第二章 基改抗胡瓜嵌紋病毒番茄過敏性評估
3. 選殖轉殖基因鄰近序列
以試劑套組所提供四種限制酶：DraI、EcoRV、StuI 以及 PvuII 於 37oC 下反 應隔夜將染色體DNA 切成較小的片段後，加入試劑套組所提供的 adaptor DNA 片 段並以T4 DNA ligase (New England Biolabs，Ipswich，MA，USA) 於 4oC 下反應 隔夜以接合剪切過的染色體DNA，製備成為 DNA library。再利用先前所取得的抗 胡 瓜 嵌 紋 病 毒 番 茄 轉 殖 基 因 序 列 設 計 引 子 (表 3-2) ，與泛用引子搭配進行 nested-PCR 釣取轉殖基因鄰近序列。將製備完成的 DNA library 以試劑套組所提供 的引子AP1 分別搭配反向引子 Inv F2 及 Inv R2 進行 5’及 3’ 端序列的第一輪 PCR 放大，PCR 產物再以試劑套組所提供的引子 AP2 分別搭配反向引子 Inv Fn2 及 Inv Rn2 進行 5’及 3’ 端序列的第二輪 PCR 放大，第二輪 PCR 產物再以引子 AP2 分別 搭配反向引子Inv Fnn 及 Inv Rnn 進行 5’及 3’ 端序列的第三輪 PCR 放大，每輪均
表3-1、基改抗胡瓜嵌紋病毒番茄轉殖基因放大選殖引子 Table 3-1. Primers for cloning transgenic DNA of GM tomato
Primer name Sequence 5’-3’
35S F CCACAGATGGTTAGAGAGGCTTAC 35S R GGCCTTTGATTCAGTGGGAACTACCTTT CMVCP F CTGATATTGGCGACATGCGAAAGT CMVCP QF ACAATCCCACTATCCTTCGCAAGA CMVCP QR AGAGAAAACACACAGCACGGTACT CMVCP R TTCAAAGGCACCTCAGAGACTTGT CMVCP R2 AGTCTACTGGCATGGATTTCTCCA
Inv Fnn AACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGG LB F TCCAAACTGGAACAACACTCAACC
LB F3 TTCCCCGTCAAGCTCTAAAT
LB R GGTGTAAACAAATTGACGCTTAGAC LB R2 CCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTA LB R3 AGACGGGCAACAGCTGATTG LB R4 AGAGAGTTGCAGCAAGCGGT nosP F TTTAAACTGAAGGCGGGAAACG nosP F2 CGTCAGAAACCATTATTGCG
nosP F3 GAGAATTAAGGGAGTCACGTTATGACCC nosP F4 ATCATGAGCGGAGAATTAAGGGAG nosP R GAATTTATGGAACGTCAGTGGAGC nosT F CGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTT nosT F2 TTCACTGGCCGTCGTTTTACAA nosT F3 AAAACCCTGGCGTTACCCAA nosT F4 TTCACTGGCCGTCGTTTTACAA nosT F5 GTCCCGCAATTATAAGATCG nosT R GGCCGTTGCTGTCGTAATGAT nosT R3 TTGTAAAACGACGGCCAGTGAA nosT R4 GTGCGGGCCTCTTCGCTATT nptII F GTTCCTTGCGCAGCTGTGCTC nptII F3 GATGATCTCGTCGTGACCCATGGC
(A)
(B)
圖3-4、抗胡瓜嵌紋病毒番茄轉殖基因片段圖譜。
Fig. 3-4. Transgene construct of GM tomato.
