第四章 結果與討論
4.1 生成 ABTS ●+ 的最佳化
已知生成 ABTS●+常用的自由基產生劑(氧化劑)有
2,2'-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride(以 下簡稱
AAPH)或 K2S2O8(以下簡稱 PDS)，我們參考已知文獻針對生成溫度、時間、溶劑和氧化劑的種類、濃度、比值等實驗條件，尋找能在最短的時間內得到最佳 ABTS●+產率，
並能適用於 VESI-MS 進行線上分析的生成方式。
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首先以 APPH 做為氧化劑將 ABTS 氧化成 ABTS●+，當將 ABTS 與 醋酸銨水溶液(pH=6.55)或 50%甲醇水溶液，於 68℃水浴中加熱時，可以 觀察到溶液顏色由淡綠色逐漸加深(圖 4-1)，此現象代表 ABTS 正持續被 氧化成 ABTS●+，此外以溶液顏色的深淺做為 ABTS 氧化成 ABTS●+程度 的高低，可以明顯發現於 50%甲醇水溶液中的氧化程度較高，也就是於 50%甲醇水溶液中，ABTS●+的生成速率較快。
圖 4- 1 以 AAPH 氧化生成 ABTS●+反應液顏色之變化: (A) ABTS 於醋酸 銨水溶液；(B) ABTS 於 50%甲醇水溶液
以 UV 分析的結果顯示在 415 nm 及 728 nm 的吸收度仍無明顯變化 (圖 4-2)，雖然溶液顏色的轉變代表著 ABTS 持續轉化成 ABTS●+，但 340 nm 波長的強烈吸收波峰，則顯示反應液中還殘留著大量的 ABTS，因此 加熱 40 分鐘並不能將 ABTS 有效的氧化成 ABTS●+。
圖 4- 2 以 AAPH 為氧化劑生成 ABTS●+反應 40 分鐘時反應液的 UV 圖
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以 AAPH 氧化劑氧化生成 ABTS●+的效果不佳，因而改用另一種常 用的氧化劑過硫酸鉀 K2S2O8(以下簡稱 PDS)進行 ABTS●+的生成，已知 PDS 較 AAPH 有較低的反應活化能，預期可以提供較有效的 ABTS●+生 成效率。採 PDS 作為氧化劑時，我們探討了不同 ABTS 濃度與反應溫度 對 ABTS●+生成效率的影響。
將 2.5×10-3 M 的 ABTS 與 5×10-3 M 的 PDS 溶於水中，分別於 50℃
水浴及 20℃下進行反應，可以發現相較於 AAPH，以 PDS 為氧化劑時，
於 UV 圖中短時間內即明顯看到 ABTS●+吸收強度的增加[圖 4-3(A)與(B)]。
於 50℃水浴下，ABTS 的吸收峰(340 nm)約在反應第 10 分鐘時已降到最 低點，同時 ABTS●+的吸收峰(415 nm 和 728 nm)也達到最高點。依據文獻 所提供的 ABTS●+莫耳吸收度(Ɛ415nm = 36,000 M-1 cm-1)28，可以換算出 ABTS●+的生成率有 72%，但是溶液中卻同時也出現黑色不溶於水的固體 (圖 4-4)，推測是 ABTS●+進一步反應成聚合物所致，進而改將反應溫度改 成 20℃，反應速率因而減緩，反應約 45 分鐘後 ABTS●+的生成率可達到 86%，比 50℃時的生成率提高了 14%，但是溶液中依然出現了黑色固體，
因此反應溫度並不是引起黑色固體得主因。因此推測過高的 ABTS●+濃度，
可能是聚合物生成的原因。
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圖 4- 3 不同條件下 ABTS 與 PDS 混合液之 UV 圖：(A) 2.5×10-3 M ABTS+5×10-3 M PDS 於 50℃；(B) 2.5×10-3 M ABTS+5×10-3 M PDS 於 20℃；(C) 2.5×10-4 M ABTS+5×10-4 M PDS 於 50℃；(D) 2.5×10-4 M ABTS+5×10-4 M PDS 於 20℃
圖 4- 4 高濃度 ABTS 與 PDS 混合液所生成之黑色固體
