文氏管電噴灑游離質譜法(VESI-MS)在總抗氧化能力研究上的應用

I

國立高雄大學應用化學系(碩士班)

碩士論文

文氏管電噴灑游離質譜法(VESI-MS)在總抗氧化能力

研究上的應用

Studying of total antioxidant activity by Venturi electrospray

ionization mass spectrometry

研究生：李雅雯 撰

指導教授：何永皓 博士

III

謝誌

碩士班生活轉眼就要告一段落，兩年的生活經歷了不少令人印象深 刻的事情，除了修課及著手準備碩士論文的研究，還需負責計畫研究助 理的職務，從什麼都不懂到可獨立至行政單位處理相關事務，並從學習 進階的待人處事方法及將心比心的態度，雖然生活忙碌，卻很充實也很 有意義。而研究這條道路本該不會事事順心，如何永皓教授曾經和我們 說過“若是實驗一路順暢，那麼可學到的事物會少很多。”因此當我遇 到低潮時，雖然曾經有過放棄的念頭，但是積極與老師、學長姐討論過 後，就能豁然開朗，並且換個心情去面對困難。 在這裡我要特別感謝我的指導教授，何永皓教授，從我還是個什麼 都不懂的專題生到可獨立思考的研究生，一路上有您不辭辛勞、盡心盡 力、不厭其煩的教育，幫助我完成碩士論文，在您實驗室裡的這段時間， 不管在生活、課業或是思維都影響我很多，所學習到的事情不只有化學 專業的知識，更培養了自己能獨立思考及解決問題的能力，讓自己的思 想能更成熟，並設身處地地替人著想，豐富了我的碩士生活，並期待能將 這些想法與知識應用在未來的生活中。另外也要感謝 古國隆教授及 劉 福鯤教授能夠抽空蒞臨擔任我的口試委員，並給予我的碩士論文很多建 議與指教，讓這份研究論文能夠更加完整。 加入實驗室的這幾年，感謝曾經幫助過我的學長學姊，交給我實驗 基本觀念，在實驗室中您們的態度總是正面積極，讓當時身為菜鳥專題 生的我不敢有懈怠，也因此學習到許多知識和技巧，讓我後來能很快適 應碩士班生活，對於實驗能更快上手。特別感謝吳銘儒學長，當時您正趕

IV 畢業，但總會在我遇到任何疑難雜症時給予協助，雖然後來您畢業了，但 當我在研究上或情緒面臨低潮向您訴苦時，也會給予關心及勉勵，讓我 又有動力繼續努力下去。 感謝尚霖、宗翔從大學就陪伴我到碩班，雖然我們在不同的實驗室 裡為自己的未來奮鬥，但有抽空就會一起吃飯聊天、出去玩，讓我的碩士 生活多采多姿不孤單；也感謝聖文一路上的陪伴、鼓勵、支持及幫助；謝 謝冠嶧學長、景弘學長、宛蓉學姊、雅鈞學姊幫助我解開生活與研究上鬱 悶的心結並給予鼓勵；還有實驗室裡學弟學妹們的陪伴，讓我在苦悶的 研究生活中也能一同經歷許多歡樂的事情。 最後感謝我的家人給予我各方面的支持，讓我能自由的發展，可以 無後顧之憂得攻讀碩士班，並在我低潮的時候給予鼓勵，在緊張的時候 給我信心，在生病的時候給予照顧和關心，未來也將發揮長才，為自己的 生活努力不讓爸媽操心，謝謝你們! 中華民國一○六年八月三十日 李雅雯

V

目錄

中文摘要 ... 1 英文摘要 ... 3 第一章 前言 ... 5 第二章 文獻回顧 ... 7 2.1 分析抗氧化能力方法之介紹 ... 8 2.2 檢測物質抗氧化力的作法 ... 10 2.2.1 利用光譜分析法 ... 11 2.2.2 非光譜的分析方法 ... 24 2.3 ABTS●+的生成方式 ... 25 2.4 苯二酚和苯二胺抗氧化力的相關研究 ... 28 第三章 實驗方法 ... 33 3.1 藥品與儀器 ... 33 3.2 生成 ABTS●+方法 ... 34 3.2.1 AAPH 為氧化劑水熱法生成 ... 34 3.2.2 PDS 為氧化劑水熱法生成 ... 35 3.2.3 ADS 為氧化劑水熱法生成 ... 37 3.2.4 ADS 為氧化劑 microwave 方式生成 ... 37

