第二章 基改抗胡瓜嵌紋病毒番茄過敏性評估
2. 新表現蛋白質的含量及表現位置
胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白於基改番茄中的表現量相當低，無法以Western blot 方式 偵測，以胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白單株抗體進行 ELISA 分析結果顯示胡瓜嵌紋病毒鞘 蛋白表現量低於 0.0016% 的總蛋白 (Lin et al., 2010) 。由 RT-qPCR 分析不同時期 基改R8 番茄中轉殖基因的表現量，結果如圖 2-6 所示，相較於 selection maker nptII 基因，cmvcp 的 mRNA 表現量相當高，可以達到 housekeeping gene (β-tubulin) 的 50-60％。雖然始花時期的 cmvcp mRNA 表現量較低，但是經由 REST 2009 軟體進 行統計分析發現基改番茄轉殖基因在不同生長時期之間的表現量並沒有顯著差異 (圖 2-7) 。
(二) 序列搜尋比對
搜尋比對結果胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白胺基酸序列與已知過敏原無任何顯著相似 性。各資料庫搜尋中，相似度最高的的過敏原如表2-3 所示。其中整體序列相似度 (full FASTA) 最高的為 Der p 8 以及 Der p 15 (均為 40.47%)，其 E score 均為 3.5，遠高於 1 × 10-7 的判定標準。而 80 mer amino acid FASTA alignment 搜尋與滑動連續胺基酸 片段搜尋結果也都無顯著相似的過敏原記錄。由上述結果可得知，依據現行基因改造 作物過敏性評估判定標準，基因改造番茄中的胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白並無顯著的過敏原
圖2-6、不同時期基改 R8 番茄中轉殖基因的表現量。
Fig. 2-6. Expression level of transgenic genes in the different growth stages of GM tomato R8.
R8: 4-6 true leaf stage. R8-F: flowering stage. R8-G: green fruit stage. R8-T: turning fruit stage.
CMVCP: CMV coat protein gene. nptII: neomycin phosphotransferase II gene.
R8-R R8-G R8-F R8
Relative expression to β-tubulin
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
CMVCP nptII
*
T
Results
Gene Type Reaction Efficiency Expression Std. Error 95% C.I. P (H1) Result
bTub REF 0.9932 1.000
CMVCP TRG 0.9859 0.923 0.721 - 1.446 0.453 - 1.481 0.641
*P (H1) - Probability of alternate hypothesis that difference between sample and control groups is due only to chance.
TRG - Target REF – Reference
Interpretation
CMVCP sample group is not different to control group. P (H1) =0.641
Non-Normalised Results
The following results do not have expression values normalised to the selected housekeepers.
Gene Type Reaction Efficiency Expression Std. Error 95% C.I. P (H1) Result bTub REF 0.9932 1.456 0.838 - 2.579 0.772 - 3.131 0.057
CMVCP TRG 0.9859 1.344 0.911 - 2.034 0.723 - 2.316 0.058
Report produced by REST 2009
© Corbett Research, 2009
圖2-7、始花時期基改 R8 番茄中 cmvcp 表現量的 REST 軟體統計分析結果。
Fig. 2-7. Expression level analysis of Cmvcp gene in the different growth stages of GM tomato R8 using REST software.
表2-3、胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白的過敏原資料庫搜尋比對結果
Table 2-3. Most relevant records of similarity search of allergen protein sequence
Allergen
name Organism Accession
no. Database
>0.01 Venom allergen 5.01 Cla h 4 Davidiella tassiana P40918 AO
Der p 15 Dermatophagoides pteronyssinus
>0.01 α-amylase/trypsin inhibitor
Cyp c 1.01 Cyprinus carpio
(common carp) CAC83658 SD 8.72 >0.01 Parvalbumin Ani s 4 Anisakis simplex
(Herring worm) P16347 AO 34.21 3.8 Allergen
*Database: “AO”=AllergenOnline, “SD”=SDAP.
