第 一 節 、 實 驗 材 料 A 儀 器
無菌操作臺（造鑫, Taiwan）
細胞培養箱 (Nuaire, USA)
細胞計數器 (Haemocytometer; Boeco, Germany) 光學顯微鏡 (Motic, Japan)
離心機 (Beckman)
酸鹼值測定計 (C831; Consort, UK) 乾浴槽 (Model 110001; 購自Boekel) 微量天平 (GR-200; A&D, Japan) 去離子水製造機 (Minipore, USA) 超高速離心機（himac CS 120GX）
Shaker bath (BT-350; 購自YIH DER, Taiwan)
超音波震盪器 Sonicater (MISONIX,Farmingdale,NY ,USA) Power supply ( Hoefer,San Francisco, CA, U.S.A)
ELISA reader（ANTHOS-2020,Salzbrug,Austria）
Vortex-genie 2 (SCIENTIFIC INDUSTRIES,NY,USA) SDS-PAGE 電泳槽套組 (Amersham, UK)
蛋白質轉漬電泳套組 (Bio-Rad, USA) 水浴槽 Water bath (TKS,Taipei,Taiwan ) 流式細胞儀（FACSCalibur,BD,USA）
影像分析儀器（AlphaImagerTM 2200,USA）
載玻片 (Marriefeld, Germany) 冷凍管 (騰達行, Taiwan) 微量離心管 (季勗, Taiwan) 離心管 (季勗, Taiwan) Falcon (汎泰, Taiwan) X-film ( Kodak,USA)
Paraffin (購自 American national can) 透析膜 （Amersham,UK）
PD 10 （Amersham,UK）
C 試 劑
Acrylamide/Bis (生工, Taiwan) APS (Ammonium persulfate; USB)
Bradford reagent (BIO-RAD, Hercules,California,USA)
BSA（Bovine serum albumin）（SIGMA, ST.Louis,MO,USA）
Bromophenol blue (USB)
DMSO (Dimethyl Sulfoxide; Sigma, USA)
DTT (1,4-Dithio-D,L-threitol; GERBU, Germany)
DMEM (Dulbeccco’s Modified Eagle’s Medium; GIBCO, USA) ECL kit (Amersham, UK)
Ellagic acid (Sigma, USA) Ethanol (景明化工,Taiwan )
FBS (Fetal Bovine serum; GIBCO, USA) Glycine (AppliChem, Germany)
Glyerol (Scharlau, Spain)
Hydrochloric acid (Merck, USA) Methanol (景明化工,Taiwan)
MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-terazolium bromide; 購自Sigma, USA)
Paraformaldehyde (景明化工, Taiwan) Penicillin-Streptomycin (GIBCO, USA) PI (Propidium iodide; Sigma, USA)
Potassium dihydrogen phosphate (Merck, USA) Potassium chloride (Scharlau, Spain)
Protein assay-Dye reagent concentrate (Bio-Rad, USA) Protein maker (Amersham, UK)
RNase A (Sigma, USA)
RT kit（Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A）
SDS (Sodium dodecyl sulfate; USB) Sodium bicarbonate (Merck, USA) Sodium chloride (Scharlau, Spain)
Sodium hydroxide (SHOWA, Japan) Sodium pyruvate (GIBCO, USA)
TBA (2-Thiobarbituric acid; Sigma, USA) TCA (Trichloroacetic acid; Sigma, USA)
TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethyl-ethylenediamine; Pharmacia, Sweden) Tris (Tris(hydroxymethly)-aminomethane; Pharmacia,Sweden)
Triton X-100 (USB)
Trysin-EDTA (GIBCO, USA) Tween 20 (Pharmacia, Sweden) 脫脂奶粉(安佳, New Zealand) 顯影劑(Kodak, USA)
定影劑(Kodak, USA) 一級抗體：
(a). anti-PCNA (Santa Cruz, USA) (b). anti-p-Erk1/2 (Santa Cruz, USA) (d). anti-Erk1/2 (Santa Cruz, USA) (e). anti-bata actin (abcam, USA) 二級抗體
anti-mouse IgG (horseradish peroxidase conjugated; Santa Cruz, USA) anti-rabbit IgG (horseradish peroxidase conjugated; Santa Cruz, CA)
第 二 節 、 實 驗 方 法
1、 Ellagic acid 配 製 方 法
秤取Ellagic acid 粉末30.22 mg，加入細胞培養等級之DMSO溶解，
配製成 0.1 µM、1 µM、10 µM、25 µM、50 µM、75 µM、100 µM等 濃度備用。
2、 低 密 度 脂 蛋 白 的 分 離
將抽出的血液樣品放入真空採血管中，於 37℃浴水槽 1.5hr，置 於 4℃冰箱 1hr，離心（ 3000 rpm、4℃、15 分鐘）後血清、血球分離，
取上層血清 3 ml 加入溶液配製 0.9 ﹪NaCl 0.7ml 離心（95000 rpm、
10℃、3.5hr、Acc：5、Dec：7），去除 VLDL 後直接取 KBr 粉劑 166.8 mg 加入 3ml 血清，離心（、95000 rpm、10℃、3.5hr、Acc：9、Dec：
7）即可得到低密度脂蛋白[24]。
3、 低 密 度 脂 蛋 白 的 氧 化
取 LDL 1 mg/ml 加入 PBS（no EDTA）及 1 mM 硫酸銅（CuSO4） 最終濃度為 10 µM，37℃水浴 24hr，加入 0.1ml EDTA 10mM（終止 氧化）最終濃度為 1 mM，將約 2∼4 ml 的 LDL 放入膜內放入裝滿 PBS（no EDTA）透析液瓶中，於 4℃冰箱中 stir，透析 24hr 更換 3 次透析液（1hr、2hr、2hr），透析 24hr 後自透析膜取出 LDL（體積約 增加 0.5 ml）或使用 PD10 透析，用 0.22 µm 過濾所得即為氧化低密
度脂蛋白 oxLDL，經由 TBAR 測得其氧化程度[24]。
4、 平 滑 肌 細 胞 的 培 養
血管平滑細胞株（購自財團法人食品工業發展研究所生物資源保存 與研究中心，生資中心編號：60127，細胞株名稱：A10）來自胎鼠 胸主動脈(the thoracic aorta of DB1X embryonic rat)，多應用於血管平 滑肌(vascular smooth muscle cells; VSMCs)實驗模型。
培 養 基 及 試 劑
（A）無血清培養基：Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium ( DMEM)Powder : high glucose , L-glutamien , pyridoxine
hydrochloride , 10 mg/L sodium pyruvate , 需另外加入 soudium bicarbante 3.7g 。
（B）胎牛血清（Fetal bovine serum ; FBS）
血清購回後需先水浴 56℃加熱 30 分鐘後使用。(一般培養使用 10 % FBS、實驗進行時使用 1 % FBS、同步化時使用 0 % FBS)。
A. HEPES Buffer Solution (1M)使用劑量 1 % B. Strpotomycin/penicilline 使用劑量 1 %
C. Trypsine-EDTA 0.25 % Trypsin with 1mM EDTA-4Na 培 養 方 法
將存放血管平滑肌細胞的冷凍管從液態氮中取出後插上浮板，迅速 放入37℃水浴中使其快速解凍，將解凍之細胞懸浮液從冷凍管中放入
10 公分培養皿，並加入約10 ml 含10 %胎牛血清之培養基，混合均 勻後放入細胞培養箱(37 ℃、95 ％ O2、5 ％CO2) 中進行培養，每 二天換一次培養基。
