第五章、 結論
第四節、 ox-LDL 對平滑肌細胞凋亡之影響
凋亡（Apoptosis）是一個維持體內環境平衡，及個體生長發 育的一個重要因素[57]。當細胞要進行 Apoptosis 時，會有以下四個 重要外在特徵：1.細胞皺縮（cell membrane shrinkage）；2.染色質濃 縮（chromosome condensation）聚集在核膜；3.（DNA fragementaion）；
4.凋亡小體（apoptotic bodies）的形成。
細胞的這些改變主要是透過一連串的訊息傳遞和活化 caspase 調控 pro- and anti-apoptosis protein 。例如 Bcl-2 家族成員經由一連 串的正向、負向調控後決定凋亡程式啟動與否。Apoptosis 可經由外 在途徑及內再途徑所引發，外在途徑如死亡接受器(death receptor)，
如；TNFR、Fas、Decoy receptor 和 death receptor[58, 59]。這些 receptor 不管細胞外、 ligand 結合區域和細胞內死亡區域(cytoplasmic death domain) 都富有 cystein，當 ligand 結合上這些接受器(receptor)及死亡 區 域 (death domain)後 會 和 adaptor protein 相 互 作 用 進 而 活 化 caspase。內在途徑凋亡程式啟動則可藉由 Bcl-2 protein 家族成員對 於 apoptosis 的調控或經由 DNA 損傷或基因調控粒腺體釋放出 cytochrome C 進而活化 caspase [60, 61]。
Caspase 家族基因與細胞凋亡程式的進行具有相當大的關係 [62]。不管是內在或外在途徑，最後都會活化 Caspase 進而產生細胞 凋亡。Caspase (aspartate-specific cystein protease) 在 apoptosis 一連串 的過程中扮演起始及終結者之角色 [63]。所謂 caspase 起始者，是 caspase 家族成員中的 caspase 2、8、9、10，所扮演的角色，是將下 游的 caspase 轉為活化型，並具有蛋白質分解之能力的 caspase 3、6、
7 刺激 apoptosis 進行[62]。 其中 Caspase 3 在細胞進行 apoptosis 的過 程中是相當重要的，它扮演了細胞死亡過程中的劊子手。caspase 3 是 cysteine proteases family 中重要的一員，它將細胞中的許多蛋白質在 特定的 amino acid 上切一刀，使蛋白質被水解並失去功能。在過去的 研究中顯示，當兩個 caspase 3 被拉近以形成 dimer 時，caspase 3 將
會自行活化，並將使細胞進行不可逆轉的 apoptosis，而導致細胞的死 亡[28]。
活 化 死 亡 接 受 器 ， 如 :TNFR 可 進 一 步 活 化 JNK MAPK pahtway，JNK MAPK pathway 是 MAPK 訊息傳遞路徑的其中一條，
與細胞分化及凋亡較為相關，當接受死亡接受器所傳送的訊息可以經 由調控基因或磷酸化方式進而調控 pro-apoptosis[63]。
許多證據指出，平滑肌細胞的凋亡參與粥狀動脈硬化的致病過程 而其中包括許多因素，除了 ox-LDL 外也有訊息傳遞 MAPK pathway 的參與，如：氧化低密度脂蛋白上的 Lysophosphatidylcholine 會經由 scavenger receptors 活化 p38 MAPK 而增加 monocytes CXCR2 表 現，導致人類內皮細胞的凋亡[64]。在冠狀動脈平滑肌細胞活性氧衍 生系統（Reactive oxygen-generating system）活化 Nuclear factor-?B
（NF-?B）和釋放 Tumor Necrosis Factor-a（TNF-a）[65]。脂質產生 過氧化產生的 2,4-decadiena 也會對平滑肌細胞導致細胞毒性[21]。
Hsieh, et al. 2001 活性氧（ROS）則可藉由活化 caspase 進而導致平 滑肌細胞凋亡[22]。而這些結果顯示，粥狀動脈硬化過程中，血管平 滑肌細胞功能改變對於疾病嚴重度的之影響有極大關聯。
第 五 節 、 Ellagic acid 的 作 用 機 制
近幾年來，發現許多存在於自然界的多酚類化合物（ polyphenolic compounds）具有多項功能，其中包括抗氧化（ antioxidants）[31, 32]、