# E score < 1 x 10-7 indicates significant homology for AllergenOnline database.
圖2-8、重組胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白純化。
Fig. 2-8. Purification of rCMV cp.
(A) SDS-PAGE analysis of rCMV cp expressed in E. coli. Lane 1: no IPTG induction. Lane 2:
1 mM IPTG induction. Lane 3: inclusion bodies; (B) Purified rCMV cp. Lane 1: supernatant of IBs solution after dilution. Lane 2: purified rCMV cp. Lane 3: Western blot analysis of rCMV cp.
2004) 的 rCMVCP，蛋白總回收量為 2.08 mg。純化後的 rCMVCP 進行 SDS-PAGE 分 析並轉印至PVDF 膜進行 LC/MS/MS 的分析鑑定結果如圖 2-9 (A) 。經由資料庫搜 尋比對後最高符合的蛋白質紀錄為CMVCP (gi 62910853) ，比對分數為 625 (>42 為 顯著) ，序列涵蓋率為 65%。蛋白質 N 端定序分析結果如圖 2-9 (B) 。經由 4 個水解 循環之後定出rCMVCP 的 N 端前四個胺基酸依序為 MDKS，符合資料庫中 CMVCP 的蛋白質序列。結合上述的兩項結果，約有67％ 的胺基酸序列與 native CMVCP 相 同，以目前的蛋白質鑑定及胺基酸定序技術來說，可以確定rCMVCP 與 CMVCP 具 有等同性，因此本研究所純化生產的重組CMVCP 可用於模擬胃液消化分析。
(四) 模擬胃液消化試驗
實驗結果如圖2-10。圖 2-10 (A) 為 BSA 蛋白的模擬消化液試驗結果，BSA 蛋 白被SGF 快速分解成小片段，並且在 2 min 內完全消失，符合 BSA 容易被模擬消化 液分解的特性。圖2-10 (B) 為大豆胰蛋白酶抑制因子 (soy trypsin inhibitor，STI) 蛋 白的模擬消化液試驗結果，由結果可以得知STI 蛋白在反應 60 min 後依然未被 SGF 分解消化，符合 STI 具有抵抗模擬消化液分解的特性。由上述二結果確立本研究所 使用的模擬消化液試驗方法可正確的試驗出樣品蛋白質是否具有抗模擬消化液分解 的特性。rCMVCP 模擬消化液試驗結果如圖 2-11，由結果得知 rCMVCP 蛋白可被 SGF 快速分解成小片段，並且在 30 秒內完全消失，與具有易被模擬消化液分解特性之 BSA 相同，因此本研究認為 rCMVCP 並不具有過敏原蛋白常有的耐模擬胃液分解特 性，也就是rCMVCP 不具有顯著的過敏誘發性。
(A)
(B)
(A)
(B)
圖2-10、模擬胃液正負控制組試驗結果。
Fig. 2-10. Results of SGF positive and negative control test.
(A) Pepsin-susceptible control. BSA: bovine serum albumin; (B) Pepsin-resistant control.
