第二章 基改抗胡瓜嵌紋病毒番茄過敏性評估
4. 重組胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白生產
由於基因靜默 (gene silencing) 作用，在基改植物中，異源蛋白的表現量都相 當低 (Fischer et al., 2004) ，多數無法以 SDS-PAGE 進行分析。胡瓜嵌紋病毒鞘蛋 白由於不容易測定生物活性，因此以Western blot 的方式利用抗胡瓜嵌紋病毒鞘蛋 白多株抗體 (濁水溪生物科技，八德，桃園) 進行番茄果實中的胡瓜嵌紋病毒鞘蛋 白檢測。結果即使以化學冷光進行檢測，亦無法偵測到番茄果實中的胡瓜嵌紋病毒 鞘蛋白。由於冷光為十分靈敏的偵測方法，在 Western blot 分析中偵測極限可達 sub-picogram level (Barreiro et al., 2002) ，因此可以推斷基改番茄果實中胡瓜嵌紋病 毒鞘蛋白表現量極低。此外以胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白單株抗體進行 ELISA 分析結果 β-D-1-thiogalactopyranoside) 進行誘導。誘導後第 6 個小時取菌液以 12,000 xg 離
內涵體蛋白樣品。
b. rCMVCP 的純化與確認
由DNA 序列推算 rCMVCP 分子量約為 25 kDa，pI 為 9.95，為一鹼性蛋白，
參考 rCMVCP 的物理化學特性，本研究初期所規劃的純化策略為：破菌回收內 涵體，內涵體回溶，以陽離子交換樹脂管柱Sephadex SP 進行離子交換純化並復 性，以疏水性管柱進行進一步純化，最後以膠體過濾管柱 Sephacryl S-200 精製。
由於胡瓜嵌紋病毒顆粒於植物細胞中會自然聚積形成內涵體 (Bkčák and Hršel，1960) ，因此 CMVCP 可能具有聚積沈澱的傾向。經過反覆嘗試後發現 rCMVCP 在純化過程中容易產生非專一性吸附或沈澱，以致於各式管柱均無法 有效進行純化 (嘗試過 Sephadex SP、Sephadex A-50、Hitrap Phenyl FF、Sephacryl S-200 與 Sepharose G-25 等) ，因此改採下列純化策略：破菌回收內涵體，內涵 體回溶，緩慢稀釋復性，PEG 沈澱，以 2 M urea 回溶，以濃縮管進行濃縮並脫 鹽。
(1) rCMVCP 的純化
將回溶之後的內涵體以2 M urea 稀釋緩衝液 (含有 2 M urea 與 50 mM sodium phosphate, pH 7.0) 以逐滴的方式緩慢稀釋 2.5 倍，再以 12,000 xg 離 心15 min 後取上清液。將上清液加入 1 倍體積的 PEG 沈澱劑 (含有 50%
PEG 4,000 與 50 mM sodium phosphate, pH 7.0) ，於室溫下緩慢震盪 30 min，
再以12,000 xg 離心 15 min 後移除上清液。沈澱物以 50 mM sodium phosphate 緩衝液清洗 (pH 7.0) 3 次之後，以 2 M urea 稀釋緩衝液回溶。回溶的蛋白 質溶液以 Microcon (10 kDa MWCO, Millipore Co., Billerica, MA, USA) 迷
xg 離心 5 min 後取上清液作為 SDS-PAGE 蛋白樣品。取 60 ng 蛋白質樣品 以12.5 % TG-SDS PAGE (Laemmli, 1970) 進行電泳，電泳條件為 150 V，90 min 。 電 泳 膠 片 以 CBR (Coomassie Blue R-250) 染 劑 染 色 後 以 掃 描 器 (EPSON 4990, Seiko Epson Co., Nakano, Japan) 掃描並儲存圖檔。電泳膠片以 轉印緩衝液 (含有 20 mM Tris-base, 150 mM glycine, 20% methanol 與 0.1% 衝液。再加入 40 mL 一級抗體 (polyclonal rabbit anti-rCMVCP antibody, 1:5000) ，震盪反應 1 小時後倒棄緩衝液，並另以 30 mL blocking buffer 清 洗洗轉印膜 30 min 後倒棄緩衝液。接著加入 30 mL 二級抗體 (HRP conjugated goat anti-rabbit antibody, 1:5000) ，震盪反應 1 小時後倒棄緩衝 液，並另以 30 mL TSW blocking buffer 洗 PVDF 膜 3 次，每次 10 min。最 後加入 6 mL ECL 反應液 (Chemilucent ECL Detection System, Millipore) 並立即進行冷光照相。
