第四章 基改抗胡瓜嵌紋病毒番茄對於土壤微生物菌相影響評估
4. mRNA 表現量確認
蛋白質二維電泳分析結果中表現量有差異並確認身份的蛋白質共有 11 個，其
表5-3、確認蛋白二維電泳結果的基因定量用引子
Table 5-3. Primers used to confirm the results of protein 2-DE analysis
Primer ID Sequence 5’-3’ Target gene accession number Bip R GCCTCACCAATCAATCTCTCGTTATC
L08830 Bip F GGTGTACAAGAATGGTCATGTGGAGA
ClpA R CCCTCAGTGTAAGTGAAGATGATTGTGC
M32604 ClpA F TGGCTAGAGCTCTAGTTCAGTCAACAAG
OEE1 R GCCAACACCTCCTTCAATGGTAGG
Z11999 OEE1 F CGGAAGGAGTTCCAAAACGTTTAACC
OEE2 R CGGCAAATCAATTGGTTAGGCTTAGG
X63007 OEE2 F ATGGCTGCTTCCACACAATGTTTC
劑 (Bionovas) ，引子濃度為 200 nM，以 ABI StepOne® 即時定量 PCR 裝置進行反 應，反應條件為先進行95oC 10 分鐘，再以 95oC 15 秒- 60oC 1 分鐘為一循環，共進 行 40 個循環。每個時期的基改及非基改番茄 cDNA 測定相對應的基因表現量，每 個時期的基改及非基改番茄均測定 3 棵植株的樣品，每個基因的即時定量 PCR 反 應均為三重覆，housekeeping 基因為番茄的 β-tubulin 基因。基因表現量以目標基因 與 housekeeping 基因的ΔCt 值轉換為相對表現量表示。即時定量 PCR 數據先以 LinRegPCR 11.3 軟體計算各組引子的 PCR 效率進行顯著差異的分析。
(十) 轉殖基因嵌入位置鄰近基因的表現量分析
本研究於第三章選殖出轉殖基因嵌入位置的鄰近序列，經由 BLAST 搜尋資料庫 之後發現，轉殖基因嵌入位置在一功能未知的基因下游448 bp 處 (圖 5-3) ，此基因的 mRNA accession no.為 AK322797.1，與蓖麻的假定 stromal antigen 類似 (71%，E=
8e-55) ，屬於 cohesin 的類似蛋白，功能主要為有絲分裂時姊妹染色體間的 bonding，
使得姊妹染色體配對。AK322797.1 的序列與染色體的 DNA 序列比對的結果顯示此基 因可能不具有 intron。雖然實際的功能還不確定，但是由於轉殖基因序列嵌入位置在 AK322797.1 的基因下游，因此有必要針對 AK322797.1 在番茄植株體內的表現量進行 追蹤。本研究進一步針對AK322797.1 設計引子進行 RT-qPCR 測定其基因表現量，引 子序列為 AK322 F：5’-GTGCAGAT- GTTGCATGGTTGTTCAAK322-3’與 AK322 R：5’-CCAGAAACTGGAAGGC- CAACCT-3’。引子首先以基改與非基改番茄的 cDNA 進行即時定量 PCR 初步測試，確認所有引子在即時定量 PCR 的條件下有足夠 的PCR 效率、專一性及再現性。即時定量 PCR 的反應條件與數據分析與 cDNA 微陣 列分析部分相同。對每個時期的基改及非基改番茄 cDNA 測定 AK322797.1 基因表現 量，每個基因的即時定量PCR 反應均為三重覆，housekeeping 基因為番茄的 β-tubulin
圖5-3、AK322797.1 基因與轉殖基因序列的相對位置。
Fig. 5-3. Position of transgenic sequence and AK322797.1 gene.