抗突變（antimutagens）、抗致癌物（anticarcinogens）及化學保護作用
（chemoprevention ）[33, 34]，而 Ellagic acid 就是其中一種重要的多 酚類化合物。其化學結構如下：
2,3,7,8-Tetrahydroxy(1)benzopyrano(5,4,3-cde)benzopyran-5,10-dio ne
Ellagic acid 主要存在於自然界中的蔬菜、水果，尤其以草莓、藍 莓及堅果類含量最為豐富。文獻指出 Ellagic acid 抗癌方式是經由活 化 P53 及其下游 P21 進而達到抑制癌細胞的細胞週期，進而使癌細胞 凋亡，達到抑制癌細胞增生之效果[35]。許多研究證明，Ellagic acid 具 有抗致癌物的活化之功能[36]。Ellagic acid 在化學保護作用
（chemoprevention）方面：根據 2001 Laura A. 研究報告指出在使用 NBBA 誘發 F344 rat 食道癌症形成，可藉由口服乾燥的黑莓，降低食 道腫瘤形成具有化學保護作用[33]。在抗氧化方面，Ellagic acid 可降 低小鼠肝臟、肺臟的 glutathione 和 glutathione reductase ，降低 NADH
- and ascorbate-dependent 脂質過氧化(lipid peroxidation)[37]，Hassoun 等學者指出，Ellagic acid（6mg/kg per day）可調控抑制氧化劑 TCDD 引起胚胎及胎盤組織的毒素、氧化傷害（Toxicology）[38]，另外 Ellagic acid 也可以明顯的抑制 H2O2及 Bleomycin 所引起的 DNA 傷害[39]。
研 究 目 的
本實驗是以體外實驗（in vitro）為主軸的研究，以模擬粥狀動脈 硬化，進行中ox-LDL刺激平滑肌細胞凋亡的實驗。在這個研究中，
我們使用了一種自然界蔬果中含有的多酚類化合物 Ellagic acid， 並 研究此多酚類化合物在以ox-LDL造成的平滑肌細胞凋亡的過程中所 扮演的角色。
1、Ellagic acid 在以往的研究多以預防和治療癌症及抗氧化方面為 主，然而卻少有關於粥狀動脈硬化方面的研究報告，因此我們針對平 滑肌細胞凋亡與Ellagic acid之間關聯進行研究。
2、探討Ellagic acid 如何抑制血管細胞凋亡情形的發生？
第七章、材料與方法
第 一 節 、 實 驗 材 料 A 儀 器
無菌操作臺 (造鑫,Taiwan) 細胞培養箱 (Nuaire, USA)
細胞計數器 (Haemocytometer; Boeco, Germany) 光學顯微鏡 (Motic, Japan)
離心機 (Beckman)
酸鹼值測定計 (C831; Consort, UK) 乾浴槽 (Model 110001; 購自Boekel) 微量天平 (GR-200; A&D, Japan) 去離子水製造機 (Minipore, USA) 超高速離心機（himac CS 120GX）
Shaker bath (BT-350; 購自YIH DER, Taiwan) Power supply ( Hoefer,San Francisco, CA, U.S.A)
Gel Electrophoresis Apparatus ( Gibco BRL, Grand Island, N.Y.,U.S.A) ELISA reader（ANTHOS-2020,Salzbrug,Austria）
Vortex-genie 2 (SCIENTIFIC INDUSTRIES,NY,USA) 水浴槽 Water bath (TKS,Taipei,Taiwan )
流式細胞儀（FACSCalibur,BD,USA）
聚合? 連鎖反應器 (Bio-Rad,USA)
影像分析儀器（AlphaImagerTM 2200,USA）
B 材 料
細胞培養皿 (騰達行,Taiwan) 細胞培養盤 (騰達行,Taiwan) 蓋玻片 (Kimble, USA)
載玻片 (Marriefeld, Germany) 冷凍管 (騰達行,Taiwan) 微量離心管 (季勗, Taiwan) 離心管 (季勗, Taiwan) Falcon (汎泰,Taiwan)
Paraffin (購自 American national can) 透析膜 （Amersham,UK）
PD 10 （Amersham,UK）
C 試 劑
Agarose (Gibco BRL,Grand Island,N.Y.,U.S.A.)