M 0 0.5 2 5 10 20 30 60 C
(A)
(B)
rCMV cp
3 10 20 25 37
M C 0 0.5 2 5 10 30 kDa
kDa
2-5 討論
(一) 基改抗胡瓜嵌紋病毒番茄過敏誘發性評估
以胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白胺基酸序對AllergenOnline、SDAP 和 ADFS 過敏原資料 庫進行 80 mer amino acid FASTA alignment 搜尋、滑動連續胺基酸片段搜尋和 full FASTA overall search 搜尋比對，實驗結果顯示，基改番茄中的胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白胺 基酸序列與已知過敏原蛋白胺基酸序列無顯著的相似性。針對不同時期的基改R8 番 mediated protection, CP-MR) ，應該不是來自於 post-transcriptional gene silencing (PTGS, Marcel et al., 2008; Morroni et al., 2008) 。由於基改番茄中的胡瓜嵌紋病毒鞘 蛋白含量很低，如欲自基改番茄中純化1 g 的胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白進行模擬消化液等
(二) 綜合安全性評估結果
第三章 品系專一性即時定量聚合酶鏈反應檢測系統之建立與
率。三種選殖方法分別為GenomeWalkerTM 試劑套組 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) 、Inverse PCR (Hui et al., 1998) 以及 thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR;Weissensteiner et al., 2004)。Genome walking 法是將染色體 DNA 利用限制酶剪切成較小 的片段，將具有特別設計的adaptor DNA 片段以 T4 DNA ligase 接合於剪切過的染色體
圖3-2、Inverse PCR 原理簡圖 (Hui et al., 1998) 。 Fig. 3-2. Principle of Inverse PCR.
間基因交換 (gene transfer between species) (Heinemann，1991)、跨界接合生殖 (transkindom conjugation) (Heinemann and Sprauge, 1989) 以 及 細 菌 的 自 然 轉 型 (nature genetic transformation) (Lorenz and Wackernagel, 1994) 等機制，其中細菌的自然轉型被認為最有可 能與基改作物基因水平轉移現象有關，而跨界接合生殖有可能進一步的散佈基因片段，產 生安全性風險。許多研究顯示植物DNA 大部分會在動物的消化道中分解，只有高 copy 數 的基因例如葉綠體基因被發現吸附在小腸壁、Peyer’s Patches (Einspanier et al., 2001) 或 是出現在血液中 (Schubbert et al., 1997) 。但也有研究顯示基改黃豆及玉米的轉殖基因序
CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) 法：DNA 之抽取與純化採用 Lipp 等人在 1999 年所發表之 CTAB 法 (Lipp et al., 1999) 。取 50 mg 基改番茄樣品，
加入 65oC 預熱之 CTAB 萃取溶液 (含有 CTAB 20 g/L、1.4 M NaCl、0.1 M Tris/HCl 與20 mM EDTA) 500 µL 於 65℃反應 30 分鐘，再以 12,000×g 離心 10 分鐘，取 上層液; 加入 CI (chloroform:isoamylalcohol = 25:1) 200 µL 萃取後，以 11,500×g 離心 10 分鐘; 上層溶液，加入 2 倍體積的 CTAB 沉澱溶液 (CTAB 5 g/L 與 0.04 M
2. 基改抗胡瓜嵌紋病毒番茄轉殖基因定序
由GenBank 資料庫搜尋取得質體 pBI121 (accession no. AF485783) 以及胡瓜 嵌紋病毒鞘蛋白基因 (accession no. D49496) 序列。由 GenBank 資料庫搜尋取得質 體pBI121 (accession no. AF485783) 以及胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白基因 (accession no.