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以 2.5×10-4 M 的 ABTS 與 5×10-4 M 的 PDS 水溶液生成 ABTS●+，顯 示於 50℃和 20℃進行反應時，達到 ABTS●+最佳生成率所需反應時間分 別為 80 min (50℃)和 330 min (20℃) [圖 4-3(C)、(D)與圖 4-5]。最佳反應 時間雖然較 2.5×10-3 M 的 ABTS 與 5×10-3 M 的 PDS 長許多，卻不會生成 黑色固體，而 50℃時的生成率也提高至 89%，由於黑色固體的生成容易 造成 VESI 管路的阻塞，因此後續為了使生成自由基反應不要產生黑色固 體而影響後續 ABTS●+的生成都採取較低的 10-4 M 等級濃度進行。
比較不同生成條件下 ABTS●+於 415 nm 吸收度與反應時間的變化圖 (圖 4-5)，可以發現 2.5×10-3 M ABTS 與 5×10-3 M PDS 於 50℃反應時，具 有最快的生成速率，但隨反應時間增加吸收度急遽下降，推斷過高的 ABTS●+濃度造成自由基形成結合(coupling)反應，終止了自由基的持續生 成。此外文獻報導提及以 ABTS 與 PDS 生成 ABTS●+時，每 1 莫耳 ABTS 會消耗掉 2 莫耳 PDS，我們嘗試將 ABTS/PDS 的比例由 1:2 改為 1:2.3，
比較兩者的 ABTS●+生成的趨勢有何不同。24
圖 4- 5 不同條件下 ABTS 與 PDS 混合液中 ABTS●+吸收度的趨勢圖:
2.5×10-3 M ABTS+ 5×10-3 M PDS 於 50℃ (
●
)；2.5×10-3 M ABTS+5×10-3 M PDS 於 20℃ (◆)；2.5×10-4 M ABTS+5×10-4 M PDS 於 50℃ (▲)；2.5×10-4 M ABTS+5×10-4 M PDS 於 20℃ (■)；2.5×10-4 M ABTS+5.7×10-4 M PDS 於 50℃ (×)
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此外由圖 4-5 可以發現提高 PDS 的含量對 ABTS●+的生成率並沒有 顯著的影響，但可以有較短的反應時間，生成率達到最高點時間由 80 分 鐘縮短至 55-60 分鐘。圖 4-5 中也可以觀察到 ABTS●+吸收度達到極大值 後都隨著反應的持續進行而降低，為了釐清 ABTS●+的安定性，提供後續 進行 VESI-MS 實驗時的可信度，乃將生成 ABTS●+的反應液置於室溫下，
觀察不同置放時間之反應液的 UV 圖 (圖 4-6)，結果顯示於室溫下置放 90 分鐘，ABTS●+的含量就有約 15%以上的損失。圖 4-6 同時顯示，有一 新的吸收峰出現在 295 nm，推測是 ABTS●+降解所產生的產物之吸收峰。
圖 4- 6 以 UV 觀察 ABTS●+的安定性
我們也針對 ABTS/PDS 的比例為 1:2 和 1:2.3 的反應液安定性做探 討，發現 1:2.3 的反應液 ABTS●+降解速率稍快於 1:2 的反應液(圖 4-7)，
因此可推論提高 PDS 的濃度雖然可以縮短反應時間，卻也會得到較差的 ABTS●+安定性。綜合考量合成時間與安定性，乃採用以 2.5×10-4 M ABTS 與 5×10-4 M PDS 在 50℃反應為生成 ABTS●+的最佳條件。
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圖 4- 7 不同 PDS 與 ABTS 濃度比例所得 ABTS●+的安定性:
PDS:ABTS=1:2 (■)；PDS:ABTS=1:2.3 (●)
將上述最佳條件下生成之 ABTS●+與 ABTS 原液分別以 VESI-MS，
顯示 ABTS 未與 PDS 反應前，可以生成 m/z 515 ([ ABTS+H ]+)、m/z 257、
m/z 259 離子(圖 4-8、4-9)。ABTS
