嵌入植物基因體之轉殖 DNA 的相關資訊

第二章基改抗胡瓜嵌紋病毒番茄過敏性評估

1. 嵌入植物基因體之轉殖 DNA 的相關資訊

3. 其他必要資料

2-3 材料與方法

本研究所進行的基改抗胡瓜嵌紋病毒番茄過敏誘發性評估依據我國「基因改造食品」

之安全評估方法 (六) 安全性評估之 2. 新表現物質之毒性與過敏誘發性的初步評估之 b.

新表現蛋白質之過敏誘發性初步評估進行 (附錄一)

(一) 基改抗胡瓜嵌紋病毒番茄過敏誘發性評估

基改作物之過敏誘發反應可分為三類：第一類為在轉殖過程中改變了內生蛋白質; 第二類為經由基因改造將過敏原轉殖進作物中; 第三類為經由基因改造改變了作物的代謝路徑，產生新的可能是過敏原的蛋白質。因為引發過敏之機制極其複雜，造成過敏誘發性必須採取評估的方式; 評估方法分為三項：探討基因來源、序列比對與模擬胃液消化試驗。

1. 探討基因來源

該基因轉殖產物是ㄧ個未知是否具有過敏誘發性之蛋白質，或是基因來自從未接觸 218 個胺基酸。所使用的過敏原資料庫包含 AllergenOnline version 10.0 database (1417 peer reviewed sequences; http://www.allergenonline.com/) 、 Structural Database of Allergenic Proteins (SDAP; 891 allergen sequences; http://fermi.utmb.edu/SDAP/) 和 Allergen Database for Food Safety (ADFS; 1285 registered allergens;

http://allergen.nihs.go.jp/ADFS/index.jsp) 。依據資料庫所提供搜尋工具的不同，在這3 個資料庫進行 80 mer amino acid FASTA alignment 搜尋，在 ADFS 以及 SDAP 資料庫進行滑動連續胺基酸片段搜尋，並在AllergenOnline 以及 SDAP 資料庫進行 full FASTA overall search。在 80 mer amino acid FASTA alignment 搜尋中，如果超過 35% 的胺基酸序列相同為陽性 (具有顯著的過敏原相似度，Codex, 2003) 。在滑動連續胺基酸片段搜尋中，如果有連續 8 個線性胺基酸序列相同則結果為陽性 (Aalberse, 2000) 。在 full FASTA overall search 中具有顯著低期望值 (AllergenOnline 資料庫為小於 1×10^-7，SDAP 資料庫為小於 0.01) 的結果為陽性 (Shin et al., 1998; Reese et al., 1999; Chatchatee et al., 2001) 。

圖2-3、基改番茄 R8 的胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白基因與胺基酸序列。

Fig. 2-3. DNA and amino acid sequence of CMV coat proetin gene of transgenic tomato R8.

a. 胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白基因序列選殖與確認

以試劑套組 (GeneMark plant genomic DNA purification kit ， Hopegen Biotechnology Development Enterprises，Taiwan) 進行基改番茄葉片 DNA 抽取，

再以引子對 35S1 (5’-GCTCCTACAAATGCCATCA-3’) - NOS3 (5’-GCTCCTACAAATGCCATCA-3’) 進行 PCR 放大胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白基因片段。PCR 反應條件如下：先以 95^oC 反應 1 min，再以 95^oC 30 sec- 55^oC 30 sec-72^oC 1 min 為一循環，進行 35 次增幅循環，最後於 72^oC 反應 10 min。PCR 放大產物經由定序後取得基改番茄中胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白之核酸序列。

b. 基改番茄中轉殖基因於不同生長時期的表現量

本研究測定基改番茄中轉殖基因於四個不同生長時期的表現量，包含 4-6 片真葉時期、始花時期、綠色果實時期與「黑柿」品種番茄果實採收時期 (turning，俗稱「一點紅」，圖 2-4) 。

(1) 番茄樣品

本研究所使用的種子由亞蔬中心提供，於恆溫植物培養室中種植傳統番茄品系L4783 和基改番茄品系 R8，培養溫度 25^oC，光照設定為早上 4 點至晚上8 點，每日 16 小時光照與 8 小時黑暗（16L/8D）。

(2) Total RNA 製備與純化

Total RNA 以 Concert^TM Plant RNA Reagent (Invitrogen，Carlsbad，USA) 進行抽取。將番茄植株樣品以液態氮急速冷凍後研磨成細粉，在未解凍的情況下取約0.5 g 樣品粉末加入 4 mL Concert^TM Plant RNA Reagent 中，混勻後

圖2-4、番茄果實成熟度的六個判定標準 (Goud, 1983) 。 Fig. 2-4. Tomato color chart showing the six official classifications.

