已知抗氧化力物質的分析比較

物質的抗氧化力已被廣泛的研究，我們首先利用 VESI-MS 分析 vitamin C、Trolox、L-cysteine (cys)、GSH 及 glucose 等化合物的抗氧化 力，將結果與已知的文獻進行比較，以了解 VESI-MS 在抗氧化力研究上 的可行性。

實驗時，當 vitamin C 溶液滴入 ABTS^●+的生成液中，ABTS^●+的訊號 於 1 分鐘內迅速下降，然後緩慢減少，5 分鐘後則無顯著變化(圖 4-20、

圖 4-21)，m/z 515 訊號為 m/z 514 的¹³C 同位素和[ABTS+H]⁺的綜合表現，

強度呈現先降後升而平緩的現象。

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圖 4- 20 不同階段 2.5×10^-4 M ABTS^●+與 1.25×10^-4 M vitamin C 混合液的 質譜圖：(A)混合前(ABTS^●+)；(B) ABTS^●+加入 vitamin C 後約 36 秒；

(C) ABTS^●+加入 vitamin C 後約 5 分

圖 4- 21 ABTS^●+與 vitamin C 反應時 m/z 514 與 m/z 515 之 EIC 圖

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VESI-MS 不但可以即時記錄特定時間時反應液的成分，藉由 extraced ion chromatogram (EIC)資料的處理，也可以同時觀察特定離子的變化軌 跡。使用 VESI 時，溶液由反應容器流至游離源進行電噴灑游離所需時間，

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圖 4- 22 不同 vitamin C 濃度使 ABTS^●+衰減的趨勢圖：2.5 × 10^-4 M (*)；

1.25 × 10^-4 M (■)；8.33× 10^-5 M (▲)；6.25 × 10^-5 M (◆)；5× 10^-5 M (

○

雖然[vitamin C]: [ABTS^●+]= 1:1 時有最大的 ABTS^●+衰減幅度和最快 的反應速率，考量未來要藉由 ABTS^●+衰減幅度和反應速率的差異性，當 成其他物質與 vitamin C 在抗氧化力上的比較，為了減少平準效應(leveling effect)的發生，後續實驗中因此採用[抗氧化物]: [ABTS^●+] = 1:2 的條件進 行。

圖 4- 23 不同 vitamin C 濃度使 ABTS^●+衰減的程度(%)

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差異。此外使用 glucose 時，ABTS^●+先如預期的下降，隨即在 1.2 分鐘時 漸漸往上升後平緩(圖 4-25)，針對此現象仍需其他實驗進一步探討可能之 原因。

圖 4- 24 各種抗氧化劑使 ABTS^●+衰減的長條圖

表 4- 3 各種抗氧化劑之 ABTS^●+衰減率(%)及 TEAC 值

抗氧化劑

vitamin C Trolox Uric acid GSH Glucose Cys.

ABTS

(±SD, n=3)

TEAC (n=3)

圖 4- 25 各種抗氧化劑使 ABTS^●+衰減的趨勢圖

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圖 4- 26 不同階段 2.5×10^-4 M ABTS^●+與 1.25×10^-4 M Trolox 混合液的質 譜圖：(A)Trolox/50%甲醇水溶液；(B)混合前(ABTS^●+)；(C) ABTS^●+與 Trolox 反應 4 分鐘

圖 4- 27 ABTS^●+與 Trolox 反應之 EIC 圖

如圖 4-28 所觀察到 m/z 249 也支持了文獻曾經提出 Trolox 與 ABTS^●+

的反應機制³¹。反應機制觀察到 Trolox 先與第一當量的 ABTS^●+進行氫原 子(H^●)交換形成 product I，此時 product I 苯環上-CH3的 H 原子可以 shift

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到-O^●上，使苯環上的-CH3形成-CH2●，再與第二當量的 ABTS^●+反應後形 成 product II (m/z 249)。m/z 267[m/z 249+18]與 m/z 221[m/z 249-28]的結構 則需要未來進一步的鑑定。

