本研究主要以體外（in vitro）實驗為主軸，模擬粥狀動脈血管疾 病中血管平滑肌細胞受到 ox-LDL 刺激後所引平滑肌細胞增生與天然 蔬果中具有抗氧化功能之多酚類化合物 Ellagic acid 之研究探討。
Ellagic acid 對 ox-LDL 刺 激 平 滑 肌 細 胞 增 生 的 影 響
有許多證據指出在粥狀動脈血管疾病中 ox-LDL 所引起內膜層平 滑細胞遷移及增生對於疾病嚴重度的發展是非常重要的因素[42, 43]。而文獻指出 ox-LDL 的生物活性可以引起生長因數調控基因、黏 著分子表現和改變單核球及巨噬細胞的能力與平滑肌細胞的增生[7, 8, 30]。
近年研究報告對於粥狀動脈血管平滑肌細胞增生的探討我們可 以發現，有許多的因素可以引起血管平滑肌的增生。如 ox-LDL 和 acetyl-LDL 引起巨噬細胞吞噬，形成泡沫細胞[44]；另有文獻指出 LDL 與 ox-LDL 可以藉由活化訊息傳遞路徑 MAPK patheway，或藉由 PI3-kinase/Akt 與 ERK1/2 之間的 cross link 引起細胞的增生及遷移[24, 30, 44, 45]；另外 ox-LDL 也可以引起細胞內生長因數，如 FGF-2 之 釋放，達到刺激細胞增生。Marjorie 等學者提出，ox-LDL 刺激平滑 肌細胞增生，主要是引起細胞週期蛋白質的表現。細胞週期是由許多 不同的蛋白質所共同調控，包括：cyclin D1、cyclin-dependent kinase
（cdks） or PCNA 等[46]。Proliferating cell nuclear antigen（PCNA）
是 DNA polymerased 輔助蛋白，主要分佈於核質，其主要扮演的角色 是與 cyclin 或 cdks 及 P21 相互作用以調控細胞週期的進行並與 DNA 合成有關[46]；而 ox-LDL 氧化產物包括 4-hydroxynonenal、
lysophosphatidylcholine 也會刺激平滑肌細胞的增生[19, 47]。
根據文獻指出自由基亦是導致平滑肌細胞增生的主要原因[24]；
而本實驗所使用的 Ellagic acid，過去主要是針對癌症與抗氧方面的領 域研究，對於 Ellagic acid 在粥狀動脈硬化血管疾病的作用機制並不 清楚。粥狀動脈是一個慢性發炎伴隨著自由基傷害、脂質堆積與平滑 肌不正常細胞增生的血管性疾病，不正常的細胞增生就如同癌細胞一 樣。而 Ellagic acid 在抗癌部分可藉由活化 21 進而抑制癌細胞週期導 致細胞凋亡[35]，或經由抑制乙醯轉移酵素活性及 Cytochrome P450 的作用預防致癌物產生及腫瘤生成[33]。而在 TCDD 引起的胎兒毒素
（fetotoxicity）及氧化壓力（oxidative stress）之下，使用 100 µg /kg 濃 度的 Ellagic acid 則可有效的預防胎兒死亡（fatal death）和 speroxide anion 的產生[38]。
在平滑肌細胞增生方面之實驗顯示，氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）
與 MAPK 訊息傳遞路徑具相關性[23]，並加速細胞週期的進行。本 實驗在給予 Ellagic acid 後，則可以抑制細胞週期、細胞增生、Erk
磷酸化及 PCNA 的表現，表示 Ellagic acid 可以阻斷 MAPK 的訊息傳 遞及細胞週期的進行。而本研究將 Ellagic acid 應用在粥狀動脈血管 平滑肌細胞的增生的模型，並利用低血清的環境進行實驗。主要是血 清本身含有生長因數可以促進細胞增生，若給予正常飼養濃度的血清 10%可能無法看到顯著的細胞增生情形，而血清可能中和 EA 之作用 而無法清楚釐清 EA 功能為何。在實驗中發現在 Ellagic acid 在濃度 1