次 培 養
當細胞長約 9 分滿時，則進行分盤。首先將舊的培養廢液抽吸乾 淨，加入 7 ml 1x PBS 緩衝液(pH:7.4) 清洗一次，加入 Trypsin- EDTA 1ml incubate 2 分鐘，加入 1 ml 10% FBS- DMEM 2 ml 中和
Trypsin-EDTA 作用,以抽吸方式將細胞沖散，將培養皿液體吸換至離 心管後加入 10 % FBS- DMEM 共 10 ml ，離心 1500 rpm，5 分鐘，
計算細胞數目後進行日常分盤或實驗用分盤。
冷凍細胞：使用 90 % culture medium + 10 % DMSO。
5、 細 胞 數 目 計 算
先將10 公分培養皿內之培養液吸去，再以約7 ml 的1x PBS 緩衝 液(pH=7.4)小心清洗細胞兩次後加入約1 ml 的1x trypsin-EDTA 置入 培養箱內，待2 分鐘後取出。以輕拍培養皿底部的方式將細胞完全脫 離培養皿懸浮起來。加入1 ml 的培養液中和 trypsin-EDTA 活性，並 用1 ml 的pipette 以緩慢來回抽吸方式將細胞打散。將打散後之細胞 換到15 ml 離心管中，並加入10 ml培養液稀釋混勻。如所含細胞密度 過高，則算出的數目誤差較大，需再加入更多的培養液稀釋。取出100
µl 細胞懸浮液和10 µl typan-blue，在96-well內混合均勻，共取2次。
分別從混合液中各取出10 µl 的細胞懸浮液放在細胞計數盤
(haemocytometer)上下兩個凹槽上，利用蓋上蓋玻片時的虹吸作用將 細胞均勻平均分散於細胞計數區域。在顯微鏡下計數細胞數目(細胞 顏色較亮者為存活的細胞)並算出細胞計數盤內9 大格中2 格(左上角 及右上角區域)之活細胞總數(N 值)。N 值除上4，再乘上1.1（稀釋 倍數）x10（細胞懸浮液總量）x 104 即可得10 ml細胞總數目 (cells/10ml)。
細胞計數盤與細胞計數區域放大簡圖。
6、 細 胞 週 期 同 步 化 (synchronize)
將細胞分到實驗適合之dish或plates後(例如：6cm dish 細胞數目約 3.5 x105 cells/ well)，以含10 % 胎牛血清的培養液培養細胞，並於放 入培養箱前稍微搖晃使細胞分佈均勻。待12∼24 小時細胞適應環境 並貼覆上 plates 穩定後吸去培養廢液，再以1XPBS緩衝液（pH:7.4）
2 ml/well 小心清洗1 次，最後加入2 ml/well 的0 %胎牛血清培養
液，經24小時後即完成細胞同步化步驟。
Baradford（µl） 200
總體積（µl） 1000
NO. 1 為背景值
Bradford 為蛋白質染劑，有毒性，使用時需戴手套。加入染劑混合均
下層膠(10%Separation gel) 上層膠(5% Stacking gel)
組成 一片量 兩片量 一片量 兩片量
下層膠注入造膠檯內約八分滿，剩餘的空間先用 DDW 填滿去除上面 的氣泡並壓平膠之上緣，等待凝固約 30 分鐘，造上層膠，TEMED 則 須等下層膠凝固後將 DDW 倒出後加入，下層膠凝固後，注入上層膠，
插入 comb 等待凝固約 30 分鐘將 comb 取出後先用 DDW 清洗 well，
將膠檯放入電泳槽內裝滿 Running buffer，將 loading sample 先加熱
（95℃、5 分鐘）立即放置於冰上冷卻 30 秒以上，將 Marker（5∼10µl）
和 sample（18∼24 µl）loading 到 well 內，利用 100V 跑電泳約 2 個 Filter paper
PVDF membrane 膠體(gel) Filter paper
海綿 黑底網夾
0.1 % PBST 搖盪 5 分鐘，共 3 次，將 membrane 放入含有二級抗體，
室溫搖盪 1 小時，取出 membrane 放入 0.1%PBST 搖盪 5 分鐘，共 3 次後進行暗房底片顯影[40]。
◎ 暗房底片顯影（壓片）
準備用物：1 ml Pipet、1 ml tip、cassete、鑷子、感光底片、剪刀、
透明膠片、ECL、Developer、Fixer 將 memgrane 浸泡於 ECL（比例 為 1:1）混合液中約 30 秒，將 membrane（正面朝上）放置於透明膠 固定好，剪適當大小的底片，進行曝光。（依 membrane 上冷光亮度 決定曝光時間，數秒至 1 小時），曝光後用顯影劑及定影劑洗底片，
後將底片風乾保存並進行分析[40]。
◎Membrane 保存
將壓片後的 membrane以 0.1%PBST 10分鐘 2次，放入含 0.1%PBST 的密封袋 4℃保存。（可保存 2 星期）
◎ Commassie Blue 染色