Bradford reagent (BIO-RAD, Hercules,California,USA)
BSA（Bovine serum albumin）（SIGMA, ST.Louis,MO,USA）
Bromophenol blue (USB)
DMSO (Dimethyl Sulfoxide; Sigma, USA)
DTT (1,4-Dithio-D,L-threitol; GERBU, Germany)
DMEM (Dulbeccco’s Modified Eagle’s Medium; GIBCO, USA) Ellagic acid (Sigma, USA)
Ethanol (景明化工,Taiwan ) Ethidium bromide (Sigma, USA)
FBS (Fetal Bovine serum; GIBCO, USA) Glycine (AppliChem, Germany)
Glyerol (Scharlau, Spain)
Hydrochloric acid (Merck, USA) Methanol (景明化工,Taiwan)
MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-terazolium bromide; 購自Sigma, USA)
MPCR kite（Maxim Biotech,USA）
Paraformaldehyde (景明化工, Taiwan) Penicillin-Streptomycin (GIBCO, USA) PI (Propidium iodide; Sigma, USA)
Potassium dihydrogen phosphate (Merck, USA) Potassium chloride (Scharlau, Spain)
Protein assay-Dye reagent concentrate (Bio-Rad, USA) RNase A (Sigma, USA)
RT kit（Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A）
SDS (Sodium dodecyl sulfate; USB) Sodium bicarbonate (Merck, USA) Sodium chloride (Scharlau, Spain) Sodium hydroxide (SHOWA, Japan) Sodium pyruvate (GIBCO, USA)
TBA (2-Thiobarbituric acid; Sigma, USA) TCA (Trichloroacetic acid; Sigma, USA)
Tris (Tris(hydroxymethly)-aminomethane; Pharmacia,Sweden) Triton X-100 (USB)
Trysin-EDTA (GIBCO, USA) 第 二 節 、 實 驗 方 法
1、 Ellagic acid 配 製 方 法
秤取由蔬果提煉出之 Ellagic acid 粉末30.22mg，加入細胞培養等級 DMSO溶解，配製成 0.1 µM、1 µM、10 µM、25 µM、50 µM、75 µ M、
100µM等濃度備用。
2、 低 密 度 脂 蛋 白 的 分 離
將抽出的血液樣品放入真空採血管中，於 37℃浴水槽 1.5hr，置於 4
℃冰箱 1hr，離心（3000 rpm、4℃、15 分鐘）後血清、血球分離，
取上層血清 3 ml 加入溶液配製 0.9﹪NaCl 0.7ml 離心（ 95000 rpm、10
℃、3.5hr、Acc：5、Dec：7），去除 VLDL 後直接取 KBr 粉劑 166.8mg 加入 3 ml 血清，離心（、95000 rpm、10℃、3.5hr、Acc：9、Dec：7）
即可得到低密度脂蛋白。[24]
3、 低 密 度 脂 蛋 白 的 氧 化
取 LDL 1mg/ml 加入 PBS（no EDTA）及 1mM 硫酸銅（CuSO4）最 終濃度為 10µM，37℃水浴 24hr，加入 0.1ml EDTA 10mM（終止氧化）
最終濃度為 1mM，將約 2∼4ml 的 LDL 放入膜內放入裝滿 PBS（no EDTA）透析液瓶中，於 4℃冰箱中 stir，透析 24hr 更換 3 次透析液
（1hr、2hr、2hr），透析 24hr 後自透析膜取出 LDL（體積約增加 0.5ml）
或使用 PD10 透析，用 0.22µm 過濾所得即為氧化低密度脂蛋白 oxLDL，經由 TBAR 測得其氧化程度[24]。
4、 平 滑 肌 細 胞 的 培 養
血管平滑細胞株[66]（購自財團法人食品工業發展研究所生物資源 保存與研究中心，生資中心編號：60127，細胞株名稱：A10）來自 胎鼠胸主動脈(the thoracic aorta of DB1X embryonic rat)，多應用於血 管平滑肌(vascular smooth muscle cells; VSMCs)實驗模型。
培 養 基 及 試 劑
（A）無血清培養基：Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium ( DMEM)Powder : high glucose , L-glutamien , pyridoxine