CaMV 35S promoter
CaMV 35S promoter 5509 bp
nptII
CMV Taiwan coat protein NOS promoter
NOS terminator NOS terminator
T-RB T-LB
5130 bp nptII
CMV Taiwan coat protein
Inv Rnn
表3-2、Flanking sequence 選殖所用的探針及引子
Table 3-2. Primers and probes used for flanking sequence cloning
Oligo ID Sequence 5’-3’
Inv F2 GCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTT Inv Fn2 GGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTA
Inv Fnn AACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGG Inv R2 CGCGCAATAATGGTTTCTGACGTATGTGCT Inv Rn2 TGCGGTTCTGTCAGTTCCAAACGTAA Inv Rnn CAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTT
dNTPs、0.2 μM primers、1X Advantage○R 2 DNA polymerase mix 以及 100 ng template 選合適片段進行TA cloning (Yeastern Biotech Co., Ltd., Taipei，Taiwan) 並分析比對 DNA 序列。
(二) 以 Inverse PCR 選殖轉殖基因鄰近序列
利用取得的抗胡瓜嵌紋病毒番茄轉殖基因序列進行限制酶切位分析，以選出適當 的限制酶種類。經分析後選擇限制酶 BamHI、KpnI 以及 EcoRI，取 2-5 μg 染色體 DNA 依據限制酶提供廠商說明進行剪切。以 QIAquick Nucleotide Removal 試劑套組 (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) 回收剪切過的染色體 DNA 片段。將剪切過的染色 體 DNA 片段，以 T4 DNA ligase 於 4oC 下作用 12-16 h。以 QIAquick Nucleotide
(A)
5’ (forward) 3’ (reverse) PvuII
5’ (forward) 3’ (reverse) PvuII
DraI EcoRV
StuI PvuII
，再接著以95oC 30 sec–60oC 4 min 45 sec 進行 20 個循環，最後以 68oC 反應 10 min。PCR 產物經電泳分析後如圖 3-6 所示，有多種大小不同的 PCR 產物片段產 生，挑選合適片段進行TA cloning 並分析比對 DNA 序列。
(三) 以 TAIL-PCR 選殖轉殖基因 3’ 與 5’ 端序列
TAIL-PCR 法是以特殊設計的隨機引子搭配已知基因序列引子，利用
PCR 過程中不同引子對之間的效率差異，經過二到三輪的巢式 PCR (nested
PCR) 後可以將未知序列區域進行放大。TAIL-PCR 本研究採用 APAgeneTM
genome walking 試劑套組 (Bio S&T Inc., Montreal, Canada) 進行 TAIL-PCR，第一 輪PCR 反應配方為：APAgeneTM Buffer 5.0 μL、DRT (degenerated random tagged) primer/dNTP mix D1 (D2) 7.0 μL、 APAgeneTM enzyme mix 0.6 μL、Inv F2 or R2 (20 μM) 1.0 μL 以及染色體 DNA 1.4 μL，反應總體積為 15 μL。第一輪 PCR 產物稀釋 50 倍 之 後 進 行 第 二 輪 PCR ， 反 應 配 方 為 ： APAgeneTM Buffer 5.0 μL、DRT primer/dNTP mix T1 (T2) 7.0 μL、APAgeneTM enzyme mix 0.4 μL、Inv Fn2 or Rn2 (20 μM) 1.0 μL 以及 template DNA 1.0 μL，反應總體積為 15 μL。第二輪 PCR 產物稀 釋 50 倍之後進行第三輪 PCR，反應配方為：APAgeneTM Buffer 5.0 μL、DRT primer/dNTP mix T1 (T2) 7.0 μL、APAgeneTM enzyme mix 0.4 μL、Inv Fnn or Rnn (20 μM) 1.0 μL 以及 template DNA 1.0 μL，反應總體積為 15 μL，PCR 條件如表 3-3 及 3-4 所示。第一及第三輪 PCR 產物經電泳分析後如圖 3-7 所示，有多種 PCR 產物 片段產生，挑選合適片段進行TA cloning 並分析比對 DNA 序列。
(四) 選殖片段的確認
本研究經由三種選殖方法所產生的 PCR 產物片段 (圖 3-8) ，進行切膠純化
圖3-6、Inverse PCR 產物電泳分析。
Fig. 3-6. Inverse PCR products.
Ad2: Advantage○R 2 polymerase mix.
Excel: Excel DNA polymerase.
Bam
1st round PCR 2nd round PCR
Ad2 Excel Ad2 Excel
14 kb
表3-3、第一輪 TAIL-PCR 條件
Table 3-3. Program of first round TAIL-PCR
表3-4、第二及第三輪 TAIL-PCR 條件
Table. 3-4. Program of second and third round TAIL-PCR
圖3-7、TAIL-PCR 產物電泳分析。
Fig. 3-7. TAIL-PCR products.
M: DNA ladder.
F: PCR products generated using forward primers.
F R R F
M M M
1st round PCR 3rd round PCR 3rd round PCR
Primer set D2/T2
14 kb
圖3-8、三種不同的選殖方法所產生的最終 PCR 產物電泳分析。
Fig. 3-8. Final PCR products of 3 different cloning methods.