1964 bp
AK322797.1 Transgenic sequence
Tomato genomic DNA
(十一) 花芽分化相關基因的表現量分析
在衛生署委託亞蔬中心所執行「抗胡瓜嵌紋病毒基因轉殖番茄之栽培與園藝 特性評估」 (林等，2008) 報告中指出基改番茄 R8 的開花及著果率較非基改番茄 低，偏向營養生長，有可能是因為轉殖基因過程中影響了花芽分化基因。植物的花 芽分化基因調控近年已漸漸的被解開，模式植物阿拉伯芥的花芽分化基因調控如圖 5-4。在番茄的花芽分化基因研究中，對應阿拉伯芥的重要花芽調控基因 FT (Flowering locus T) 、LFY (LEAFY/ FLORICAULA) 、AP3 (APETALA 3) 與 AG (AGAMOUS) 的基因已經被選殖出來。此外在番茄突變株篩選研究中所得到有關 花芽分化控制的SELF PRUNING 與 BLIND 基因的序列也已經被選殖出來，SELF PRUNING 與 BLIND 基因缺陷的番茄突變株表現型如圖 5-5。本研究針對這 6 個已 知與番茄花芽分化控制有關的基因，分析不同時期的基改與非基改番茄中花芽分化 基因的表現量，以確認基改與非基改番茄的花芽分化相關基因表現是否有顯著差 異。
首先依據從GenBank 資料庫取得的基因序列設計引子，分析的基因與引子序 列如表5-4。引子首先以基改與非基改番茄的 cDNA 進行即時定量 PCR 初步測試，
確認所有引子在即時定量 PCR 的條件下有足夠的 PCR 效率、專一性及再現性。
對每個時期的基改及非基改番茄 cDNA 測定花芽分化基因表現量，每個基因的即 時定量PCR 反應均為三重覆，housekeeping 基因為番茄的 GAPDH 基因。基因表 現量以目標基因與 housekeeping 基因的ΔCt 值轉換為相對表現量之後，以相對於 非基改番茄表現量的倍率表示。
圖5-5、與花芽分化相關的基因突變株番茄莖的生長與構成 (Szymkowiak and Irish，2006) 。 Fig. 5-5. Diagrammatic representation of shoot architecture of wild-type and mutant tomato.
Closed circles : axillary meristems. Open circles : flowers. Arrows : extend vegetative growth after flowering has commenced. ls: LATERAL SUPRESSOR. sp: SLEF PRUNING. j:
表5-4、番茄花芽分化相關基因定量用引子 Table 5-4. Primers used for tomato floral gene assay
Primer ID Sequence 5’-3’ Target
SP RTQR TGAGGAAGGAAAGAATTCATGTCCATT
SELF PRUNIG (GenBank AF426174) SP RTQF TCCAAAATGTGTGAACCCCTTGTG
Blind RTQF AAAAGAGGTCCATGGTCTCCAGAAGA
BLIND (GenBank AF275345) Blind RTQR CCTGCTTTTTGAGGAAGTGCAATCC
FT RTQF ATGCCTAGAGAACGTGATCCTCTTGTTG
FLOWERING LOCUS T (GenBank AF197934) FT RTQR GGCCTAAGCTCGCATCCATTATTAAC
LEAFY RTQF TTGTTCAAGTGGGACCCAAGAGGT
LEAFY/FLORICAULA (GenBank LEU84140) LEAFY RTQR GGTGGTGGTAGAGATGGAGGAGGTT
TAG1 RTQF AAGGATCGAAAACACGACGAATCG
TOMATO AGAMOUS (GenBank L26295) TAG1 RTQR GCAACCTCAGCATCACAGAGCACA
TAP3 RTQF GTCCCTCAATCACGACCAAACAATTG
TOMATO APETALA 3 (GenBank DQ674532) TAP3 RTQR CCTTTAGCTTCCTTAGCTGCTCTTGCAT
5-3 結果
(一) RNA 與 cDNA 微陣列品質確認
本研究所使用的番茄品種其代碼請參見表 5-1。部分 RNA 樣品的分析結果如圖 5-6，變性 agarose 電泳 (圖 5-6 (A) ) 或是毛細管電泳 (圖 5-6 (B) ) 的結果顯示 RNA 樣品28S 與 18S 條帶的比例接近 2：1，具有良好的完整度。在本研究中果實採收時期 的基改及非基改番茄植株的cDNA 微陣列分析採取 3 重複的方式，而 4-6 片真葉時期 的 10 種番茄則各進行一片 cDNA 微陣列晶片分析。cDNA 微陣列的原始影像如圖 5-7，根據影像中晶片名稱 (左上角) 、四個角落的棋盤圖案、中央的控制區以及晶片 邊緣虛線的完整性可得知晶片本身的品質並無瑕疵。cDNA 微陣列經由晶片掃描器轉 換為分析數據檔 (CEL 檔) ，再以 BRB Array Tools 3.8.1 進行分析 (Richard et al., 2007) 。訊號分析所使用的演算法為 Affymetrix 所開發的 MAS5 (Affymetrix Microarray Suite 5 method) ， 先 將 所 有 mRNA 表 現 量 對 housekeeping 基 因 表 現 量 進 行 normalization 後再根據實驗的方式進行顯著差異基因的篩選。Affymetrix GeneChip 使 用控制組基因 mRNA 的 3’與 5’ 訊號的比值來判定 RNA 樣品的品質以及晶片操作的 過程是否正常，RNA 樣品的控制組基因 3'-5' 比值如表 5-5。Affymetrix GeneChip 要 求所有的控制組mRNA 3'-5' 都必須小於 3，由表 5-5 的結果可以得知 RNA 樣品的品 質以及晶片操作的過程都正常，確認數據的可靠性。