將純化後的 rCMVCP 經 SDS-PAGE 分離並以 CBR 染色後切下膠片上 的條帶，委由明欣生物科技公司 (台北，臺灣) 進行 LC/MS/MS 分析鑑定。
蛋白質N 端定序分析則是將純化後的 rCMVCP 經 SDS-PAGE 分析並以 1X CAPS (N-cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid) buffer 進行轉印至 PVDF 膜上，轉印條件為200 mA 轉印 1 小時。PVDF 膜以 1X Amido Black 10B 染
70 kDa 之間、在食品中含量較高、較其他一般非過敏原性蛋白質耐消化和即使經 過加熱處理亦不易變性等 (Taylor and Fuchs, 1992; Astwood and Fuchs, 1996;
Astwood et al., 1996) 。模擬消化液試驗即是基於過敏原較其他非過敏原蛋白質耐消 化此一現象所發展出來的過敏誘發性評估法 (Astwood et al., 1996) 。當食物被攝取 mg/mL。模擬胃液 (simulated gastric fluid, SGF) 為模擬人體胃液而配製的酸性溶 液。將1.52 mL SGF buffer (含有 0.084 N HCl 與 35 mM NaCl，pH 1.2) 置於 37oC 水 浴槽中預熱5 min 後加入 2,400 U pepsin (Sigma-Aldrich #6887) 與蛋白質樣品 80 μL，最終比例為 6,000 U pepsin/mg 樣品蛋白，於 37oC 水浴槽中進行反應。分別 在反應時間0、0.5、2、5、10、20、30、60 min 取樣 200 μL 並馬上加入 75 μL 的 反應終止液 (0.2 M Na2CO3, pH 11.0) 以及 70 μL 的 5X SDS sample buffer (含有 1.25M Tris-HCl 、 11% SDS 、 50% glycerol 、 5% 2-mercaptoethanol 與 0.025%
bromophenol blue，pH 6.8) ，均勻混合後以 100oC 加熱 10 min 終止反應。對照組 為使用不含pepsin 的 SGF buffer 於 37oC 水浴槽中進行反應 60 min 後終止反應。
所有樣品製備完成之後進行12.5% TG-SDS PAGE 分析。
2-4 結果
(一) 蛋白質來源、基因表現量與蛋白質表現量分析 1. 蛋白質來源與過敏誘發性相關資料
蛋白質來源為胡瓜嵌紋病毒臺灣地區品系。胡瓜嵌紋病毒、其鞘蛋白基因或 是感染胡瓜嵌紋病毒的植物並無誘發過敏的相關文獻紀錄。
2. 新表現蛋白質的含量及表現位置
胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白於基改番茄中的表現量相當低，無法以Western blot 方式 偵測，以胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白單株抗體進行 ELISA 分析結果顯示胡瓜嵌紋病毒鞘 蛋白表現量低於 0.0016% 的總蛋白 (Lin et al., 2010) 。由 RT-qPCR 分析不同時期 基改R8 番茄中轉殖基因的表現量，結果如圖 2-6 所示，相較於 selection maker nptII 基因，cmvcp 的 mRNA 表現量相當高，可以達到 housekeeping gene (β-tubulin) 的 50-60％。雖然始花時期的 cmvcp mRNA 表現量較低，但是經由 REST 2009 軟體進 行統計分析發現基改番茄轉殖基因在不同生長時期之間的表現量並沒有顯著差異 (圖 2-7) 。
(二) 序列搜尋比對
搜尋比對結果胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白胺基酸序列與已知過敏原無任何顯著相似 性。各資料庫搜尋中，相似度最高的的過敏原如表2-3 所示。其中整體序列相似度 (full FASTA) 最高的為 Der p 8 以及 Der p 15 (均為 40.47%)，其 E score 均為 3.5，遠高於 1 × 10-7 的判定標準。而 80 mer amino acid FASTA alignment 搜尋與滑動連續胺基酸 片段搜尋結果也都無顯著相似的過敏原記錄。由上述結果可得知，依據現行基因改造 作物過敏性評估判定標準，基因改造番茄中的胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白並無顯著的過敏原
圖2-6、不同時期基改 R8 番茄中轉殖基因的表現量。
Fig. 2-6. Expression level of transgenic genes in the different growth stages of GM tomato R8.