VI 3.3 樣品配製方法 ... 38 3.3.1 抗氧化劑標準品配製 ... 38 3.3.2 真實樣品配製 ... 38 3.4 自動進樣(self-pumping)裝置 ... 40 3.4.1 sVESI 偵測 ABTS●+生成的過程 ... 41 3.4.2 sVESI 偵測物質的抗氧化能力方法 ... 41 3.4.2.1 正電模式分析 ABTS●+衰減程度 ... 41 3.4.2.2 負電模式分析抗氧化劑衰減程度 ... 43 3.4.3 dVESI 偵測的實驗方法 ... 43 第四章 結果與討論 ... 44 4.1 生成 ABTS●+的最佳化 ... 44 4.2 VESI-MS 線上即時偵測物質抗氧化能力的可行性... 57 4.2.1 已知抗氧化力物質的分析比較 ... 59 4.2.2 以 VESI(-)探討化合物的抗氧化力和反應機制 ... 71 4.3 VESI 於真實樣品抗氧化力上的研究 ... 75 4.3.1 三種不同品牌紅酒的總抗氧化力 ... 75 4.4.2 紅酒、紫色甘藍菜與紫色洋蔥的總抗氧化力探討 ... 83

VII 4.4 同分異構物抗氧化力之比較 ... 86 4.4.1 苯二酚同分異構物 ... 86 4.4.2 苯二胺同分異構物 ... 95 第五章 結論 ... 103 第六章 參考文獻 ... 107

VIII

表目錄

表 2- 1 Myoglobin/ABTS 與 ABTS●+ decolorisation method 測試抗氧化劑

之 TEAC 值 ... 12 表 2- 2 不同反應時間下各抗氧化劑之 TEAC 值(±SD, n=3) ... 13 表 2- 3 ABTS●+分別在血肌紅蛋白、過硫酸氫氧混合液與在 ABAP 混合 液中所測試樣品獲得的 TEAC 值 ... 14 表 2- 4 各種食品分別以 ABTS(pH=4.5)、DPPH●及 FRAP 測試 120 分鐘 時的 TEAC(μmol)(presented±SD) ... 16 表 2- 5 不同酒類以 DPPH●、ABTS●+及 FRAP 分析所得之總抗氧化力數 值(average±%RSD, n=3) ... 17

表 2- 6 以 EPR 方式檢測 white tea 萃取物與 ferulic acid 的訊號強度及樣 品使用量相對於 ferulic acid 使用量的 ratio 值 ... 23

表 2- 7 ABTS 與 PDS 在不同溶劑下的溶解度 ... 27 表 4- 1 不同條件生成之 ABTS●+_{的降解速率(%/hr) ... 54} 表 4- 2 不同氧化劑所生成之 ABTS●+_{與 vitamin C 反應的衰減率(%)} (±SD, n=3) ... 63 表 4- 3 各種抗氧化劑之 ABTS●+_{衰減率(%)及 TEAC 值 ... 64} 表 4- 4 單一物質與混合液中個別物質的衰減程度(%) ... 74 表 4- 5 三種廠牌紅酒之 ABTS●+_{的衰減率(%) ... 78} 表 4- 6 苯二酚異構物所獲得的 ABTS●+_{衰減率(%)及 TEAC 值 ... 91} 表 4- 7 以不同溶劑稀釋 ABTS●+_{後所造成的衰減率(%) ... 93} 表 4- 8 苯二胺異構物所獲得的 ABTS●+衰減率(%)及 TEAC 值 ... 96

IX

圖目錄

圖 2- 1 (A)Gala apple (, 1.2 g/100 mL)與維他命 C(, 2 mg/100 mL)分別

與 ABTS●+在37℃反應 10 分鐘所得到曲線圖;(B) Gala apple

(,1.2 g/100 mL)與維他命 C(, 2 mg/100 mL)分別與 DPPH●在 23℃反應 30 分鐘所得到曲線圖 ... 15 圖 2- 2 以 ABTS●+與 DPPH●檢測法檢測三大類食品的抗氧化力(mg VCE/100 g)長條圖 ... 18 圖 2- 3 不同品種蕎麥種子消除 DPPH●、O2●-(NBT test)、OH●的能力 ... 20 圖 2- 4 Koleva 等人研究抗氧化力所用的實驗設計圖 ... 21 圖 2- 5 Li 等人研究抗氧化力所用的實驗設計 ... 21 圖 2- 6 線上流動相互補系統串聯電化學偵測器裝置示意圖 ... 22 圖 2- 7 單管進樣(sVESI)及雙管進樣(dVESI)裝置圖 ... 24 圖 2- 8 ABTS 與氧化態 ABTS●+_{結構 ... 25}

圖 2- 9 (A)ABTS(0.15 mM)與 AAPH(5 mM)生成 ABTS●+_{的變化(空氣} 中:□，氧氣中:△，氮氣中:●)；(B) ABTS(0.15 mM)與 PDS(0.3 mM)生成 ABTS●+的變化(50℃: ●，25℃: □) ... 28 圖 2- 10 三種異構物在不同分析方法下的分析結果： ... 29 圖 2- 11 ABTS●+_{與間苯二酚的 30 秒內反應光譜圖變化(濃度為 10 μM )} ... 30 圖 2- 12 ABTS●+_{的 0-10 秒與 1-6 分鐘的光譜圖變化 ... 31}