14 kb
750 bp 2.5 kb 4 kb
1.5 kb 1 kb
500 bp
250 bp
GenomeWalker GenomeWalker Inverse PCR TAIL PCR
表3-5、以三種不同選殖方法所得部分 PCR 產物序列進行 Blastn 比對分析結果 Table 3-5. Part of Blastn results of PCR product sequences from 3 different cloning methods
Seq. ID. Possible seq. (Blastn) Method§
101 Tomato IGS (5S-18S) GW
108 Unknown GW
106 Pseudomonas spp. related sequence GW
82* Transgenic DNA (RB) + tomato genomic DNA homologues TAIL 78* Transgenic DNA (LB) + unknown TAIL
7 Unknown GW
79* Transgenic DNA (LB) + unknown TAIL 93* Transgenic DNA (RB) + tomato genomic DNA homologues TAIL 77* Transgenic DNA (LB) + unknown TAIL 84* Transgenic DNA (RB) + tomato genomic DNA homologues TAIL 74 Transgenic DNA (LB) + unknown TAIL 83* Transgenic DNA (RB) + tomato genomic DNA homologues TAIL
71 Plasmid backbone TAIL
86* Transgenic DNA (RB) + tomato genomic DNA homologues TAIL 87* Transgenic DNA (RB) + tomato genomic DNA homologues TAIL 16 Transgenic DNA (RB) + tomato genomic DNA homologues GW
92 Tomato chloroplast DNA TAIL
18 Human DNA homologues GW
91* Transgenic DNA (RB) + tomato genomic DNA homologues TAIL
26 Human DNA homologues GW
14 Tomato IGS (5-18S) GW
28 Bacterial DNA seq. GW
47 Human DNA homologues GW
88* Transgenic DNA (RB) + tomato genomic DNA homologues TAIL 80* Transgenic DNA (RB) + tomato genomic DNA homologues TAIL 89* Transgenic DNA (RB) + tomato genomic DNA homologues TAIL 73 Transgenic DNA (LB) + tomato genomic DNA homologues TAIL
56 Pseudomonas spp. related sequence GW
49 Unknown GW
97 Tomato IGS (5-18S) TAIL
序列。 總體積為50 μL，其中含有 1X Super-therm GOLD PCR buffer、0.2 mM dNTPs、0.2 μM primers、5 U Super-therm GOLD polymerase 以及 100 ng template DNA。PCR 反應溫 度為95oC 12 min，接著以 95oC 30 sec–60oC 1 min 進行 35 個循環，最後以 70oC 反應 10 min。PCR 產物經由定序之後確認 R8ES F/R 引子對具有品系專一性，可以用來分 辨基改番茄R8 及其宿主品系 L4783。
(六) 即時定量 PCR 檢測系統的建立 1. 探針設計與內源性基因的選擇
即時定量 PCR 的探針和引子是使用 Pirner Express 5.0 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 進行設計。由於橫跨轉殖基因片段與番茄染色體 DNA 片段交 界附近的序列相當的AT-rich (GC％= 35.4) ，因此在設計 TaqMan 探針時必須採用 MGB (minor groove binder) 作為 quencher 以提高探針的 Tm 值。參考前人文獻 (Chaouachi et al., 2008) 選擇以 β-fructosidase 作為即時定量 PCR 的內源性基因。
由於文獻中所設計的引子在本研究室所使用的系統中有嚴重的dimer 問題，因此另
圖3-9、Inverse PCR 產物 DNA 序列 (#111) 。 Fig. 3-9. Inverse PCR product #111.
T-LB nearby(5127-5299) T-RB boundary
Tomato genomic DNA
Plasmid backbone homologues
Ti plasmid homologues
Ti plasmid homologues
RB side LB side
INV Rnn INV Fnn
T-LB nearby(5127-5299) T-RB boundary
Tomato genomic DNA
Plasmid backbone homologues
Ti plasmid homologues
Ti plasmid homologues
RB side LB side
INV Rnn INV Fnn
(A)
(B)
圖3-10、基改抗胡瓜嵌紋病毒 R8 番茄的轉殖基因以及 flanking sequence。
Fig. 3-10. Flanking sequence and transgene construct of GM tomato R8.
(A) Flanking sequence of GM tomato R8. Underline: transgenic sequence. R8ES F/R and MGB: position of event-specific primer and probe, respectively. ▼：the junction of transgenic and genomic DNA; (B) T-DNA construct and primer design. gDNA: genomic DNA RB and LB, right and left T-DNA border, Pnos, nopaline synthase promoter; nptII, neomycin phosphoesterase II; Tnos, nopaline synthase terminator; P35S, Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter; cmvcp, Cucumber Mosaic Virus coat protein gene.
