PCR 條件

各組DGGE 引子參照文獻 PCR 條件進行最適化，PCR 條件為反應總體積為 50 μL，其中含有 1X Super-therm GOLD PCR buffer、0.2 mM dNTPs、0.2 μM primers、5 U Super-therm GOLD polymerase 以及 0.5 μL DNA 樣品，引子序列如表 4-2。原核生物的 16S rRNA 基因 (Muyzer et al., 1993) 以引子對 341FGC/534R 進

表4-2、於 DGGE 研究中所使用的引子 Table. 4-2. Primer sets used in DGGE study

Oligo ID Sequence Target Organism

341FGC CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG

CCTACGGGAGGCAGCAG Bacteria

(Muyzer et al., 1993) 534R ATTACCGCGGCTGCTGG

F243 GGATGAGCCCGCGGCCTA

Actinomycetes (Oros-Sichler et al., 2006) F984GC CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG

NS2 FGC CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG GGCTGCTGGCACCAGACTTGC

63F CAGGCCTAACACATGCAAGTC

Ammonium-oxidizing bacteria (Kowachuk et al., 1997) 1378R CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG

CTO189F

GC CGCCCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGG GGAGGAAAGTAGGGGATCG

CTO654R CTAGCYTTGTAGTTTCAAACGC FGPH19 TACGGCAARGGTGGNATHG

Nitrogen fixing bacteria (Diallo et al., 2004)

Nitrate reducing bacteria (Flanagan et al., 1999; McDevitt et

al., 2000) V17 RTGYTGRTTRAANCCCATNGTCCA

V66FGC CGCCCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGG TAYTTYYTNHSNAARATHATGTAYGG

V67R DATNGGRTGCATYTCNGCCATRTT

Underline: GC clamp used for DGGE analysis.

以95^oC 1 min–72^oC 10 sec 進行 10 個循環，接著以 95^oC 1 min–68^oC 20 sec 進行 應10 min。第二輪 PCR 使用引子對 CTO189FGC/CTO654R (Innerebner et al., 2006) 進行放大，PCR 反應條件為 95^oC 12 min，接著以 95^oC 1 min–57^oC 30 sec–72^oC 20 sec 進行 10 個循環，接著以 95^oC 1 min–52^oC 30 sec–72^oC 20 sec 進行 10 個循環，

接著以95^oC 1 min–49^oC 30 sec–72^oC 20 sec 進行 15 個循環，最後以 72^oC 反應 10 min。

非共生固氮菌的nitrogen reductase (nifH) 基因首先以引子對 FGH19/PolR 進行 第一輪放大 (Diallo et al., 2004) ，PCR 反應條件為 95^oC 12 min，接著以 95^oC 1 min–60^oC 30 sec–72^oC 10 sec 進行 10 個循環，接著以 95^oC 1 min–58^oC 20 sec–72^oC 10 sec 進行 10 個循環，接著以 95^oC 1 min–55^oC 20 sec–72^oC 10 sec 進

1 min–45^oC 1 min–72^oC 1 min 進行 10 個循環，接著以 95^oC 1 min–42^oC 1 度膠體含有6％或是 12％ acryamide/bisacryamide (37.5:1) 、1× TAE buffer、21％

urea (Ultra Pure grade, Invotrogen) 與 20% deionized formaimeide (Invitrogen) 。60％

變性梯度膠體含有12％ acryamide/bisacryamide (37.5:1) 、1× TAE buffer、25.2％

urea (Ultra Pure grade, Invotrogen) 與 24% deionized formaimeide (Invitrogen) 。 DGGE 電 泳 是 使 用 DCode^TM Universal Mutation Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) 進行，電泳條件為 65^oC，1× TAE buffer 以 35V 進

DGGE 電泳結果以 ImagJ 軟體 (Abramoff et al., 2004) 進行處理，將 DNA 條 帶的有無，轉換為二進位數字陣列 (有 = 1，無 = 0) 。計算 DGGE profiles (二進 位數字陣列) 的 Shannon-Wiener Diversity Index (Shannon, 1948) 以評估樣品微生物 菌相的多樣性，計算公式如下。 species i 的 relatvie abundance，S 為 species 的總數，H 為 Shannon-Wiener Diversity Index。此外將轉換得到的 DGGE profiles (二進位數字陣列) 以 SPSS 12.0 軟體轉換

h 為兩個樣品間相同的特徵數。此外樣品間的相似度陣列以 GenStat Discovery Edition 3 軟體 (VSN international Ltd., Hemel Hempstead, UK) 進行 Principal Components analysis (PCA) 。叢集分析則是使用 Phylip 3.68 軟體 (Felsenstein，1989) 以UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Using Arithmetic averages) 演算法建立 親緣樹。

