苯二胺同分異構物

雖然食物中的抗氧化物多為酚類化合物，而不是胺類化合物，但是 由於苯二胺為工業上使用的抗氧化劑，因此我們也分析了苯二胺異構物 與 ABTS^●+的混合液，探討苯二酚和苯二胺與 ABTS^●+反應時有何差異。

圖 4-60 的結果顯示苯二胺異構物與 ABTS^●+的反應約在 4 分鐘時，質譜 圖訊號強度即不再有明顯改變，而所推導出的對苯二胺、鄰苯二胺、間苯 二胺使 ABTS^●+的衰減率，依序為 83(±1) %、94(±0)%、97(±1)%(表 4-8)，

顯示三者抗氧化能力為間位>鄰位>對位。

圖 4- 60 1.25×10^-4 M 苯二胺的三種異構物使 2.5×10^-4 M ABTS^●+衰減的趨 勢圖

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表 4- 8 苯二胺異構物所獲得的 ABTS^●+衰減率(%)及 TEAC 值 苯二胺

ABTS

(±SD, n=3) TEAC (n=3)

對苯二胺 83(±1) 0.95

鄰苯二胺 94(±0) 1.08

間苯二胺 97(±1) 1.11

不同於苯二酚以間位的抗氧化力最弱，苯二胺異構物中以間位的抗 氧化力最強。由 VESI-MS 圖中也可以發現，雖然苯二酚和苯二胺苯環 上的官能基分別為-OH 和-NH2，具有相同的推電子之特性，但是兩者與 ABTS^●+反應的路徑似乎有所差異。

分析苯二胺三種異構 VESI-MS 資料，首先注意到間苯二胺的衰減率 (97[±1]%)相較於間苯二酚在反應第 4 分鐘時的衰減率(77[±2]%)提升了 20%，此外生成 m/z 619 與 m/z 621(圖 4-61)，如同間苯二酚的反應，m/z 621 是間苯二胺的自由基與 ABTS^●+ 結合生成的化合物，但是兩個自由 基可能有多種的結合處，此項推論來自 m/z 621 的 CID 圖譜顯示出複雜 的斷片模式，m/z 619 的 CID 圖則相對較為簡單(圖 4-62)。

圖 4- 61 不同階段下 2.5×10^-4 M ABTS^●+與 1.25×10^-4 M 間苯二胺混合液的 質譜圖:(A)混合前(ABTS^●+)；(B) ABTS^●+加入間苯二胺反應 4 分鐘

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圖 4- 62 間苯二胺與 ABTS^●+反應生成之訊號的 CID 斷片圖：(A)m/z 619 斷片資訊；(B)m/z 621 斷片資訊

此外 m/z 619 與 m/z 621 的 EIC 圖(圖 4-63)顯示，反應進行 1 分鐘後

m/z 621 的強度維持穩定，而 m/z 619 的強度則緩慢的增加，因此不排除

m/z 619 可能來自[m/z 621-H

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圖 4- 63 間苯二胺與 ABTS^●+反應生成 m/z 619 與 m/z 621 的 EIC 圖

不同於苯二酚系統的質譜圖中看不到[苯二酚+H]⁺，苯二胺為鹼性，

因此三種苯二胺的圖譜中應該會有[苯二胺+H]⁺的出現，已知三種苯二胺 的質子親和力(proton affinity；PA)為鄰苯二胺 (896.5 kJ/mol)、間苯二胺 (929.9 kJ/mol)、對苯二胺 (905.9 kJ/mol)。出乎意料外的，對苯二胺並沒 有生成[M + H]⁺，而對苯二胺的 PA 還大於鄰苯二胺，取而代之的，對苯 二胺與 ABTS^●+在反應初期生成了對苯二胺的自由基(m/z 108) [圖 4-64(B)]，顯示相較於另外兩個苯二胺異構物的自由基而言，對苯二胺的自 由基相對穩定而可以被偵測到，隨著反應時間的增長 m/z 108 離子也消失 了[圖 4-64(C)]，而對苯二胺的自由基之相對穩定度或許可以說明為何其 抗氧化力最弱，至於為何對苯二胺的自由基可以穩定存在，仍有待進一 步的探討。

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圖 4- 64 不同階段下 2.5×10^-4 M ABTS^●+與 1.25×10^-4 M 對苯二胺混合液 的質譜圖: (A)混合前(ABTS^●+)；(B) ABTS^●+加入對苯二胺反應 1 分鐘；

