第三章 實驗方法
3.4 自動進樣(self-pumping)裝置
利用本實驗室已開發設計的自動進樣裝置(self-pumping)-文氏管電 噴 灑 游 離 質 譜 法 為 主 要 實 驗 方 法 (Venturi electrospray ionization mass spectrometry, VESI-MS)。所使用之單重進樣 VESI (sVESI) 自動進樣裝置 的示意圖如圖 3-5，先將徑為 130 μm 的 PEEK 毛細管裁切成約 10 公分 長度，作為自動進樣裝置的連接管線，再將樣品瓶的瓶蓋打洞，使 PEEK 毛細管穿入瓶蓋並深入待測溶液中，另一端以轉接頭連接到質譜儀的電 噴灑游離源，而後自動進樣到質譜儀進行訊號的偵測。
圖 3- 6 sVESI 裝置示意圖
另一種分析方法為雙重進樣文氏管電噴灑游離法(dual inlet Venturi electrospray ionization, dVESI)，其裝置的示意圖如圖 3-7，將 PEEK 毛細 管換成口徑為130 μm 的管子，裁切成約 6.5 公分長度，作為自動進樣裝 置的連接管線，再將微量離心管的蓋子打洞，使 PEEK 毛細管穿入蓋子 進入微量離心管的溶液中，並利用 T 型連接頭串連兩個 sVESI 裝置，另 一端連接轉接頭使溶液可進入質譜儀的電噴灑游離源，而後自動進樣到 質譜儀進行訊號偵測。
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圖 3- 7 dVESI 的裝置示意圖
3.4.1 sVESI 偵測 ABTS●+生成的過程
以質譜儀搭配 sVESI 的進樣方式於正電模式與負電模式進行觀測 ABTS●+生成的即時變化。反應一開始進樣 DI 水作為背景值，約 1-2 分鐘 後，迅速置換成備用的 2.5×10-4 M 之 ABTS 溶液 9 mL，將其架設在磁力 攪拌器上(如圖 3-8 的實驗裝置圖)，待訊號平穩後以微量移液管取 1 mL 的 5×10-3 M 之 ADS 水溶液加入上述瓶中，進行生成 ABTS●+的反應觀測。
3.4.2 sVESI 偵測物質的抗氧化能力方法
3.4.2.1 正電模式分析 ABTS●+衰減程度
以質譜儀搭配 sVESI 的進樣方式觀測 ABTS●+與抗氧化劑進行氧化 還原反應的即時變化。取一乾淨棕色瓶，使用已校正之微量移液管加入 2 mL 的 2.5×10-4 M 之 ABTS●+溶液，並放入攪拌子備用。
反應一開始以 sVESI 進樣 DI 水作為背景值，約 1-2 分鐘後，迅速置 換成備用的 ABTS●+水溶液(2 mL)，將其架設在磁力攪拌器上(如圖 3-8 的 實驗裝置圖)。
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圖 3- 8 sVESI 的實驗裝置圖
使 ABTS●+溶液連續進樣約 3-4 分鐘後待訊號平穩，使用微量移液管 取 40 μL 的抗氧化劑溶液加入上述瓶中進行氧化還原反應的觀測，實驗 示意圖如圖 3-9。
圖 3- 9 以 sVESI 檢測物質抗氧化能力實驗之流程：(A)收集 DI 水訊號 為背景值；(B)快速抽換成 ABTS●+水溶液的樣品瓶；(C)將 40 μL 的抗氧 化劑溶液加入反應瓶內
研究中所使用的抗氧化劑標準品有 vitamin C、Trolox、GSH、uric acid，
glucose，L-cysteine，苯二酚異構物(鄰、間、對位)與苯二胺異構物(鄰、
間、對位)。
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3.4.2.2 負電模式分析抗氧化劑衰減程度
取一乾淨棕色瓶，裝入 3 mL 的 DI 水，使其先進樣 1-2 分鐘做為背 景值，使用已校正之微量移液管加入 80 μL 的抗氧化劑溶液後待訊號穩 定，再添加 1 mL 的 2.5×10-4 M 之 ABTS●+溶液於上述樣品瓶中，使瓶中 ABTS●+與抗氧化劑濃度比為 0.5：1，並觀察抗氧化劑訊號下降的情形。
在競爭效應的實驗中，則是於盛裝有 DI 水的樣品瓶中添加入 80 μL 的 vitamin C、uric acid、GSH 與 Trolox 溶液，使其先進樣 2 分鐘左右，
再加入對應體積的 2.5×10-4 M 之 ABTS●+使分析時自由基與抗氧化劑的 濃度比為 0.5：1。
3.4.3 dVESI 偵測的實驗方法
先於 dVESI 裝置的兩側放上微量離心管，並盛裝 1 mL 的超純水為 反應溶劑，使其連續進樣 1 分鐘後，快速將右側的微量離心管抽換為盛 裝抗氧化劑的水溶液，並確認溶液穩定進樣，約過 5 至 6 分鐘後，再快 速將左側的微量離心管置換成 ADS、PDS 的水溶液，進行溶液混合的分 析，如圖 3-10 裝置圖。
圖 3- 10 dVESI 的實驗裝置圖
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VESI-MS 可以提供反應液變化的即時(real-time)訊息，並且 ABTS●+的用 量可以大為縮減達數千倍。以下為針對(1) ABTS●+生成的最佳化；(2) 以 VESI-MS 線上即時偵測物質抗氧化能力的可行性及應用; (3) VESI-MS 於同分異構物抗氧化能力比較上的研究結果。
4.1 生成 ABTS●+的最佳化
已知生成 ABTS●+常用的自由基產生劑(氧化劑)有
2,2'-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride(以 下簡稱
AAPH)或 K2S2O8(以下簡稱 PDS)，我們參考已知文獻針對生成溫度、時間、溶劑和氧化劑的種類、濃度、比值等實驗條件，尋找能在最短的時間內得到最佳 ABTS●+產率，
並能適用於 VESI-MS 進行線上分析的生成方式。