R8: 4-6 true leaf stage. R8-F: flowering stage. R8-G: green fruit stage. R8-T: turning fruit stage.
CMVCP: CMV coat protein gene. nptII: neomycin phosphotransferase II gene.
R8-R R8-G R8-F R8
Relative expression to β-tubulin
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
CMVCP nptII
*
T
Results
Gene Type Reaction Efficiency Expression Std. Error 95% C.I. P (H1) Result
bTub REF 0.9932 1.000
CMVCP TRG 0.9859 0.923 0.721 - 1.446 0.453 - 1.481 0.641
*P (H1) - Probability of alternate hypothesis that difference between sample and control groups is due only to chance.
TRG - Target REF – Reference
Interpretation
CMVCP sample group is not different to control group. P (H1) =0.641
Non-Normalised Results
The following results do not have expression values normalised to the selected housekeepers.
Gene Type Reaction Efficiency Expression Std. Error 95% C.I. P (H1) Result bTub REF 0.9932 1.456 0.838 - 2.579 0.772 - 3.131 0.057
CMVCP TRG 0.9859 1.344 0.911 - 2.034 0.723 - 2.316 0.058
Report produced by REST 2009
© Corbett Research, 2009
圖2-7、始花時期基改 R8 番茄中 cmvcp 表現量的 REST 軟體統計分析結果。
Fig. 2-7. Expression level analysis of Cmvcp gene in the different growth stages of GM tomato R8 using REST software.
表2-3、胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白的過敏原資料庫搜尋比對結果
Table 2-3. Most relevant records of similarity search of allergen protein sequence
Allergen
name Organism Accession
no. Database
>0.01 Venom allergen 5.01 Cla h 4 Davidiella tassiana P40918 AO
Der p 15 Dermatophagoides pteronyssinus
>0.01 α-amylase/trypsin inhibitor
Cyp c 1.01 Cyprinus carpio
(common carp) CAC83658 SD 8.72 >0.01 Parvalbumin Ani s 4 Anisakis simplex
(Herring worm) P16347 AO 34.21 3.8 Allergen
*Database: “AO”=AllergenOnline, “SD”=SDAP.
# E score < 1 x 10-7 indicates significant homology for AllergenOnline database.
圖2-8、重組胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白純化。
Fig. 2-8. Purification of rCMV cp.
(A) SDS-PAGE analysis of rCMV cp expressed in E. coli. Lane 1: no IPTG induction. Lane 2:
1 mM IPTG induction. Lane 3: inclusion bodies; (B) Purified rCMV cp. Lane 1: supernatant of IBs solution after dilution. Lane 2: purified rCMV cp. Lane 3: Western blot analysis of rCMV cp.
2004) 的 rCMVCP，蛋白總回收量為 2.08 mg。純化後的 rCMVCP 進行 SDS-PAGE 分 析並轉印至PVDF 膜進行 LC/MS/MS 的分析鑑定結果如圖 2-9 (A) 。經由資料庫搜 尋比對後最高符合的蛋白質紀錄為CMVCP (gi 62910853) ，比對分數為 625 (>42 為 顯著) ，序列涵蓋率為 65%。蛋白質 N 端定序分析結果如圖 2-9 (B) 。經由 4 個水解 循環之後定出rCMVCP 的 N 端前四個胺基酸依序為 MDKS，符合資料庫中 CMVCP 的蛋白質序列。結合上述的兩項結果，約有67％ 的胺基酸序列與 native CMVCP 相 同，以目前的蛋白質鑑定及胺基酸定序技術來說，可以確定rCMVCP 與 CMVCP 具 有等同性，因此本研究所純化生產的重組CMVCP 可用於模擬胃液消化分析。
(四) 模擬胃液消化試驗
實驗結果如圖2-10。圖 2-10 (A) 為 BSA 蛋白的模擬消化液試驗結果，BSA 蛋 白被SGF 快速分解成小片段，並且在 2 min 內完全消失，符合 BSA 容易被模擬消化 液分解的特性。圖2-10 (B) 為大豆胰蛋白酶抑制因子 (soy trypsin inhibitor，STI) 蛋 白的模擬消化液試驗結果，由結果可以得知STI 蛋白在反應 60 min 後依然未被 SGF 分解消化，符合 STI 具有抵抗模擬消化液分解的特性。由上述二結果確立本研究所 使用的模擬消化液試驗方法可正確的試驗出樣品蛋白質是否具有抗模擬消化液分解 的特性。rCMVCP 模擬消化液試驗結果如圖 2-11，由結果得知 rCMVCP 蛋白可被 SGF 快速分解成小片段，並且在 30 秒內完全消失，與具有易被模擬消化液分解特性之 BSA 相同，因此本研究認為 rCMVCP 並不具有過敏原蛋白常有的耐模擬胃液分解特 性，也就是rCMVCP 不具有顯著的過敏誘發性。
(A)
(B)
(A)
(B)
圖2-10、模擬胃液正負控制組試驗結果。
Fig. 2-10. Results of SGF positive and negative control test.