GREEN

The tomato surface is completely green. The shade of green may vary from light to dark.

BREAKERS

There is a definite break of color from green to bruised fruit.

Tannish - TURNING

Tannish - yellow, pink or red color shows on over 10% but not more than 30% of the tomato surface.

PINK

Pink or red color shows on over 30% but not more than 60% of the tomato surface.

LIGHT RED Pinkish -

not more than 90% of the tomato surface.

RED

Red color shows on over 90% of the tomato surface.

yellow, pink or red on 10% or less of the tomato surface.

red or red color shows on over 60% but red color covers

加入80 μL DEPC-H²O 回溶 RNA 樣品。回溶的 RNA 樣品再以 DNA-free^TM kit (Invitrogen) 處理除去 DNA，並且再以 isopropanol 沈澱，以 -20^oC 的 75

％ EtOH 清洗 RNA 沈澱兩次後風乾，加入 40 μL DEPC-H²O 回溶 RNA 之後保存於 -80^oC 中備用。

(3) RNA 定量

RNA 濃度利用 OD260 測定 (Sambrook and Russell, 1989) 。

RNA concentration (µg/mL) = (OD260) × (dilution factor) × (40 µg RNA/mL) / (1 OD260 unit) 。

(4) 反轉錄即時定量 PCR 分析 (RT-qPCR)

(a) cDNA 合成

取 5 μg total RNA 以 SuperScript^TM III First-strand Synthesis SuperMix for RT-qPCR 試劑 (Invitrogen) 進行 cDNA 合成，primer 為 oligo dT (20) 。反轉錄反應條件參照廠商建議為 25^oC 反應 10 分鐘，接著50^oC 反應 30 分鐘，最後以 85^oC 加熱 5 分鐘終止反應。反轉錄之產物再加入2 U RNase H 於 37^oC 下反應 30 分鐘後，稀釋 10 倍作為即時定量PCR 分析樣品。

(b) 即時定量 PCR 引子設計

先前所選殖得到的轉殖基因序列進行 cmvcp 以及 nptII 基因的引子 設計，同時選取 β-tubulin 作為即時定量 PCR 的參照基因 (reference

表2-2、轉殖基因與 housekeeping 基因表現測定用引子

Table.2-2 Primers used to determine the expression level of transgene and housekeeping gene

Primer ID Sequence 5’-3’ Target

bTub RTQF AAGGCGCTGAGTTGATTGATGC

β-tubulin gene (GenBank DQ205342) bTub RTQR TGAGTGGCAAACCTGGAATCCT

CMVCP RTQF TTGCCGCCATCTCTGCTATGTT

Cucumber Mosaic Virus coat protein gene CMVCP RTQR GCATCGCCGAGAGATCGTACAA

nptII RTQF GAAGTGCCGGGGCAGGATCT

Neomycin phosphotransferase II gene nptII RTQR AGCCGCCGCATTGCATCAG

(c) 即時定量 PCR 反應條件 baseline 設定一閥值 (threshold) 時，閥值與放大曲線的交會點所對應的增幅循環數即為Ct (cycle threshold) 值 (圖 2-5) 。Ct 值為即時定量 PCR 的數據呈現方式，與起始 DNA 模版數成反比，Ct 值越大則起始 DNA 模版數越少。RT-qPCR 分析是測定樣品中由 mRNA 合成的 cDNA 數量，並同時以適當的housekeeping 基因表現量作為比較的基準，以兩者 Ct 差值表示，即為ΔCt。不同樣品間的基因表現量差異則使用「ΔΔ

圖2-5、即時定量 PCR 放大曲線與 Ct 值的計算 (賴，2008) 。 Fig. 2-5. Amplification and Ct calculation of real-time PCR.

