam, Forrelli, & Williamson, 2013;
Huang et al., 2009; Tsuda et al., 2012)。從本實驗也可發現，長期高脂飲食病同時 餵食咖啡酸的組別，其血糖波動較為平緩、胰島素阻抗程度較低使其葡萄糖耐受
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度較高，可避免組織處於高氧化壓力的情況。
三 三 三
三、、、、咖啡酸對高脂飼料誘導胰島素阻抗大鼠血液生化數值之影響咖啡酸對高脂飼料誘導胰島素阻抗大鼠血液生化數值之影響咖啡酸對高脂飼料誘導胰島素阻抗大鼠血液生化數值之影響咖啡酸對高脂飼料誘導胰島素阻抗大鼠血液生化數值之影響
Jensen et al. (1989)指出，高脂飲食會造成血液中三酸甘油酯及游離脂肪酸含
Jensen et al. (1989)指出，高脂飲食會造成血液中三酸甘油酯及游離脂肪酸含