圖 4- 28 推測 ABTS^●+與 Trolox 的反應機制

當 ABTS^●+與 GSH 的反應時的新生成物為 m/z 340 與 m/z 613 (圖 4-29)。GSH 與 ABTS^●+反應時進行 H^●交換形成 GSH^●+，兩個 GSH^●+可以結 合而成 GSH-GSH(圖 4-30)³²，因此 m/z 613 為兩分子 GSH 間失去 H2形成 disulfide 鍵而生。GSH^●+也可以與氧氣反應形成 glutathione sulfinic acid，

CID 實驗支持 m/z 340 為質子化的 glutathione sulfinic acid (圖 4-31)。相較 於 vitamin C 或 Trolox，GSH 使 ABTS^●+衰退的程度較輕微(圖 4-29)，GSH-GSH 的生成以及 4-29)，GSH-GSH^●+的氧化反應阻礙了 GSH^●+與 ABTS^●+的結合，減 少了 ABTS^●+的耗損，導致 GSH 顯現較弱的抗氧化力，

68 (Glutathion sulfinic acid, MW=339)

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圖 4- 31 以 CID 鑑定 glutathione sulfinic acid(m/z 340)之結構

圖 4- 32 Cys 樣品及 2.5×10^-4 M ABTS^●+與 1.25×10^-4 M cys 混合液之質譜 圖：(A) cys；(B) ABTS^●+加入 cys 反應約 13 min

類似於 GSH 具有-SH 官能基，cys 與 ABTS^●+的反應形成 cys^●+後也 是可以生成 cys-cys(m/z 241)，同時與氧氣反應生成 m/z 154(圖 4-32)，另 外也出現 m/z 152，推測其結構如下:

同樣的，cys-cys 的生成以及 cys^●+的氧化反應阻礙了 cys^●+與 ABTS^●+的結 合，導致 cys 顯得格外較弱的抗氧化力。

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Uric acid 與 ABTS^●+生成液反應時，檢視過程中反應液成分的變化(圖 4-33)，可以發現實驗中所用的 uric acid 因為是鈉鹽，造成判圖上的複雜，

類似使用 PDS 為氧化劑時鉀鹽的影響，此外，在圖 4-33(B)與(C)中觀察 到 ABTS^●+與 uric acid 反應後，其 m/z 514 與 m/z 515 的訊號強度比並沒 有如其他已知抗氧化劑的反應系統般的狀況，並且可以發現其中 m/z 207 出現後又消失，EIC 圖可以更明確的看到此一現象(圖 4-34)，因此 m/z 207 應該是反應中間產物，以 dVESI 方式進一步證實，m/z 207 為 uric acid 與 ABTS^●+反應生成，並且其量的多寡取決於 ABTS^●+濃度的高低。至於 m/z 207 的結構以及後續反應的產物，需要未來進一步的研究探討。

圖 4- 33 Uric acid 樣品及不同階段下 2.5×10^-4 M ABTS^●+與 1.25×10^-4 M uric acid 混合液之質譜圖：(A) uric acid；(B) ABTS^●+與 uric acid 反應約 0.6 min；(C) ABTS^●+與 uric acid 反應約 3 min

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圖 4- 34 ABTS^●+與 uric acid 反應之 EIC 圖：(A)ABTS^●+(m/z 514)；

(B)ABTS(m/z 515)；(C)m/z 207

此外，圖 4-34 顯示隨著 m/z 514 強度的減弱，並沒有觀察到 m/z 515 強度的增長，但是若以 UV 分析反應液，卻可以確認 ABTS^●+已還原成 ABTS，推測是反應液中含有大量的鈉鹽訊號壓抑了[ABTS+H]⁺的訊號，

導致本來就不易游離的 ABTS 更不容易觀察到[ABTS+H]⁺的訊號。因此 在正電模式下研究 uric acid 的抗氧化能力存在很大的不確定性，較可行 的辦法為採用 uric acid 銨鹽化合物，解決金屬離子加成物的干擾和溶解 度的問題。