(C) ABTS^●+加入對苯二胺反應 4 分鐘

鄰苯二胺與 ABTS^●+反應時(圖 4-65)，並沒有如鄰苯二酚系統一樣生 成[M-2H^●+H⁺]，反而是出現 m/z 211 與 m/z 213，而 ABTS^●+的衰減率約為 94(±0)%，與鄰苯二酚的 87(±2)%有些許增加，顯示-NH2似乎較-OH 較有 利於 H^●的轉移，但是已知 O–H 的鍵解離能較 N–H 小，因此鄰苯二胺有 較強消除 ABTS^●+的能力不能單獨以鍵解離能解釋。至於 m/z 211 與 m/z 213，由本實驗室以往研究的結果，已知這兩者為鄰苯二胺在照光的環境 下進行光催化聚合或縮合反應所形成的化合物，但不可忽略的是，鄰苯 二胺與 ABTS^●+反應時所生成的鄰苯二胺自由基也可能進行聚合或縮合 反應。(圖 4-66)

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圖 4- 65 不同階段下 2.5×10^-4 M ABTS^●+與 1.25×10^-4 M 鄰苯二胺混合液 的質譜圖:(A)混合前(ABTS^●+)；(B) ABTS^●+加入鄰苯二胺反應 4 分鐘

圖 4- 66 鄰苯二胺與 ABTS^●+反應所生成的鄰苯二胺自由基進行之聚合或 縮合反應

我們同樣透過傳統 UV 偵測苯二胺異構物與 ABTS^●+在相同條件反應 4 分鐘的結果，並觀察三者的抗氧化能力與反應的情形(圖 4-67)。

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圖 4- 67 UV 偵測苯二胺異構物與 ABTS^●+反應 4 分鐘時的圖譜

圖 4-67 觀察到對苯二胺與 ABTS^●+的反應後，ABTS^●+在 415 nm 的吸 收值有大幅度下降，且無其他強烈吸收波長的生成，因為是離線的分析 方法，無法如 VESI-MS 可分析到 m/z 108 中間物訊號的生成，展現了 VESI-MS 可進行線上即時偵測，協助了解反應過程的優點；當以鄰苯二 胺為分析物時，除了 415 nm 的吸收度有降低外，在 445 nm 左右也有一 個新的訊號生成，猜測反應中生成之鄰苯二胺的自由基進行了縮合或是 聚合的產物，也就是 VESI-MS 所觀察到 m/z 211 或 m/z 213 的訊號，而 ABTS^●+還原成 ABTS(340 nm)的狀況明顯比對苯二胺良好；而間苯二胺 與 ABTS^●+的反應圖譜中，能看到 415 nm 的吸收度明顯較另外兩異構物 低，表示抗氧化能力是間苯二胺>鄰苯二胺>鄰苯二胺，與 VESI-MS 分析 的結果相符，而針對鄰苯二胺與對苯二胺之排序大小的結果與 2013 年 Bendary 等人的研究成果²⁷相比之下，可以發現雖然使用的自由基不同，

但得到的大小關係一致，也再次證實此技巧在分析異構物消除自由基能 力的可行性。而間苯二胺與 ABTS^●+反應時，雖然 ABTS^●+在 415 nm 的吸 收度是降低最多的化合物，但卻發現 ABTS 在 340 nm 的吸收度也是三者

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中最低的，且在 540 nm 有新的吸收波峰生成，推測是間苯二胺的自由基 與 ABTS^●+形成鍵結的化合物(即 VESI-MS 中觀察到的 m/z 619 或 m/z 621)，

使還原成 ABTS 的量較另外兩異構物少，也是導致 ABTS 的吸收波峰之 吸收值為三者最小的原因。

綜合苯二酚與苯二胺的結果，可以發現雖然兩者皆具有推電子能力 的取代基，但是苯環上取代基的相對位置對 ABTS^●+消除能力的影響卻不 相同，原有苯二酚異構物抗氧化活性大小為對位>鄰位>間位，但若改變 取代基成為苯二胺，則異構物抗氧化活性大小反轉為間位>鄰位>對位。

值得注意的是，以傳統的 UV/Vis 等光譜學研究抗氧化物質時，針對抗氧 化過程中成分的鑑定與變化較缺乏資訊，而由 VESI 的研究中，則可以獲 取反應中間產物或副產物的資訊，在抗氧化的反應機制上得到更多的瞭 解。

103 為 uric acid > vitamin C > Trolox > GSH > cys > glucose，除了 GSH 以外，

所得結果與文獻一致。除了 ABTS^●+訊號以外，進一步分析 VESI-MS 質 譜圖，可以協助瞭解抗氧化物與 ABTS^●+反應的過程，例如，Trolox 的脫