●+生成液的 VESI-MS 圖中，則明顯出現 ABTS 氧化成 ABTS●+(m/z 514)，除此之外，還有強烈的 ABTS●+鉀鹽造成 的[ABTS●-H+K]+(m/z 552)與[ABTS●-2H+2K]+(m/z 590)。圖 4- 8 ABTS(上)與 ABTS●+生成液(下)的質譜圖
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圖 4- 9 圖 4-8 中針對 m/z 257、m/z 259 的推測結構
這些加成物在後續 ABTS●+與抗氧化物反應的質譜圖判圖上，會形成 嚴重的干擾，可能造成探討物質抗氧化能力上的嚴重誤差，因此我們進 一步將生成 ABTS●+時所用的氧化劑改為過硫酸銨(ADS)，以消除鉀離子 所帶來的干擾。
圖 4- 10 不同條件下 ABTS 與 ADS 混合液中 ABTS●+吸收度的趨勢圖:
2.5×10-3 M ABTS+5×10-3 M ADS 於 50℃ (●)；2.5×10-4 M ABTS+5×10-4 M ADS 於 50℃ (■)；2.5×10-4 M ABTS+5.7×10-4 M ADS 於 50℃ (▲)
以 ADS 取代 PDS 進行相同的實驗步驟，結果顯示 2.5×10-3 M 的 ABTS 與其兩倍的 ADS 氧化劑反應仍會生成黑色沉澱物，更說明了此沉
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澱物受到 ABTS 起始濃度影響而出現，與氧化劑種類、溫度等因素無關。
而改以 ADS 為氧化劑與 2.5×10-4 M 的 ABTS 反應，對於 ABTS●+的生成 率上並無顯著差別(圖 4-10)，最佳反應時間則縮短了 10-15 分鐘。
圖 4- 11 以不同氧化劑氧化生成 ABTS●+的反應液質譜圖：(A)添加氧化 劑前 ABTS 水溶液；(B)添加 PDS 的反應液；(C) 添加 ADS 的反應液
比較添加 PDS 或 ADS 進行生成的反應液質譜圖(圖 4-11)，可以很明 顯的發現添加 ADS 反應液的質譜圖，背景訊號極為乾淨，幾乎只有 ABTS●+的訊號[圖 4-11(C)]。結果顯示以 ADS 為氧化劑來氧化生成 ABTS●+，不但可以縮短反應時間，也提供乾淨的質譜圖訊號，降低了因 為鉀鹽所帶來判圖上的困擾。
為了能將生成 ABTS●+的條件進一步最佳化，我們也探討溶劑的影響，
2.5×10-4 M ABTS 與 5×10-4 M ADS 分別處於水、10%甲醇水溶液、甲醇、
醋酸緩衝溶液(pH=4.53)及氨水緩衝溶液(pH=9.63)於 50℃水浴中反應的 結果。在五種不同反應條件中，以純水和醋酸緩衝溶液為溶劑，皆可以達
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到約 80~90%的 ABTS●+生成率(圖 4-12)，醋酸緩衝溶液比純水提供較短 的反應時間，推斷是 ABTS 生成自由基的過程可能牽涉質子的轉移，因 此酸性條件有利於生成 ABTS●+，但當以氨水緩衝溶液，生成率相較之下 明顯不佳。而 ABTS●+易溶於水，因此以 10%的甲醇水溶液為溶劑時，
ABTS●+不利於生成，所得到的生成率則不到 20%，而以甲醇為溶劑，則 無明顯的 ABTS●+生成。綜合以上分析的成果，發現酸性的水溶液有利於 ABTS●+的生成，但顧及緩衝溶液的添加有可能影響後續質譜圖判圖上的 複雜化，我們仍然採用純水做為溶劑。
圖 4- 12 2.5×10-4 M ABTS 與 5×10-4 M ADS 在不同溶劑下，50℃水浴加 熱反應液之吸收度的變化趨勢圖：純水溶液 (●)；甲醇 (◆)；10%甲醇 水溶液(▲)；0.085 M 的 CH3COOH/NH4水溶液 (pH=4.53) (■)；0.025 M 的 NH4OH 水溶液 (pH=9.63) (
×
)針對以 ADS 氧化所得 ABTS●+的安定性進行研究，可以發現相較處 於 PDS 的環境，ABTS●+的降解速率差異不大 (圖 4-13)，此外將溶液儲 存於低溫則能夠有效減緩 ABTS●+的降解速率，各種不同合成路徑和儲存 條件下，ABTS●+的降解速率(%/hr)整理列於表 4-1，降解速率的計算為