4-3 結果

(一) 土壤微生物計數與性質分析

亞蔬中心基改作物試驗田的土質為砂質坋壤土 (sandy clay loam) ，水分含量 9.78-16.68% ， pH 值 介 於 6.0-7.2 之 間 ， 總 有 機 碳 含 量 0.674-0.698 ％ ， 總 氮 含 量 0.760-0.093％ (表 4-3) ，由同一試驗田採取的土壤樣本間具有相當的差異，經由統計分 析之後，基改與非基改試驗田的土壤性質之間並沒有顯著差異。土壤菌落計數的結果顯 示，總菌數計數結果約在10⁶-10⁷ CFU/g 之間，真菌菌數在 10⁴-10⁵ CFU/g 之間，放線 菌菌數在10⁵-10⁶ CFU/g 之間 (圖 4-6) 。雖然種植基改番茄的土壤平均菌數有稍高的趨 勢，但是由於同為種植基改或非基改番茄試驗田所採到的5 個樣品間菌數差異頗大 (同 一樣品的3 重複計數差異不大) ，因此菌數在經過統計分析後均無顯著差異。

(二) PCR-DGGE 結果分析

畦部與溝部土壤的 DGGE 電泳結果分別如圖 4-7 及 4-8，結果顯示來自同一試 驗田 (同為種植基改或非基改番茄) 的 5 個土壤樣本間的 DGGE pattern 除了少數共同 的條帶之外，岐異度相當大，種植基改與非基改番茄的試驗田之間並沒有明顯的分 別，畦部及溝部土壤則有明顯的差異。 在 DGGE 條帶的種類 (多樣性) 方面，原核 生物、真菌、放線菌、硝化菌、非共生固氮菌以及脫氮菌的種類數量分別為79、59、

73、43、36 與 22 種。樣本平均的 DGGE 條帶出現總數為 31.8、16.4、16.3、13.0、

10.1 與 6.7。經由統計分析後 DGGE 條帶的種類與出現總數在種植基改與非基改番茄 的試驗田之間並沒有明顯差異。此外由DGGE profiles 所計算得到的 Shannon-Wiener Diversity Index 結果顯示，大多數種植基改番茄的土壤微生物菌相多樣性稍微較種植 非基改番茄的土壤來的高，整體而言，種植基改番茄並不會造成土壤微生物多樣性的

表4-3、種植基改與非基改番茄試驗田土壤特性分析結果

Table. 4-3. Soil properties of test fields planted with GM and WT tomato Soil

position

Tomato plant

Moisture,

(%) pH Total nitrogen,

(%)

Total organic carbon,

(%)

Ridge

GM 13.34 ± 2.92 6.05 ± 0.21 0.079 ± 0.007 0.698 ± 0.026 WT 9.78 ± 0.77 6.59 ± 0.29 0.084 ± 0.007 0.694 ± 0.031

Furrow

GM 13.51 ± 0.82 6.12 ± 0.61 0.093 ± 0.038 0.684 ± 0.017 WT 16.68 ± 1.71 7.22 ± 0.04 0.076 ± 0.020 0.674 ± 0.042 GM: genetically modified tomato line R8; WT: wild-type tomato host line L4783.

圖4-7、畦部土壤樣品 DGGE 分析結果。

Fig. 4-7. DGGE analysis of ridge soil samples.

(A) - (F) Ridge sample of 16S rRNA gene, fungal 18S rRNA gene, actinomycetes specific 16S rRNA gene, ammonium-oxidizing bacteria, free-living N -fixing bacteria and

圖4-8、溝部土壤樣品 DGGE 分析結果。

Fig. 4-8. DGGE analysis of furrow soil samples.

(A) (B) (C)

(D) (E) (F)

表4-4、土壤樣品微生物菌相的 Shannon-Wiener Diversity Index

Table. 4-4. Shannon-Wiener Diversity Index of soils of test fields planted with GM and WT tomato Soil

position

Tomato

plant 16S rRNA Actinomycetes Fungus Ammonium- oxidizing

bacteria

Nitrogen fixing bacteria

Nitrate reducing

bacteria

Ridge

GM 4.01 3.72 3.66 3.24 3.16 2.59 WT 4.00 3.70 3.41 3.32 3.11 2.02

Furrow

GM 3.93 3.98 3.66 3.27 3.20 2.72 WT 3.84 3.64 3.70 3.02 3.04 2.00 GM: genetically modified tomato line R8; WT: wild-type tomato host line L4783.

圖4-9、畦部土壤樣品的 DGGE profile PCA 分析結果。

Fig. 4-9. PCA analysis of DGGE profiles of ridge soil samples.