D49496) 序列。依據所取得的基因序列資料，設計引子對進行基改抗胡瓜嵌紋病毒 番茄轉殖基因的放大選殖，最後共設計33 條引子 (表 3-1) 。經由反覆測試後，序 列以Vector NTI 9.0 軟體 (Invitrogen) 進行比對組合，可被放大選殖並定序的範圍 如圖 3-4，DNA 序列如附錄四。由於轉形過程中轉殖基因常發生隨機的截短 (truncation) 或重排 (rearrangement) 等事件，因此無法放大選殖的部分將當作未知 序列進行釣取。根據定序的結果，設計 3 組反向巢式引子對 (表 3-2) 用於轉殖基 因鄰近序列釣取。
3. 選殖轉殖基因鄰近序列
以試劑套組所提供四種限制酶：DraI、EcoRV、StuI 以及 PvuII 於 37oC 下反 應隔夜將染色體DNA 切成較小的片段後，加入試劑套組所提供的 adaptor DNA 片 段並以T4 DNA ligase (New England Biolabs，Ipswich，MA，USA) 於 4oC 下反應 隔夜以接合剪切過的染色體DNA，製備成為 DNA library。再利用先前所取得的抗 胡 瓜 嵌 紋 病 毒 番 茄 轉 殖 基 因 序 列 設 計 引 子 (表 3-2) ，與泛用引子搭配進行 nested-PCR 釣取轉殖基因鄰近序列。將製備完成的 DNA library 以試劑套組所提供 的引子AP1 分別搭配反向引子 Inv F2 及 Inv R2 進行 5’及 3’ 端序列的第一輪 PCR 放大，PCR 產物再以試劑套組所提供的引子 AP2 分別搭配反向引子 Inv Fn2 及 Inv Rn2 進行 5’及 3’ 端序列的第二輪 PCR 放大，第二輪 PCR 產物再以引子 AP2 分別 搭配反向引子Inv Fnn 及 Inv Rnn 進行 5’及 3’ 端序列的第三輪 PCR 放大，每輪均
表3-1、基改抗胡瓜嵌紋病毒番茄轉殖基因放大選殖引子 Table 3-1. Primers for cloning transgenic DNA of GM tomato
Primer name Sequence 5’-3’
35S F CCACAGATGGTTAGAGAGGCTTAC 35S R GGCCTTTGATTCAGTGGGAACTACCTTT CMVCP F CTGATATTGGCGACATGCGAAAGT CMVCP QF ACAATCCCACTATCCTTCGCAAGA CMVCP QR AGAGAAAACACACAGCACGGTACT CMVCP R TTCAAAGGCACCTCAGAGACTTGT CMVCP R2 AGTCTACTGGCATGGATTTCTCCA
Inv Fnn AACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGG LB F TCCAAACTGGAACAACACTCAACC
LB F3 TTCCCCGTCAAGCTCTAAAT
LB R GGTGTAAACAAATTGACGCTTAGAC LB R2 CCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTA LB R3 AGACGGGCAACAGCTGATTG LB R4 AGAGAGTTGCAGCAAGCGGT nosP F TTTAAACTGAAGGCGGGAAACG nosP F2 CGTCAGAAACCATTATTGCG
nosP F3 GAGAATTAAGGGAGTCACGTTATGACCC nosP F4 ATCATGAGCGGAGAATTAAGGGAG nosP R GAATTTATGGAACGTCAGTGGAGC nosT F CGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTT nosT F2 TTCACTGGCCGTCGTTTTACAA nosT F3 AAAACCCTGGCGTTACCCAA nosT F4 TTCACTGGCCGTCGTTTTACAA nosT F5 GTCCCGCAATTATAAGATCG nosT R GGCCGTTGCTGTCGTAATGAT nosT R3 TTGTAAAACGACGGCCAGTGAA nosT R4 GTGCGGGCCTCTTCGCTATT nptII F GTTCCTTGCGCAGCTGTGCTC nptII F3 GATGATCTCGTCGTGACCCATGGC
(A)
(B)
圖3-4、抗胡瓜嵌紋病毒番茄轉殖基因片段圖譜。
Fig. 3-4. Transgene construct of GM tomato.