(二) cDNA 微陣列分析結果
由4-6 片真葉時期的番茄 cDNA 微陣列分析結果發現，基改與非基改番茄之間共 有9 個基因表現量具有顯著改變，此 9 種基因表現量的熱點圖如圖 5-8。4-6 片真葉時 期的10 種番茄植株整體基因表現的叢集分析結果如圖 5-9 所示，基改番茄 R8 與非基
(A)
(B)
28S 18S
表5-5、微陣列控制組探針 3 端與 5 端比值
Table 5-5. 3'/5' ratio of control probe set of tomato cDNA microarray Sample
ID
3'/5' ratio of probe set
GST Phytochrome B2 Ubiquitin-3 β-actin eF1α GAPDH 380 1.03 1.77 0.95 1.10 1.03 1.04 608 1.02 1.78 0.96 1.10 1.02 1.03 371 0.95 1.86 0.96 1.09 1.02 1.03 621 0.92 1.85 0.96 1.09 1.02 1.01 644 1.05 1.71 0.96 1.09 1.02 1.03 616 1.06 1.80 0.94 1.07 1.00 1.02
R8 1.08 1.72 0.96 1.08 1.02 1.03
978 1.07 1.85 0.96 1.07 1.00 1.02
A6 1.06 2.00 0.99 1.13 1.04 1.05
L4783 1.02 1.76 0.99 1.09 1.02 1.04 Internal control 3’/5’ must <3.
978 616 L4783 R8 371 644 A6 621 380 608
Les.Affx.4763.3.S1_att Les. Affx.15353.1.S1_att Les.4317.1.S1_a
Les. Affx.43198.1.S1_att Les.4307.1.S1_att Les.2852.1.S1_att Les.3619.1.S_att Les.3619.1.S_att Les.Affx.8808.1.S1_att
-2 2
Tomato cultivars
Probe set
圖5-9、四至六片真葉時期的番茄 cDNA 微陣列的叢集分析結果。
Fig. 5-9. Result of cluster analysis of 4-6 true leaf stage tomato cDNA microarray data.
表5-6、果實收成時期的番茄 cDNA 微陣列基因表現分析結果
Table 5-6. Result of expression analysis of turning stage tomato cDNA microarray data Class comparison analysis (T-test)
Parametric p-value Geom mean of
intensities in class 1 Geom mean of
intensities in class 2 Fold-change Probe set
0.0004018 135.89 14.20 9.57 Les.4311.1.S1_at
0.0007377 60.51 11.34 5.34 Les.5369.1.S1_at
Significant analysis of microarray (SAM)
Geom mean of intensities in class 1
Geom mean of
intensities in class 2 Fold-change Probe set
358.28 18.71 19.15 Les.2294.2.A1_a_at
56.07 1390.95 0.04 Les.3140.1.S1_at
複，因此4 個基因均進行進一步的分析。綜合 4-6 片真葉時期與果實採收時期的 cDNA 微陣列分析結果如表5-7，果實採收時期 (turning fruit stage) 共有 4 個基因表現量有 顯著差異，包含 GAI-like protein、一個在開花時期表現的功能不明基因、與菸草的 2-prolyl-4-hydroxylase 相 似 的 基 因 以 及 與 阿 拉 伯 芥 ECHID (enoyl-CoA Hydrase/Isomerase D) 相似的基因。在 4-6 片真葉時期共有 9 個基因被篩選出來，包 含番茄的NP-24 蛋白、asparagine synthetase 1、ethylene responsive proteinase inhibitor I/ (ER1) 以及其他功能不確定的基因等。本研究將以 RT-qPCR 針對這 13 個基因在基 著差異的基因為一個與阿拉伯芥維管束運輸蛋白 AtPP2-A13 (Arabidopsis thaliana phloem protein 2-A13) 類似 (68%，E= 9e-60) 的基因、一個與可能與矮牽牛 (Petunia
× hybrida) 開花控制有關的 MADS-box protein 15 (PMADS15) 類似 (74%，E= 3e-82) 的 基 因 以 及 與 蓖 麻 (Ricinus communis) 可 能 的 老 化 基 因 glycerophosphodiester phosphodiesterase (SRG3) 類似的 (78%，E= 1e-31) 的基因。在果實採收時期基改與 非基改番茄間表現量有顯著差異的基因為GAI like protein、一個與菸草 type 2 prolyl 4-hydroxylase 高度相似 (88%, E= 0.00) 的基因與一個在開花時期表現但是功能完全 未知的基因。