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((A24 hr - A0)/A0)/24hrs ×100%)。所合成的 ABTS●+反應液皆儲存 0℃冰塊 水中，使用時再退冰到室溫來確保 ABTS●+有良好的安定性，使後續進行 VESI-MS 實驗能有再現性，提高實驗的可信度。
圖 4- 13 不同氧化條件之 ABTS●+溶液的降解速率曲線：ADS/ABTS=2 在水溶液中以 25℃保存(■)；ADS/ABTS=2 在水溶液中以 0℃保存(●)；
PDS/ABTS=2 在水溶液中以 25℃保存(
▲
)表 4- 1 不同條件生成之 ABTS●+的降解速率(%/hr)
ABTS
●+ 合成的條件與保存環境 降解速率(%/hr)ADS/ABTS=2 在水溶液中保存在 25℃ 2.8 ADS/ABTS=2 在水溶液中保存在 0℃ 0.6 PDS/ABTS=2 在水溶液中保存在 25℃ 2.9
已知微波加熱方式較水熱合成法能大為縮短反應時間，研究中我們 也嘗試將 10 mL 的 2.5×10-4 M ABTS 與 5×10-4 M ADS 水溶液，置於家用 微波爐中進行反應。起初以約 426 W 的能量加熱溶液，加熱約 20 秒時，
溶液沸騰並且顏色由淡綠色轉變為深綠色，從經驗得知深綠色的顯現代
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表著 ABTS●+的生成，即刻將溶液取出冷卻至室溫後，以 UV 和質譜儀分 析 反 應 液 。 相 較於 水 熱 法 ， 以 微波 加 熱 法 約 1 分鐘 時 所 偵 測 到 的
A415nm(ABTS●+) ≈ 0.35，但相同反應時間下，在水浴中只有約 0.029 的吸
收度(圖 4-14)。同時反應液的質譜圖顯示，微波法生成的溶液中並沒有其 他顯著的副反應產生，而生成其他干擾物(圖 4-15)。
圖 4- 14 微波法與水熱法在反應 1 分鐘時的 UV 光譜圖
圖 4- 15 以微波法生成之 ABTS●+的質譜圖：(A) VESI(+)分析結果；
(B)VESI(-)分析結果
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於正電模式下分析反應液，顯示大部分的 ABTS 已經氧化而成 ABTS●+，而 m/z 434 和 m/z 259 則代表著仍有 ABTS 殘留在溶液之中，除 此之外並沒有生成其他副產物。負電模式的質譜圖則顯現 ABTS●-(m/z 513)與未氧化的 ABTS2- (m/z 256)，及過硫酸根(m/z 193)，沒有生成其他 副產物。因此微波加熱生成法可以大幅減少反應的時間，於短時間(<1 分 鐘)內達到極佳的 ABTS●+生成率，受限於家用微波爐加熱參數的不確定 性，我們研究只展示其可行性，並沒有進一步的深入探討。
相較於傳統以 UV 離線方式觀測 ABTS●+ 合成時系統的變化，VESI-MS 可以提供線上即時訊息，分析反應過程中對應 ABTS●+與 ABTS 的質 譜訊號 EIC 圖(圖 4-16)，顯示反應約 60 分鐘時 ABTS●+與[ABTS+H]+的 相對離子強度不再變化，暗示著 ABTS 已消耗完或不再反應。
圖 4- 16 ABTS●+的生成過程中 ABTS●+與 ABTS 的相對值變化
依據 ABTS●+的分子式 C18H18N4O6S4同位素分布，應為 m/z 514: m/z 515: m/z 516 = 100.0%:24.1%:19.1%，若有未反應的 ABTS 殘留在反應液 中，將會導致 m/z 515 強度的增加，使理論比值偏移而大於 24.1%。圖 4-16 中 m/z 515 的比例約為 m/z 514 的 25%時，顯示大部分的 ABTS 應該已
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消耗不見。未來 m/z 515 的比例可作為 ABTS 是否轉換成 ABTS●+生成率 的參考，省去另外使用 UV 觀測的步驟。