表3-6、即時定量聚合酶鏈反應所用的探針及引子 Table 3-6. Primers and probes used for real-time PCR
Oligo ID Sequence 5’-3’ Target
R8ESF CGCTCATGATCAGATTGTCGTT
GM R8 tomato event-specific
sequence R8ESR AATGATTTTTCTAATAGTTGGAAGGGAA
R8ES MGB FAM-AACTATCAGTGTTTGAACTAT-MGB ToF GTATCACAAGGGATGGTACCAC
Tomato β-fructosidase gene ToR ATACAGCATGGCCCCATGTGATAT
To MGB VIC-TCCAGATTCAGCTATTTG-MGB
後，經由熱休克法 (Sambrook and Russell, 1989) 轉入 E. coli JM109 (勝任細胞 ECOS 9-5, Yeastern Biotech Co., Ltd.) 進行保存。質體經過定序確認後，以質體抽取 試劑套組 (EasyPure Plasmid DNA Miniprep kit, Bioman Scientific Co.,Ltd) 進行抽 取，質體樣品在測定DNA 濃度之後由下列公式 (Arumeganathan and Earle, 1997) 推 算 出 一 個 copy 的 質 體 DNA 重 量 ( 約 為 3.18×10-9 pg) 與 質 體 濃 度 Universal PCR Master Mix 試劑 (Life Technologies) ，最適化引子濃度為 200 nM，
探針濃度為50 nM，總反應體積為 20 μL。即時定量 PCR 以 ABI Prism® 7700 即時
圖3-11、TA cloning 質體 pyT&A 圖譜。
Fig. 3-11. Map of TA cloning vector pyT&A.
p
圖3-12、SYBR Green 與 TaqMan/MGB 即時定量 PCR 原理簡圖 (Gasparic et al., 2010) 。 Fig. 3-12. Principle of SYBR Green and TaqMan/MGB real-time PCR systems.
Green molecules: Fluorescent reporter dye.
Red molecule: Quencher/dark dye.
Yellow molecules: Taq DNA polymerase.
此 無 螢 光 訊 號 。 在 PCR 進 行 個 過 程 當 中 由 於 DNA polymerase 的 5’-3’exonuclease 活性而使得探針被分解，螢光染劑吸收的激發能量不再轉移 至 quencher 分子，因此放出螢光訊號並藉此測定 PCR 增幅的進行 (圖 3-12) 。 LOD) 的測定數值其 relative standard deviation of repeatability (RSDr) 必須要小於 33%，而定量極限 (limit of quantification, LOQ) 的測定數值其 relative standard deviation of reproducibility (RSDR) 必須小於 25％，RSDr與RSDR的計算如下列公 1997) 。 首 先 以 Plant Genomic DNA Purification （ Hopegen Biotechnology Development Enterprises, Taichung, Taiwan）試劑套組抽取基改番茄 R8 及非基改番
min 後，以 wash solution 清洗 spin column 兩次，最後以 12,000 ×g 離心 3 min 除 以GeneMark Plant genomic DNA extraction kit 抽取 DNA，並進行 0.8% agarose 膠體 電泳分析、DNA 定量以及定性/定量 PCR 分析。DNA 定量使用 DNA 螢光染劑定量 試劑套組 DNAQF DNA Quantitation kit (Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA) 以及
均3 重覆。即時定量 PCR 以 ABI Prism® 7700 即時定量 PCR 裝置進行反應，反應條 件為先進行95oC 10 分鐘，再以 95oC 15 秒- 60oC 1 分鐘為一循環，共進行 40 個循環。
3-3 結果
(一) 轉殖基因鄰近序列選殖與確認
本研究經由3 種不同方法進行選殖，在相互比對校正後得到了 956 bp 的轉殖基 因鄰近序列 (圖 3-10) ，DNA 序列如附錄五。為確認選殖片段的正確性，對基改番茄 R8 及其宿主品系 L4783 番茄 DNA 進行 PCR 放大。引子對設計採用橫跨轉殖基因 片段與番茄染色體DNA 片段交界 (junction) 的方式 (圖 3-10) ，並將產物大小限制 在150 bp 以下以滿足品系專一性即時定量 PCR 的需求。結果如圖 3-13 所示，PCR 產 物經由定序之後確認 R8ES F/R 引子對具有品系專一性，可以用來分辨基改番茄 R8 及其宿主品系L4783。
(二) 即時定量 PCR 檢測系統建立
TaqMan 系統的品系專一性 (pR8ES) 以及內源性基因 (pTo) 的參考質體的即時 定量PCR 濃度標準曲線和放大曲線如圖 3-14 及 3-15。兩種參考質體的即時定量 PCR 濃度標準曲線都具有良好的線性 (R2 >0.99) ，可作為定量的依據。經由獨立三次、每 次均三重複的試驗，品系專一性以及內源性基因的SYBR Green 即時定量 PCR 系統 對於參考質體標準曲線的測定結果如表3-7 及表 3-8。本研究所建立的 SYBR Green 偵 測系統RSDR最高為24.98％，根據 Codex 所提出的原則 (Codex, 2001) ，偵測極限 (limit of detection, LOD) 的測定數值其 relative standard deviation of repeatability (RSDr) 必須要小於 33%，而定量極限 (limit of quantification, LOQ) 的測定數值其 relative standard deviation of reproducibility (RSDR) 必須小於 25％，因此得知，參考質體標準
圖3-13、品系專一性引子測試。
Fig. 3-13. Specificity test of GM tomato R8 event-specific primers.