表5-7、進行 RT-qPCR 表現量測定的番茄基因
Table 5-7. Tomato genes for expression level determination by RT-qPCR Probe ID Stage Fold change
(microarray)
NCBI
accession no. Description Les.4311.1.S1_at
Turning fruit
9.56 AY269087.1 GAI like protein
Les.5369.1.S1_at 5.33 BT013787.1 Highly similar (88%, E= 0.00) to AB471926.1, type 2 prolyl 4-hydroxylase of tobacco
LesAffx.14903.1.S1_at 19.14 AW429117 Unknown, flowering.
LesAffx.31406.1.S1_at 0.04 BM410312 Similar (73%, E=2e-31) to Arabidopsis thaliana ECHID (ENOYL-CoA HYDRATASE/ISOMERASE D) ; catalytic/ naphthoate synthase
(ECHID) , turning fruit.
Les.1077.1.S1_at
4-6 true
0.37 BG629245 unknown
Les.2852.1.S1_at 0.40 M21346.1 Tomato NP24 protein, anti-fungal, salt/viroid stress inducible
Les.3619.1.S1_at 0.40 J04099.1 Tomato fruit-ripening protein (ethylene responsive proteinase inhibitor I/
(ER1)
Les.4307.1.S1_at 0.41 AY257487 PR-5 like protein
Les.4317.1.S1_at 0.48 AW625684 Asparagine synthetase 1
LesAffx.15353.1.A1_at 0.44 BM967389 Transcribed locus, weakly similar (68%, E= 9e-60) to NP_567108.2 AtPP2-A13 (Arabidopsis thaliana phloem protein 2-A13) ; carbohydrate 141 152
圖5-10、四至六片真葉時期的特定番茄基因表現量分析比較。
Fig. 5-10. Selected gene expression level of 4-6 true leaf stage tomato.
*: Significant difference between GM and WT tomato (P<0.05) .
AsnS SRG3 MADSL PR5 ER1 BG62 BT4 AtPP NP24
Relatvie Expression, fold(s)
0.0001 0.001 0.01 0.1 1
L4783 R8
*
* *
圖5-11、果實採收時期的特定番茄基因表現量分析比較。
Fig. 5-11. Selected gene expression level of turning fruit stage tomato.
GAIL P4H2 AW42 ECHID
Relative expression. fold(s)
0.001 0.01 0.1 1 10
L4783 R8
*
*
*
表5-8、以 RT-qPCR 確認番茄基因表現 cDNA 微陣列分析結果 Table 5-8. Confirmation of tomato cDNA microarray results by RT-qPCR
Probe ID Stage RT-qPCR ID
(REST) Description Les.4311.1.S1_at
Turning fruit
GAIL 9.568 0.111* 0.000 GAI like protein
Les.5369.1.S1_at P4H2 5.335 0.099* 0.000 Highly similar (88%, E= 0.00) to AB471926.1, type 2 prolyl 4-hydroxylase of tobacco
LesAffx.14903.1.S1_at AW42 19.146 0.188* 0.037 Unknown, flowering.
LesAffx.31406.1.S1_at ECHID 0.040 0.233 0.107 Similar (73%, E=2e-31) to Arabidopsis thaliana ECHID (ENOYL-COA HYDRATASE/ISOMERASE D) ; catalytic/ naphthoate synthase (ECHID) , turning fruit.
Les.1077.1.S1_at
4-6 true leaf
BG62 0.376 0.089 0.099 unknown
Les.2852.1.S1_at NP24 0.409 0.345 0.198 Tomato NP24 protein, anti-fungal, salt/viroid stress inducible
Les.3619.1.S1_at ER1 0.401 0.252 0.213 Tomato fruit-ripening protein (ethylene responsive proteinase inhibitor I (ER1) .