hydrochloride , 10 mg/L sodium pyruvate , 需另外加入 soudium bicarbante 3.7g 。
（B）胎牛血清（Fetal bovine serum ; FBS）
血清購回後需先水浴 56℃加熱 30 分鐘後使用。(一般培養使用 10%
FBS、實驗進行使用 1% FBS、同步化時使用 0% FBS)。
D. HEPES Buffer Solution (1M)使用劑量 1%
E. Strpotomycin/penicilline 使用劑量 1%
F. Trypsine-EDTA 0.25% Trypsin with 1mM EDTA-4Na 培 養 方 法
將存放血管平滑肌細胞的冷凍管從液態氮中取出後插上浮板，迅速 放入37℃水浴中使其快速解凍，將解凍之細胞懸浮液從冷凍管中放入 10 公分培養皿，並加入約10 ml 含10 %胎牛血清之培養基，混合均 勻後放入細胞培養箱(37 ℃、95 ％ O2、5 ％CO2) 中進行培養，每 二天換一次培養基。
次 培 養
當細胞長約 9 分滿時，則進行分盤。首先將舊的培養廢液抽吸乾 淨，加入 7 ml 1x PBS 緩衝液(PH:7.4) 清洗一次，加入 Trypsin- EDTA 1ml incubate 2 分鐘，加入 1ml 10% FBS- DMEM 2ml 中和
Trypsin-EDTA 作用,以抽吸方式將細胞沖散，將培養皿液體吸換至離 心管後加入 10% FBS- DMEM 共 10 ml ，離心 1500 rpm，5 分鐘，計 算細胞數目後進行日常分盤或實驗用分盤。
冷凍細胞：使用 90% culture medium + 10% DMSO。
5、 細 胞 數 目 計 算
先將10 公分培養皿內之培養液吸去，再以約7 ml 的1x PBS 緩衝 液(pH=7.4)小心清洗細胞兩次後加入約1 ml 的1x trypsin-EDTA 置入 培養箱內，待2 分鐘後取出。以輕拍培養皿底部的方式將細胞完全脫 離培養皿懸浮起來。加入1 ml 的培養液中和 trypsin-EDTA 活性，並 用1 ml 的pipette 以緩慢來回抽吸方式將細胞打散。將打散後之細胞
換到15 ml 離心管中，並加入10 ml培養液稀釋混勻。如所含細胞密度 過高，則算出的數目誤差較大，需再加入更多的培養液稀釋。取出100 µl 細胞懸浮液和10 µl typan-blue，在96-well內混合均勻，共取2次。
分別從混合液中各取出10 µl 的細胞懸浮液放在細胞計數盤
(haemocytometer)上下兩個凹槽上，利用蓋上蓋玻片時的虹吸作用將 細胞均勻平均分散於細胞計數區域。在顯微鏡下計數細胞數目(細胞 顏色較亮者為存活的細胞)並算出細胞計數盤內9 大格中2 格(左上角 及右上角區域)之活細胞總數(N 值)。N 值除上4，再乘上1.1（稀釋 倍數）x10（細胞懸浮液總量）x 104 即可得10 ml中的細胞總數目 (cells/10ml)。
細胞計數盤與細胞計數區域放大簡圖。
6、 細 胞 週 期 同 步 化 (synchronize)
將細胞分到實驗適合之dish或plates後(例如：6cm dish 細胞數目約 3.5 x105 cells/ well)，以含10 % 胎牛血清的培養液培養細胞，並於放 入培養箱前稍微搖晃使細胞分佈均勻。待12∼24 小時細胞適應環境
並貼覆上 plates 穩定後吸去培養廢液，再以1XPBS緩衝液（pH:7.4）
Baradford（µl） 200
總體積（µl） 1000
取 10 µl 的樣品與 790 µl 的 DDW 混合，在加入 200µl 的 Bradford 染 劑，均勻混合 5 分鐘後在 O.D 590 測定吸光值。
將樣品吸光值(y)帶入算出趨勢線方程式，則可算出樣品蛋白質濃度 (x)
8、 Cell count
◎原理
應用Trypen blue exclusion實驗計數樣品中的細胞數，因活細胞會 排斥trypan blue 染劑，僅死細胞會被染成藍色，因此計數亮色的細胞 數可相對得知其細胞存活率。
◎方法步驟
將細胞分盤至平面 24-well 培養，種植細胞數約 5×104/well，以 10%FBS DMEM1ml 飼養 24 小時後，以 1x PBS（pH:7.4）1ml 沖洗 1 次，加入 0﹪FBS DMEM100ml 同步化 24 小時，以含不同濃度藥物 或低密度之蛋白或氧化低密度之蛋白培養至時間點，加入 200µl Trypsin incubation 2 分鐘，加入 10%FBS-DMEM 800µl 並將細胞衝散 均勻，取出 100 µl 細胞懸浮液和 10 µl typan-blue 在 96-well 內混合均 勻，共取 2 次。分別從混合液中各取出 10 µl 的細胞懸浮液放在細胞 計數盤(haemocytometer)計數活細胞數。
9、 MTT assay
◎ 原理
主要是依賴粒線體中琥珀酸去氫脢的作用將 MTT 3-(4,5-dimethyl
主要是依賴粒線體中琥珀酸去氫脢的作用將 MTT 3-(4,5-dimethyl