(A) Pepsin-susceptible control. BSA: bovine serum albumin; (B) Pepsin-resistant control.
M 0 0.5 2 5 10 20 30 60 C
(A)
(B)
rCMV cp
3 10 20 25 37
M C 0 0.5 2 5 10 30 kDa
kDa
2-5 討論
(一) 基改抗胡瓜嵌紋病毒番茄過敏誘發性評估
以胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白胺基酸序對AllergenOnline、SDAP 和 ADFS 過敏原資料 庫進行 80 mer amino acid FASTA alignment 搜尋、滑動連續胺基酸片段搜尋和 full FASTA overall search 搜尋比對，實驗結果顯示，基改番茄中的胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白胺 基酸序列與已知過敏原蛋白胺基酸序列無顯著的相似性。針對不同時期的基改R8 番 mediated protection, CP-MR) ，應該不是來自於 post-transcriptional gene silencing (PTGS, Marcel et al., 2008; Morroni et al., 2008) 。由於基改番茄中的胡瓜嵌紋病毒鞘 蛋白含量很低，如欲自基改番茄中純化1 g 的胡瓜嵌紋病毒鞘蛋白進行模擬消化液等
(二) 綜合安全性評估結果
第三章 品系專一性即時定量聚合酶鏈反應檢測系統之建立與
率。三種選殖方法分別為GenomeWalkerTM 試劑套組 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) 、Inverse PCR (Hui et al., 1998) 以及 thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR;Weissensteiner et al., 2004)。Genome walking 法是將染色體 DNA 利用限制酶剪切成較小 的片段，將具有特別設計的adaptor DNA 片段以 T4 DNA ligase 接合於剪切過的染色體
圖3-2、Inverse PCR 原理簡圖 (Hui et al., 1998) 。 Fig. 3-2. Principle of Inverse PCR.
間基因交換 (gene transfer between species) (Heinemann，1991)、跨界接合生殖 (transkindom conjugation) (Heinemann and Sprauge, 1989) 以 及 細 菌 的 自 然 轉 型 (nature genetic transformation) (Lorenz and Wackernagel, 1994) 等機制，其中細菌的自然轉型被認為最有可 能與基改作物基因水平轉移現象有關，而跨界接合生殖有可能進一步的散佈基因片段，產 生安全性風險。許多研究顯示植物DNA 大部分會在動物的消化道中分解，只有高 copy 數 的基因例如葉綠體基因被發現吸附在小腸壁、Peyer’s Patches (Einspanier et al., 2001) 或 是出現在血液中 (Schubbert et al., 1997) 。但也有研究顯示基改黃豆及玉米的轉殖基因序
CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) 法：DNA 之抽取與純化採用 Lipp 等人在 1999 年所發表之 CTAB 法 (Lipp et al., 1999) 。取 50 mg 基改番茄樣品，
加入 65oC 預熱之 CTAB 萃取溶液 (含有 CTAB 20 g/L、1.4 M NaCl、0.1 M Tris/HCl 與20 mM EDTA) 500 µL 於 65℃反應 30 分鐘，再以 12,000×g 離心 10 分鐘，取 上層液; 加入 CI (chloroform:isoamylalcohol = 25:1) 200 µL 萃取後，以 11,500×g 離心 10 分鐘; 上層溶液，加入 2 倍體積的 CTAB 沉澱溶液 (CTAB 5 g/L 與 0.04 M