+: Amplification of GM tomato R8.
- : Amplification of WT tomato L4783.
+ -
100 bp 200 bp 300 bp400 bp600 bp500 bp
1 kbp 3 kbp
(A)
(B)
圖3-14、品系專一性 TaqMan 即時定量聚合酶鏈反應定量系統放大曲線和標準曲線。
Fig. 3-14. Amplification and standard curve of event-specific TaqMan real-time PCR detection method
(A)
(B)
圖3-15、番茄內源性基因 TaqMan 即時定量聚合酶鏈反應定量系統放大曲線和標準曲線。
Fig. 3-15. Amplification and standard curve of TaqMan real-time PCR detection method for reference gene
表3-7、品系專一性 SYBR Green I 即時定量聚合酶鏈反應放大參考質體標準曲線的重復性及 再現性
Table 3-7. Repeatability and reproducibility of reference plasmid standard curves of event-specific SYBR Green real-time PCR
True copies RSDr, %
Mean copies RSDR, % 1st 2nd 3rd
5 7.97 5.78 7.28 5.03 24.98
50 1.21 2.62 0.23 60.12 18.98
500 1.18 0.32 3.25 671.98 11.44 5000 0.68 1.15 0.80 4586.28 8.23 50000 0.18 2.10 0.55 32722.01 7.13 500000 0.56 0.19 1.11 701154.55 0.83 5000000 0.10 0.21 0.16 3294278.65 1.83 RSDr: relative standard deviation of repeatability.
RSDR: relative standard deviation of reproducibility.
表3-8、內源性基因 SYBR Green 即時定量聚合酶鏈反應放大參考質體標準曲線的重復性及再 現性
Table 3-8. Repeatability and reproducibility of reference plasmid standard curves of endogenous gene SYBR Green real-time PCR
RSDr, %
True copies 1st 2nd 3rd Mean copies RSDR, %
5 3.08 2.70 6.95 5.31 13.40
50 2.24 2.38 0.84 32.44 8.58
500 0.92 0.51 1.24 666.89 4.29
5000 0.45 0.31 0.44 5165.40 4.64 50000 0.36 0.51 0.55 54476.03 5.81 500000 0.41 0.24 0.12 446178.17 4.34 5000000 0.31 0.37 0.10 1769325.71 2.85 RSDr: relative standard deviation of repeatability.
RSDR: relative standard deviation of reproducibility.
表3-9、品系專一性 SYBR Green 即時定量聚合酶鏈反應定量系統的重復性及再現性 Table 3-9. Repeatability and reproducibility of event-specific SYBR Green real-time PCR assay
True GM value, %
Accuracy
Trueness Precision Mean value, % Bias, % RSDr, % RSDR, %
0.00 0.00 0.00 - -
0.10 0.12 20.18 0.02 15.86
0.50 0.55 10.00 0.11 20.71
1.00 1.01 1.07 0.07 7.23
5.00 5.62 12.40 0.05 2.50
10.00 11.37 13.70 0.35 6.45
RSDr: relative standard deviation of repeatability.
RSDR: relative standard deviation of reproducibility.
表3-10、品系專一性 TaqMan 即時定量聚合酶鏈反應定量系統的重復性及再現性 Table 3-10. Repeatability and reproducibility of event-specific TaqMan real-time PCR assay
True GM value, %
Accuracy
Trueness Precision Mean value, % Bias, % RSDr, % RSDR, %
Trueness Precision Mean value, % Bias, % RSDr, % RSDR, %