(A) - (F) : Ridge sample of 16S rRNA gene, fungal 18S rRNA gene, actinomycetes specific 16S rRNA gene, ammonium-oxidizing bacteria, free-living N2-fixing bacteria and nitrate-reducing bacteria, respectively. Circle: soil samples collected from GM tomato R8 test

圖4-10、溝部土壤樣品的 DGGE profile PCA 分析結果。

Fig. 4-10. PCA analysis of DGGE profiles of furrow soil samples.

(A) - (F) : Furrow sample of 16S rRNA gene, fungal 18S rRNA gene, actinomycetes specific 16S rRNA gene, ammonium-oxidizing bacteria, free-living N2-fixing bacteria and nitrate-reducing bacteria, respectively. Circle: soil samples collected from GM tomato R8 test field. Triangle: soil samples collected from wild-type tomato test field.

(A) (B) (C)

(D) (E) (F)

的菌相之間並沒有明顯的關連。畦部與溝部土壤菌相的叢集分析結果分別如圖4-11 及 4-12，與 PCA 分析的結果類似，採自同一試驗田的土壤樣本之間並沒有緊密的連性，

在種植基改與非基改番茄與土壤樣本的原核生物菌相與硝化菌菌相叢集分結果中，有 依照種植基改或非基改番茄的不同分成兩群的傾向 (圖 4-11 (D) 及圖 4-12 (A) 與 (D) ) ，但分群的結果較為鬆散。將土壤樣品的原核生物菌相與硝化菌菌相之間相似度 繪製成 Box-Whisker 圖 (圖 4-13) ，種植基改番茄的土壤菌相與種植非基改番茄的土 壤菌相之間 (GM-WT) 的相似度約介於 0.2-0.6 (1 為完全相同) 。種植同一種番茄的畦 部及溝部土壤原核生物菌相相似度 (GM-GM/WT-WT) 也分佈於 0.2-0.6 的範圍，並未 明顯的超出種植基改番茄的土壤菌相與種植非基改番茄的土壤菌相之間 (GM-WT) 的相似度的95％ 信賴區間 (長虛線) ，因此可以說明種植基改與非基改番茄對於土壤 原核生物菌相並沒有產生顯著的影響。在硝化菌菌相方面，則可以發現種植基改番茄 的土壤硝化菌菌相間 (GM-GM) 相似度較種植非基改番茄的土壤硝化菌菌相間 (WT-WT) 相似度低，顯示種植基改番茄有可能會增加土壤硝化菌菌相的多樣性。為比 較種植基改與非基改番茄對於土壤菌相影響的程度，進一步合併畦部與溝部土壤的原 核生物菌相與硝化菌菌相進行PCA 與叢集分析 (圖 4-14) 。由 PCA 的分析結果可以 發現圓圈所代表的畦部土壤與倒三角形所代表的溝部土壤有較明顯的分群，而實心記 號 (種植基改番茄) 與空心記號 (種植非基改番茄) 的分群現像比較不明顯。叢集分析 的結果也有類似的發現，種植不同種番茄的同一位置 (畦部或溝部) 土壤菌相間的親 緣關係比較接近，顯示相較於種植基改或是非基改番茄，土壤樣本的位置 (畦部與溝 部) 對於土壤菌相的影響更為顯著。

圖4-11、種植基改與非基改番茄試驗田土壤樣品 DGGE profile cluster 分析結果。

Fig. 4-11. Dendrograms of DGGE profiles of test fields planted with GM and WT tomato.

(A) - (F) : Ridge sample of 16S rRNA gene, fungal 18S rRNA gene, actinomycetes specific

圖4-12、種植基改與非基改番茄試驗田土壤樣品 DGGE profile cluster 分析結果。

Fig. 4-12. Dendrograms of DGGE profiles of test fields planted with GM and WT tomato.

(A) (B) (C)

(D) (E) (F)

圖4-13、部分土壤樣品間 DGGE profile 的相似性。

Fig. 4-13. The similarity of DGGE profiles among soil samples.

(A) Bacteria community (16S rRNA) of ridge soil. (B) Ammonium oxidizing bacteria community of ridge soil. (C) Bacteria community (16S rRNA) of furrow soil. (D) Ammonium oxidizing bacteria community of furrow soil. GM-GM: similarity among soil samples of GM test-field. WT-WT: similarity among soil samples of WT test-field. GM-WT: similarity among soil samples of GM and WT test-field. Dotted line: means. Solid line: medians. Gray box:

圖 4-14、以合併畦部及溝部土壤 DGGE profile 的 16S rRNA gene 及 ammonium-oxidizing bacteria 進行 PCA 以及叢集分析結果。

Fig. 4-14. PCA and clustering analysis of DGGE profiles of ridge-furrow combined 16S rRNA gene and ammonium-oxidizing bacteria specific 16S rRNA.

