苯二酚和苯二胺抗氧化力的相關研究

Phenolic antioxidants(AH)被廣泛應用在食品科學、製藥廠與化工產業 上，也發展出很多方式來分析其結構對於活性上的影響(structure-activity relationship，SARs)，主要藉由其消除自由基的能力來定義分析物的活性，

以往會使用 DPPH^●分析簡單的酚類物質，而近期因 ABTS^●+的親水與親油 性之特性關係，科學家常以此為自由基研究結構與消除自由基能力的關 係，2000 年時 Van den Berg 等人²⁵則藉由 ABTS^●+探討不同數目的 aromatic hydroxyl group 的分子之消除自由基能力的快慢與能力，並分析反應 10 秒(反應速率快慢)與 6 分鐘(總能力)的 TEAC 結果，發現當 OH-group 數 目越多，反應速率緩慢，且消除自由基的能力也會因此而降低，顯示了苯 酚物質結構差異會影響消除自由基的能力。

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2003 年時 Arts 等人 ²⁶ 以 ABTS^●+分析 hydroquinone(對苯二酚)、

catechol(鄰苯二酚)、resorcinol(間苯二酚)三種異構物之消除自由基能力 (以 TEAC 表示)，並與 superoxide scavenging、peroxynitrite scavenging 及 lipid peroxidation 分析的結果相比較。作者實驗發現間苯二酚(resorcinol) 的抗氧化活性比對苯二酚(hydroquinone)及鄰苯二酚(catechol)小，但其 TEAC 值卻比其他兩者大，與其他三種分析方法相比，三種異構物的排序 都是以間苯二酚為最小(圖 2-10)，且因為-OH 在不同的位子上會有推、拉 電子基的關係而影響反應速率，間位是屬於拉電子基的關係，因此反應 速率較另外兩個為推電子基的異構物慢。

圖 2- 10 三種異構物在不同分析方法下的分析結果：

(由最左邊開始的 y 軸是 superoxide scavenging activity (IC50 鄰苯二酚:

0.014 mM, IC50間苯二酚: 0.91 mM, IC50對苯二酚: 0.014 mM)；lipid peroxidation (IC50鄰苯二酚: 10 mM, IC50間苯二酚: 1556 mM, IC50對苯二 酚: 156 mM)；peroxynitrite scavenging (IC50 鄰苯二酚: 2 mM, IC50間苯二 酚: 42.5 mM, IC50對苯二酚: 1.89 mM)；TEAC-values (鄰苯二酚:1.4, 間 苯二酚: 2.5, 對苯二酚: 1.3) ²⁶

然而導致有這樣的結果是因在光譜圖中發現間苯二酚與ABTS^●+反 應10秒時會進一步在550 nm左右生成一未知反應物(圖2-11)，然後消失形 成第二產物(470 nm)，但其他兩者並沒有此現象，因此作者推論此同分異

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構物消除自由基的能力無法完整的以TEAC表示。

圖 2- 11 ABTS^●+與間苯二酚的 30 秒內反應光譜圖變化(濃度為 10 μM )²⁶ 2004 年 Nenadis 等人 ⁴針對各種苯酚類物質之同分異構物(鄰、間、

對異構物)探討個別消除自由基能力的差異與結構的關係，文中作者借助 兩種自由基來分析苯酚物質消除自由基的活性，以 DPPH^●測試簡單苯二 酚及 polyhydroxylbenzoates 的活性，以 ABTS^●+測試 hydroxycinnamates 的 活性，並探討以上物質與游離能、OH 鍵能在活性排序上的關係。作者發 現以大致上消除自由基的能力與 OH 鍵能的曲線關係較吻合，並且比較 在乙醇與緩衝溶液為反應環境分析的 TEAC 值是有差異的，原因在於以 動力學上來看，陰離子的存在會影響消除自由基的能力，因此分析物於 不同溶劑導致 pKa 值的不同造成獲得的 TEAC 值有所差異。實驗中，作 者 也 以 DPPH^●測 試 鄰 、 間 、 對 位 的 苯 二 酚 分 析 下 降 率 結 果 是 鄰 位 (catechol)>對位(hydroquinone)>間位(resorcinol)與 Arts 等人的文獻中排序 相似²⁶，但以 ABTS^●+分析間位的光譜圖卻有出入(與圖 2-11 比較)，Nenadis 等人所做的光譜圖(圖 2-12)中 540 nm 左右的吸收度反而是隨反應時間而 增加，且未提到有第二產物的生成。