gel 先以 DDW 清洗 15 分鐘，共 3 次，加入適當的 Commassie Blue 反應 20 分鐘，加入 destain buffer 搖盪至清楚呈現 band。
◎ Comassie Brilliant Blue R-250 泡製方法
組成 最終濃度 最初濃度 體積 / 重量
Comassie Brilliant Blue － － 0.25g
Methanal － 100% 45ml
Acetic acid － 100% 10ml
DDW － － 45ml
應用Trypen blue exclusion實驗計數樣品中的細胞數，因活細胞會 排斥trypan blue 染劑，僅死細胞會被染成藍色，因此計數亮色的細胞 Trypsin incubation 2 分鐘，加入 10% FBS-DMEM 800ul 並將細胞衝散 均勻，取出 100 µl 細胞懸浮液和 10 µl typan-blue 在 96-well 內混合均 勻，共取 2 次。分別從混合液中各取出 10 µl 的細胞懸浮液放在細胞 計數盤(haemocytometer)計數活細胞數。
12、 MTT assay
◎ 原理
主要是依賴粒線體中琥珀酸去氫脢的作用將 MTT 3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) 的 tetrazolium 轉變為 藍色產物 MTT formazan。MTT 轉變僅在活細胞中進行，並堆積在細 胞內，且 formazan 形成量與細胞數目呈正比，加入 10 % SDS-Hcl 溶 解後，可以由波長約 590nm 知吸光測量並定量。由於細胞還原 MTT 的能力代表細胞粒線體的活性，因此可以做為細胞存活率的一個指 標。【MTT 保存方法：避光，冷藏於 2∼8℃。】
◎方法步驟
將細胞分盤至平面 96 well 培養，種植細胞數約 1×104/well，以 10%
FBS-DMEM 100µl 飼養 24 小時後，以 1 x PBS（PH:7.4）100 µl 沖洗 1~2 次，加入 0﹪FBS-DMEM 100µl 同步化 24 小時，以含不同濃度藥 物的 10﹪FBS-DMEM 100 µl 培養至時間點加入濃度 5 mg /ml 的 MTT 佔 DMEM 量的 l/10，培養 4 小時後再加入 100 µl 10﹪SDS-Hcl
（終止反應）隔天測吸光值 OD590 nm 、ref 620 nm。
◎MTT 溶液的配製 ﹙避光 4℃儲存﹚
組成 最終濃度 初濃度 體積/重量
MTT 5 mg/ml -- 250 mg
PBS(pH7.4) -- -- 50 ml
總體積 50 ml
Solubilization solution 配製﹙室溫儲存﹚
組成 最終濃度 初濃度 體積/重量
SDS 10% － 10 g
Hcl 0.01M 1M 1 ml
總體積 100 ml
13、 細 胞 週 期 分 析 法
※細胞前處理
將細胞分盤至 6 cm dish 培養，種植細胞數約 3.5×105/well 10%
FBS-DMEM 2 ml 飼養 24 小時，加入 1x PBS 2 ml 沖洗 1-2 次，然後 加入 0% FBS- DMEM 1ml 同步化 24 小時，再以含 1% FBS-DMEM 加 入實驗設計之液體共 5ml 培養至實驗時間點，以 1x PBS 5 ml 沖洗 1-2 次加入 Trypsine 500 µl incubate 2 分鐘後加入 500 µl 10% FBS-DMEM 以 pipet 將細胞沖洗下來，離心（1500 rpm【300g】、5 分鐘）倒掉上 清液，以 1x PBS 1 ml 加入離心管，離心（ 1500 rpm【300g】、5 分鐘）
倒掉上清液，以 70% 冰酒精固定細胞，以 vortex 以 shack 3 的速度 一滴一滴緩慢滴入酒精 2 ml，-20℃冷藏隔天[41]。
※上機前細胞處理
離心（1500 rpm【300g】、10 分鐘）倒掉上清液去除酒精，以 1xPBS 1ml 加入離心管，離心（ 1500 rpm【300g】、10 分鐘），加入 PI 染劑 避光，室溫下 incubater 30 分鐘，換成 FACON 專用管，進行流式細 胞儀分析。
◎PI stain 染劑的配製
組成 最終濃度 初濃度 體積 / 重量
PI 0.4 mg/dl 2 mg/dl 5 ml
Triton 1% 5% 5 ml
RNase A 0.1 mg/ml 2 mg/ml 1.25 ml
1×PBS - - 13.75 ml
總體積 25 ml
14、 數 據 分 析
實驗結果以 One way ANOVA 計算分析。數據結果以 mean ± SE 表示各項值。（圖中＊表示與 1% FBS-DMEM 相比，P＜0.05；＃表示 與低密度脂蛋白或氧化低密度脂蛋白組相比，P＜0.05。）