Les.4307.1.S1_at PR5 0.416 0.902 0.788 PR-5 like protein
Les.4317.1.S1_at Asns 0.487 0.396 0.508 Asparagine synthetase 1
LesAffx.15353.1.A1_at AtPP 0.447 0.283* 0.000 Transcribed locus, weakly similar (68%, E= 9e-60) to NP_567108.2 AtPP2-A13 (Arabidopsis thaliana phloem protein 2-A13) ; carbohydrate binding
LesAffx.43198.1.S1_at BT4 0.463 0.486 0.394 Transcribed locus, weakly similar (72%, E= 2e-38) to
155
371 380 608
616 621 644
978 A6 L4783
R8
Flowering L4783 R8
Green L4783 R8
Turning L4783 R8
圖5-15、始花時期的番茄二維電泳圖譜中具有顯著差異的蛋白質。
期的番茄二維電泳圖譜中有 2 個具有顯著差異的蛋白質 (圖 5-16) ，果實採收時期 precursor-like protein, Rubisco LSU fragment 與 transketolase (兩個不同時期) ) 、葉綠 體內扮演類似 chaperon 功能的 ClpA 以及其餘兩種細胞內的 chaperon (GroEL 與 Bip) 。
圖5-16、綠果時期的番茄二維電泳圖譜中具有顯著差異的蛋白質。
Fig. 5-16. Protein spots with significant expression difference in the 2-DE analysis of green fruit
5-17、果實採收時期的番茄二維電泳圖譜中具有顯著差異的蛋白質。
表5-9、蛋白質二維電泳分析中具有差異的蛋白質點
Table 5-9. Protein spots that showed significantly different expression in protein 2-DE analysis Stage Spot ID SSP Fold
change pI Mw Accession
number Protein description
4-6 leaf 5 2002 1.73 8.26 (5.32) 27775 (20201.4) gi|266856 Oxygen-evolving enhancer protein 2, chloroplastic, tomato 27 5401 1.14 7.68 50463 gi|82400156 Phosphoglycerate kinase precursor-like protein, potato
7 9201 3.40 6.55
(6.57) 52921
(48450.2) gi|89280643Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit, tomato (predicted fragment)
Flowering
- 509 0.00 - - - -
8 1604 0.34 5.23 61402 gi|3790441 Chaperonin 60 alpha subunit, Canavalia lineate (GroEL) 11 2101 1.85 8.26 (5.32) 27775 (20201.4) gi|266856 Oxygen-evolving enhancer protein 2, chloroplastic, tomato
9 2705 0.51 5.10 (5.04) 73190 (70449.6) gi|1346172 Liminal-binding protein (Bip/grp78) , ER, tomato
- 2913 2.62 - - - -
- 3813 0.87 - - - -
- 5411 1.40 - - - -
15 6805 1.84 5.94 (5.53) 79942 (72930.5) gi|2501356 Transketolase, chloroplastic, potato
Green 14 4802 0.72# 5.86* 102178* gi|399213 ATP-dependent Clp protease ATP binding subunit clpA, chloroplastic, tomato
15 5705 0.72 5.94 79942 gi|2501356 Transketolase, chloroplastic, potato
- 708 0.37 - - - -
13 2101 0.53 5.91 (5.13) 34947.57 (26613.96) gi|12644171 Oxygen-evolving enhancer protein 1, chloroplastic, tomato
163
圖5-18、AK322 基因於不同生長時期的番茄中表現量的比較。
Fig. 5-18. AK322 gene expression level in different growth stage of tomatoes.
4-6 true leaf Flowering Green fruit Breaker fruit
Relative expression, fold(s)
0.1 1 10 100
L4783 R8
Turning
(六) 花芽分化基因的表現量分析
不同時期的基改與非基改番茄花芽分化基因表現量測定結果分別如圖5-19、圖 5-20、圖 5-21 與圖 5-22 所示。在 4-6 片真葉時期的基改番茄中，TAP3 基因的表現
不同時期的基改與非基改番茄花芽分化基因表現量測定結果分別如圖5-19、圖 5-20、圖 5-21 與圖 5-22 所示。在 4-6 片真葉時期的基改番茄中，TAP3 基因的表現