(A) PCA anlysis of 16S rRNA gene. (B) Clustering analysis of 16S rRNA gene. (C) PCA

4-4 討論

由於環境生態的複雜性，現行的基改作物安全性評估系統當中，基改作物的環境安全 性評估辦法仍然付之闕如。雖然有關基改作物環境安全性的研究報告相當多，但是由於對 於環境生態的瞭解仍然不足 (Kowalchuk et al., 2003) ，以及缺乏系統性的可靠分析方法 (Raybould, 2007) ，基改作物的環境安全性評估目前仍處於個案研究的階段 (Bruinsma et al., 2003) 。本研究由三個層次針對基改抗胡瓜嵌紋病毒番茄 R8 對於土壤菌相的影響進行 顯著降低，可能顯示於土壤微生物菌相有顯著的不良影響 (Kennedy and smith, 1995)。本 研究由土壤微生物菌相所計算出的多樣性指數 (Shannon-Wiener Diversity Index) 顯示，種 植基改番茄試驗田的土壤微生物多樣性稍微高於種植非基改番茄的試驗田。植物根部與土 壤微生物的互動有助於微生物的增長活動，並且因此間接的影響土壤碳循環以及氮循環 (Hamilton and Frank, 2001)，本研究中種植基改番茄土壤的脫氮菌多樣性明顯較高，或許與 基改番茄具有較發達的根部有關 (林等，2008)。就整體而言，種植基改番茄並不會降低土 壤微生物的多樣性。試驗田土壤的分析結果顯示原核生物菌相與硝化菌菌相與種植番茄種 類 (基改/非基改) 可能具有低度的關連性，但是影響的程度尚不及土壤採樣位置 (畦部/

由過去的研究可得知，基改作物對於土壤菌相的影響主要在與植物直接接觸的根圈 (Bruinsma et al., 2003; Dunfield and Germida, 2004)，除了一些基改作物因為其表現性狀 (T4 lysozyme) 與土壤微生物直接相關之外，基改作物對於土壤菌相的影響並沒有一定的規則 可循，因此必須針對每種基改作物進行個案評估。在表4-5 中有關過去基改作物對於土壤 微生物的影響評估研究中，種植基改作物對於土壤微生物菌相有顯著影響的研究約佔 55

％，有些研究雖然觀察到土壤微生物族群的顯著變化，但是相較於環境因子來說影響並不 顯著，與本研究所觀察到的結果相同。

4-5 結論

本研究由三個層次針對基改抗胡瓜嵌紋病毒番茄 R8 對於土壤菌相的影響進行系統 性評估，評估結果發現種植基改番茄並沒有對土壤微生物菌相帶來顯著的衝擊，雖然原核 生物菌相與硝化菌菌相的變化與種植基改番茄之間具有低度的關連，但是其影響力不及環 境因子像是土壤採樣位置以及試驗田本身的不均勻性質。

表4-5、基改作物對於土壤微生物菌相影響研究的相關文獻 (Bruinsma et al., 2003) Table. 4-5. Previous reports about the effects of GM crops on the soil microbial communities

表4-5、基改作物對於土壤微生物菌相影響研究的相關文獻 (接上頁)

Table. 4-5. Previous reports about the effects of GM crops on the soil microbial communities

第五章 以蛋白質二維電泳、cDNA 微陣列及反轉錄-即時定量聚合酶 鏈反應進行基改抗胡瓜嵌紋病毒番茄非預期效應的評估

5-1 前言

有 關 非 預 期 效 應 涉 及 的 層 面 相 當 廣 泛 ， 包 含 直 接 與 作 物 本 身 相 關 的 基 因 體 (genome) 、轉錄體 (transcriptome) 、蛋白質體 (proteome) 和代謝體 (metabolome) 評 估，或是土壤微生物菌相改變等環境衝擊評估。目前主要的評估策略為利用代謝分析描 寫方法 (profiling) ，對於基改作物及各種傳統育種品系進行比較，以進行非預期變化的

有 關 非 預 期 效 應 涉 及 的 層 面 相 當 廣 泛 ， 包 含 直 接 與 作 物 本 身 相 關 的 基 因 體 (genome) 、轉錄體 (transcriptome) 、蛋白質體 (proteome) 和代謝體 (metabolome) 評 估，或是土壤微生物菌相改變等環境衝擊評估。目前主要的評估策略為利用代謝分析描 寫方法 (profiling) ，對於基改作物及各種傳統育種品系進行比較，以進行非預期變化的