Ct value

4. 重組胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白生產

由於基因靜默 (gene silencing) 作用，在基改植物中，異源蛋白的表現量都相當低 (Fischer et al., 2004) ，多數無法以 SDS-PAGE 進行分析。胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白由於不容易測定生物活性，因此以Western blot 的方式利用抗胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白多株抗體 (濁水溪生物科技，八德，桃園) 進行番茄果實中的胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白檢測。結果即使以化學冷光進行檢測，亦無法偵測到番茄果實中的胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白。由於冷光為十分靈敏的偵測方法，在 Western blot 分析中偵測極限可達 sub-picogram level (Barreiro et al., 2002) ，因此可以推斷基改番茄果實中胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白表現量極低。此外以胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白單株抗體進行 ELISA 分析結果 β-D-1-thiogalactopyranoside) 進行誘導。誘導後第 6 個小時取菌液以 12,000 xg 離

內涵體蛋白樣品。

b. rCMVCP 的純化與確認

由DNA 序列推算 rCMVCP 分子量約為 25 kDa，pI 為 9.95，為一鹼性蛋白，

參考 rCMVCP 的物理化學特性，本研究初期所規劃的純化策略為：破菌回收內涵體，內涵體回溶，以陽離子交換樹脂管柱Sephadex SP 進行離子交換純化並復性，以疏水性管柱進行進一步純化，最後以膠體過濾管柱 Sephacryl S-200 精製。

由於胡瓜嵌紋病毒顆粒於植物細胞中會自然聚積形成內涵體 (Bkčák and Hršel，1960) ，因此 CMVCP 可能具有聚積沈澱的傾向。經過反覆嘗試後發現 rCMVCP 在純化過程中容易產生非專一性吸附或沈澱，以致於各式管柱均無法有效進行純化 (嘗試過 Sephadex SP、Sephadex A-50、Hitrap Phenyl FF、Sephacryl S-200 與 Sepharose G-25 等) ，因此改採下列純化策略：破菌回收內涵體，內涵體回溶，緩慢稀釋復性，PEG 沈澱，以 2 M urea 回溶，以濃縮管進行濃縮並脫鹽。

(1) rCMVCP 的純化

將回溶之後的內涵體以2 M urea 稀釋緩衝液 (含有 2 M urea 與 50 mM sodium phosphate, pH 7.0) 以逐滴的方式緩慢稀釋 2.5 倍，再以 12,000 xg 離心15 min 後取上清液。將上清液加入 1 倍體積的 PEG 沈澱劑 (含有 50%

PEG 4,000 與 50 mM sodium phosphate, pH 7.0) ，於室溫下緩慢震盪 30 min，

再以12,000 xg 離心 15 min 後移除上清液。沈澱物以 50 mM sodium phosphate 緩衝液清洗 (pH 7.0) 3 次之後，以 2 M urea 稀釋緩衝液回溶。回溶的蛋白質溶液以 Microcon (10 kDa MWCO, Millipore Co., Billerica, MA, USA) 迷

xg 離心 5 min 後取上清液作為 SDS-PAGE 蛋白樣品。取 60 ng 蛋白質樣品以12.5 % TG-SDS PAGE (Laemmli, 1970) 進行電泳，電泳條件為 150 V，90 min 。電泳膠片以 CBR (Coomassie Blue R-250) 染劑染色後以掃描器 (EPSON 4990, Seiko Epson Co., Nakano, Japan) 掃描並儲存圖檔。電泳膠片以轉印緩衝液 (含有 20 mM Tris-base, 150 mM glycine, 20% methanol 與 0.1% 衝液。再加入 40 mL 一級抗體 (polyclonal rabbit anti-rCMVCP antibody, 1:5000) ，震盪反應 1 小時後倒棄緩衝液，並另以 30 mL blocking buffer 清洗洗轉印膜 30 min 後倒棄緩衝液。接著加入 30 mL 二級抗體 (HRP conjugated goat anti-rabbit antibody, 1:5000) ，震盪反應 1 小時後倒棄緩衝液，並另以 30 mL TSW blocking buffer 洗 PVDF 膜 3 次，每次 10 min。最後加入 6 mL ECL 反應液 (Chemilucent ECL Detection System, Millipore) 並立即進行冷光照相。