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圖 2- 12 ABTS^●+的 0-10 秒與 1-6 分鐘的光譜圖變化⁴

Bendary 等人²⁷在 2013 年時則探討了 phenolic 與 anilines compounds 結構與消除自由基能力的關係，作者使化合物都溶於乙醇中，再以 H2O2 -scavenging 與 DPPH^● scavenging 的分析方法觀測這些 compounds，並以 efficient concentration(EC50)和 antiradical efficiency(AE)計算以上這系列物 質的抗氧化能力。作者發現以 DPPH^●測得 phenolic compounds 的活性較 anilines compounds 大 ， 乃 是 phenolic compounds 擁 有 較 低 的 bond dissociation energy，因使其易失去 H 原子而導致，但 H2O2-scavenging 中 則是和苯環上的取代基之電負度相關，因-NH2的電負度較-OH 小，因此 較容易失去 H^●，使測得消除能力的結果與 DPPH^●系統相反，作者也表示 由於兩者反應的機制不同而使分析結果有如此的差異。實驗中，作者分 析苯二酚的抵銷自由基能力的排序在兩種方法的測試結果中皆得到鄰苯 二酚>對苯二酚>間苯二酚，作者提出在 H2O2-scavenging 的機制中是因鄰 位化合物的苯氧基與自由基反應時，會產生分子內的共振與分子內的氫 鍵，使分子穩定，因而容易讓鄰位化合物繼續被氧化，而 DPPH scavenging 的機制則只有牽涉到分子內氫鍵的強弱，然而對位化合物和 ROO^●反應後 的苯氧基化合物會和空氣中的氧氣繼續反應生成另一化合物，減少了和

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ROO^●的反應，因此消除自由基的活性較鄰位不佳，間位則是因 OH group 會有些立體障礙，而使其消除自由基的活性更不佳。而苯二胺的消除自 由基能力的排序在 DPPH-scavenging 與 H2O2-scavenging 的結果相同，反 應機制和苯二酚相似，因此抗氧化能力大小為鄰苯二胺>對苯二胺，在這 篇文中作者並沒有針對間苯二胺的抗氧化能力大小去做探討。

本研究將 VESI-MS 的技巧延伸至分析同分異構物對於抗氧化能力的 影響(SARs)，同樣取用苯二酚的三種異構物探討其消除 ABTS^●+的能力大 小來定義三者間的抗氧化能力，在不經過層析分離的情況下可即時偵測 反應的過程，了解三種異構物與 ABTS^●+反應的機制以解釋造成抗氧化能 力差異的原因，我們將進一步將苯環上的兩個-OH 取代基改成-NH2，藉 此探討取代基對於消除 ABTS^●+的能力之影響，而透過 VESI 即時偵測的 資訊，可獲取六種化合物分別與 ABTS^●+作用時的反應途徑，提供光學儀 器分析時無法獲取的資訊，可比較過去文獻中對於苯二酚與苯二胺之同 分異構物和自由基作用時的反應機制所提出的推論。

33 line-6-sulphonic acid)(ABTS)

514.62 Sigma 98

Vitamin C 176.12 Riedel-deHaën 99.7 Trolox 250.29 Sigma 97 Uric acid sodium salt 190.09 Sigma -

Glutathione 307.32 Sigma ≧98 Glucose 180.16 Acros 99 L-Cysteine 121.16 Sigma 97

o-Benzenediol (catechol)

p-Benzenediol (hydroquinone)

m-Benzenediol (resorcinol)