∼40 µM的時候，經 MTT 結果顯示細胞的存活率高於 1﹪FBS-DMEM 組別而在濃度 50 µmol /l 的濃度下則無明顯的差異。因此我們選擇 50 µM 為實驗的濃度，結果顯示血管平滑肌細胞在給與 100 µg /ml 氧化 低密度脂蛋白（ox-LDL）處理 24 小時，會促進細胞增生，且持續磷 酸化 MAPK 訊息傳遞路徑下游之 ErK 蛋白質、細胞週期的 S 期及 PCNA 蛋白質。當同步給予濃度 50 µM 的 Ellagic adid 的確可以明顯 的抑制上述的表現，這意味著 Ellagic acid 的確可以藉由抑制 MAPK 訊息傳遞路徑及細胞週期進而抑制氧化低密度脂蛋白引起的平滑肌 細胞增生。Ellagic acid 抑制氧化低密度脂（ox-LDL）所引起的 MAPK 訊息傳遞路徑也許是經由抑制活性氧（ ROS）的產生及活化 P21 而達 到抑制平滑肌細胞的增生；另一方面文獻也指出 cytochrome P450 會 促進低密度脂蛋白的氧化[48]， Ellagic acid 則可抑制 cytochrome P450 的產生，進而達到抑制脂質的氧化。
Ellagic acid 抗 氧 化 對 平 滑 肌 細 胞 增 生 與 之 討 論
在本論文研究探討實驗中可以發現，ox-LDL 在不同濃度處理 24 小時候會引起血管平滑肌細胞表現出不同的結果，這也說明瞭 ox-LDL 在粥狀動脈血管疾病中所扮演的複雜角色。2000 年亦有文獻 指出，內皮細胞的 ox-LDLreceptor-1（LOX-1）與 ox-LDL 結合後會 產生 ROS，並且隨著 ox-LDL 濃度增加 ROS 的量亦會隨之增加[49]，
血管平滑肌細胞亦被發現有 LOX-1 而 ox-LDL 脂質氧化產物 lysophosphatidylcholine (LPC) 會增加血管平滑肌細胞 LOX-1mRNA 的表現[50]，推測這個現象的原因可能是因為 ox-LDL 在不同濃度所 產生自由基的總量不同引起不同的細胞外訊息傳遞路徑因而導致增 生的結果；另一方面也可能是 ox-LDL 脂質氧化代謝產物不同或代謝 產物總量的差異引起細胞毒性而導致不同的結果。
抗氧化劑具有保護身體，防止自由基形成、去除體內所產生的自 由基 （freeradicals）；這些自由基是由氧氣和體內的各種物質反應而 產生，會造成一連串有害的連鎖反應，而對體內組織造成各種傷害。
抗氧化劑，例如：脂溶性維他命Ｅ、水溶性維他命Ｃ，雖然抗氧化機 制不同但是對於降低氧化傷害[51-53]，及抑制血液中膽固醇含量都有 顯著的成效[54]，並且可以降低並預防心血管疾病及粥狀動脈硬化疾 病進展[55]。而本實驗運用不同時間點的方式，探討Ellagic acid抗氧
化的機制起始為何，發現同步給予24小時處理的Ellagic acid和LDL，
可以明顯的抑制平滑肌細胞的增生；然而先單獨給予EA或LDL雖然 有抑制細胞增生情形，但是卻不如同步給予明顯。LDL本身並不會產 生ROS但是當加入細胞內時則可引細胞內ROS的產生。因此推論 Ellagic acid在抑制LDL引起的細胞增生，主要是經由捕捉細胞內ROS 進而抑制細胞增生。另外，本實驗所使用的Ellagic acid 即是種天然 抗氧化劑在50 µM的濃度下對於LDL或ox-LDL所引起的增生實驗 中，發揮了抑制細胞增生的效果，而這個濃度與2000年Chai學者提 出，抗氧化劑vitamin E在50 µM具有時抑制lyso PC 所引起的平滑肌 細胞增生[56]。Ellagic acid是一種蔬果中的多酚類化合物其，本身具 抗氧化功能就有保護正常細胞免於不正常環境刺激下受到影響，雖然 文獻[22]有指出LDL或ox-LDL會增加ROS的生成進而影響平滑肌細 胞的增生，但本實驗卻欠缺ox-LDL導致自由基增加直接證據，這也 是論文不足的地方，因此未來實驗的方向可朝向ox-LDL與自由基的 相關實驗及Ellagic acid在抗氧化中所扮演的角色。
粥狀動脈血管疾病是高死亡率的現代文明病的一種，許多研究學 者致力於研究其治病機轉，尋找可以預防或降低此疾病的發生率，而 本實驗使用了存在於蔬果內的具抗氧化功能之多酚類化合物進行實 驗。結果顯示 Ellagic acid 在粥狀動脈中平滑肌細胞增生具有抑制作
用，這也是本研究的主旨，對於粥狀動脈疾病的進展可以藉由日常生 活中的蔬果的補充，而達到預防或降低的效果，更可以減少因服用化 學合成藥物副作用所造成的更進一步的傷害。