CaMV 35S promoter
CaMV 35S promoter 5509 bp
nptII
CMV Taiwan coat protein NOS promoter
NOS terminator NOS terminator
T-RB T-LB
5130 bp nptII
CMV Taiwan coat protein
Inv Rnn
表3-2、Flanking sequence 選殖所用的探針及引子
Table 3-2. Primers and probes used for flanking sequence cloning
Oligo ID Sequence 5’-3’
Inv F2 GCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTT Inv Fn2 GGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTA
Inv Fnn AACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGG Inv R2 CGCGCAATAATGGTTTCTGACGTATGTGCT Inv Rn2 TGCGGTTCTGTCAGTTCCAAACGTAA Inv Rnn CAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTT
dNTPs、0.2 μM primers、1X Advantage○R 2 DNA polymerase mix 以及 100 ng template 選合適片段進行TA cloning (Yeastern Biotech Co., Ltd., Taipei，Taiwan) 並分析比對 DNA 序列。
(二) 以 Inverse PCR 選殖轉殖基因鄰近序列
利用取得的抗胡瓜嵌紋病毒番茄轉殖基因序列進行限制酶切位分析，以選出適當 的限制酶種類。經分析後選擇限制酶 BamHI、KpnI 以及 EcoRI，取 2-5 μg 染色體 DNA 依據限制酶提供廠商說明進行剪切。以 QIAquick Nucleotide Removal 試劑套組 (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) 回收剪切過的染色體 DNA 片段。將剪切過的染色 體 DNA 片段，以 T4 DNA ligase 於 4oC 下作用 12-16 h。以 QIAquick Nucleotide
(A)
5’ (forward) 3’ (reverse) PvuII
5’ (forward) 3’ (reverse) PvuII
DraI EcoRV
StuI PvuII
，再接著以95oC 30 sec–60oC 4 min 45 sec 進行 20 個循環，最後以 68oC 反應 10 min。PCR 產物經電泳分析後如圖 3-6 所示，有多種大小不同的 PCR 產物片段產 生，挑選合適片段進行TA cloning 並分析比對 DNA 序列。
(三) 以 TAIL-PCR 選殖轉殖基因 3’ 與 5’ 端序列
TAIL-PCR 法是以特殊設計的隨機引子搭配已知基因序列引子，利用
PCR 過程中不同引子對之間的效率差異，經過二到三輪的巢式 PCR (nested
PCR) 後可以將未知序列區域進行放大。TAIL-PCR 本研究採用 APAgeneTM
genome walking 試劑套組 (Bio S&T Inc., Montreal, Canada) 進行 TAIL-PCR，第一 輪PCR 反應配方為：APAgeneTM Buffer 5.0 μL、DRT (degenerated random tagged) primer/dNTP mix D1 (D2) 7.0 μL、 APAgeneTM enzyme mix 0.6 μL、Inv F2 or R2 (20 μM) 1.0 μL 以及染色體 DNA 1.4 μL，反應總體積為 15 μL。第一輪 PCR 產物稀釋 50 倍 之 後 進 行 第 二 輪 PCR ， 反 應 配 方 為 ： APAgeneTM Buffer 5.0 μL、DRT primer/dNTP mix T1 (T2) 7.0 μL、APAgeneTM enzyme mix 0.4 μL、Inv Fn2 or Rn2 (20 μM) 1.0 μL 以及 template DNA 1.0 μL，反應總體積為 15 μL。第二輪 PCR 產物稀 釋 50 倍之後進行第三輪 PCR，反應配方為：APAgeneTM Buffer 5.0 μL、DRT primer/dNTP mix T1 (T2) 7.0 μL、APAgeneTM enzyme mix 0.4 μL、Inv Fnn or Rnn (20 μM) 1.0 μL 以及 template DNA 1.0 μL，反應總體積為 15 μL，PCR 條件如表 3-3 及 3-4 所示。第一及第三輪 PCR 產物經電泳分析後如圖 3-7 所示，有多種 PCR 產物 片段產生，挑選合適片段進行TA cloning 並分析比對 DNA 序列。
(四) 選殖片段的確認
本研究經由三種選殖方法所產生的 PCR 產物片段 (圖 3-8) ，進行切膠純化
圖3-6、Inverse PCR 產物電泳分析。
Fig. 3-6. Inverse PCR products.
Ad2: Advantage○R 2 polymerase mix.
Excel: Excel DNA polymerase.
Bam
1st round PCR 2nd round PCR
Ad2 Excel Ad2 Excel
14 kb
表3-3、第一輪 TAIL-PCR 條件
表3-3、第一輪 TAIL-PCR 條件