將純化後的 rCMVCP 經 SDS-PAGE 分離並以 CBR 染色後切下膠片上的條帶，委由明欣生物科技公司 (台北，臺灣) 進行 LC/MS/MS 分析鑑定。

蛋白質N 端定序分析則是將純化後的 rCMVCP 經 SDS-PAGE 分析並以 1X CAPS (N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid) buffer 進行轉印至 PVDF 膜上，轉印條件為200 mA 轉印 1 小時。PVDF 膜以 1X Amido Black 10B 染

70 kDa 之間、在食品中含量較高、較其他一般非過敏原性蛋白質耐消化和即使經過加熱處理亦不易變性等 (Taylor and Fuchs, 1992; Astwood and Fuchs, 1996;

Astwood et al., 1996) 。模擬消化液試驗即是基於過敏原較其他非過敏原蛋白質耐消化此一現象所發展出來的過敏誘發性評估法 (Astwood et al., 1996) 。當食物被攝取 mg/mL。模擬胃液 (simulated gastric fluid, SGF) 為模擬人體胃液而配製的酸性溶液。將1.52 mL SGF buffer (含有 0.084 N HCl 與 35 mM NaCl，pH 1.2) 置於 37^oC 水浴槽中預熱5 min 後加入 2,400 U pepsin (Sigma-Aldrich #6887) 與蛋白質樣品 80 μL，最終比例為 6,000 U pepsin/mg 樣品蛋白，於 37^oC 水浴槽中進行反應。分別在反應時間0、0.5、2、5、10、20、30、60 min 取樣 200 μL 並馬上加入 75 μL 的反應終止液 (0.2 M Na2CO3, pH 11.0) 以及 70 μL 的 5X SDS sample buffer (含有 1.25M Tris-HCl 、 11% SDS 、 50% glycerol 、 5% 2-mercaptoethanol 與 0.025%

bromophenol blue，pH 6.8) ，均勻混合後以 100^oC 加熱 10 min 終止反應。對照組為使用不含pepsin 的 SGF buffer 於 37^oC 水浴槽中進行反應 60 min 後終止反應。

所有樣品製備完成之後進行12.5% TG-SDS PAGE 分析。

2-4 結果

(一) 蛋白質來源、基因表現量與蛋白質表現量分析 1. 蛋白質來源與過敏誘發性相關資料

蛋白質來源為胡瓜嵌紋病毒臺灣地區品系。胡瓜嵌紋病毒、其鞘蛋白基因或是感染胡瓜嵌紋病毒的植物並無誘發過敏的相關文獻紀錄。

2. 新表現蛋白質的含量及表現位置

胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白於基改番茄中的表現量相當低，無法以Western blot 方式偵測，以胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白單株抗體進行 ELISA 分析結果顯示胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白表現量低於 0.0016% 的總蛋白 (Lin et al., 2010) 。由 RT-qPCR 分析不同時期基改R8 番茄中轉殖基因的表現量，結果如圖 2-6 所示，相較於 selection maker nptII 基因，cmvcp 的 mRNA 表現量相當高，可以達到 housekeeping gene (β-tubulin) 的 50-60％。雖然始花時期的 cmvcp mRNA 表現量較低，但是經由 REST 2009 軟體進 行統計分析發現基改番茄轉殖基因在不同生長時期之間的表現量並沒有顯著差異 (圖 2-7) 。

(二) 序列搜尋比對

搜尋比對結果胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白胺基酸序列與已知過敏原無任何顯著相似性。各資料庫搜尋中，相似度最高的的過敏原如表2-3 所示。其中整體序列相似度 (full FASTA) 最高的為 Der p 8 以及 Der p 15 (均為 40.47%)，其 E score 均為 3.5，遠高於

在文檔中基因改造抗胡瓜嵌紋病毒番茄安全性與非預期效應評估之研究 (頁 36-0)

第二章 基改抗胡瓜嵌紋病毒番茄過敏性評估

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