X 圖 3- 2 以 UV/vis 檢視 PDS 氧化 ABTS 實驗之流程 ... 36 圖 3- 3 三種紅酒樣品... 38 圖 3- 4 紫色高麗菜 ... 39 圖 3- 5 紫色洋蔥 ... 39 圖 3- 6 sVESI 裝置示意圖 ... 40 圖 3- 7 dVESI 的裝置示意圖 ... 41 圖 3- 8 sVESI 的實驗裝置圖 ... 42 圖 3- 9 以 sVESI 檢測物質抗氧化能力實驗之流程 ... 42 圖 3- 10 dVESI 的實驗裝置圖 ... 43

圖 4- 1 以 AAPH 氧化生成 ABTS●+反應液顏色之變化: (A) ABTS 於醋酸 銨水溶液；(B) ABTS 於 50%甲醇水溶液 ... 45 圖 4- 2 以 AAPH 為氧化劑生成 ABTS●+反應 40 分鐘時反應液的 UV 圖 ... 45 圖 4- 3 不同條件下 ABTS 與 PDS 混合液之 UV 圖 ... 47 圖 4- 4 高濃度 ABTS 與 PDS 混合液所生成之黑色固體 ... 47 圖 4- 5 不同條件下 ABTS 與 PDS 混合液中 ABTS●+_{吸收度的趨勢圖48} 圖 4- 6 以 UV 觀察 ABTS●+_{的安定性 ... 49} 圖 4- 7 不同 PDS 與 ABTS 濃度比例所得 ABTS●+_{的安定性 ... 50} 圖 4- 8 ABTS(上)與 ABTS●+_{生成液(下)的質譜圖 ... 50} 圖 4- 9 圖 4-8 中針對 m/z 257、m/z 259 的推測結構 ... 51

圖 4- 10 不同條件下 ABTS 與 ADS 混合液中 ABTS●+_{吸收度的趨勢圖} ... 51

XI 圖 4- 11 以不同氧化劑氧化生成 ABTS●+的反應液質譜圖 ... 52 圖 4- 12 2.5×10-4 _{M ABTS 與 5×10}-4 _{M ADS 在不同溶劑下，50℃水浴加} 熱反應液之吸收度的變化趨勢圖 ... 53 圖 4- 13 不同氧化條件之 ABTS●+溶液的降解速率曲線 ... 54 圖 4- 14 微波法與水熱法在反應 1 分鐘時的 UV 光譜圖 ... 55

圖 4- 15 以微波法生成之 ABTS●+的質譜圖：(A) VESI(+)分析結果； (B)VESI(-)分析結果 ... 55

圖 4- 16 ABTS●+的生成過程中 ABTS●+與 ABTS 的相對值變化 ... 56

圖 4- 17 ABTS●+的實際質譜圖與標準質譜圖之比對 ... 57

圖 4- 18 VESI(-)偵測(A) 2.5×10-4 _{M ABTS 及(B) 2.5×10}-4 _{M ABTS 與} 5×10-4 M ADS 混合液中 ABTS●+的質譜圖 ... 58

圖 4- 19 ABTS●+水溶液與乙醇混合後以 VESI(-)分析結果 ... 58

圖 4- 20 不同階段 2.5×10-4 _{M ABTS}●+_{與 1.25×10}-4 _{M vitamin C 混合液的} 質譜圖 ... 60

圖 4- 21 ABTS●+_{與 vitamin C 反應時 m/z 514 與 m/z 515 之 EIC 圖 . 60} 圖 4- 22 不同 vitamin C 濃度使 ABTS●+_{衰減的趨勢圖 ... 62} 圖 4- 23 不同 vitamin C 濃度使 ABTS●+_{衰減的程度(%) ... 62} 圖 4- 24 各種抗氧化劑使 ABTS●+_{衰減的長條圖 ... 64} 圖 4- 25 各種抗氧化劑使 ABTS●+_{衰減的趨勢圖 ... 64} 圖 4- 26 不同階段 2.5×10-4 _{M ABTS}●+_{與 1.25×10}-4 _{M Trolox 混合液的質} 譜圖 ... 66

XII

圖 4- 28 推測 ABTS●+與 Trolox 的反應機制 ... 67

圖 4- 29 GSH 樣品及不同階段下 2.5×10-4 _{M ABTS}●+_{與 1.25×10}-4 _{M GSH}

混合液的質譜圖 ... 68

圖 4- 30 推測 ABTS●+與 GSH 的反應機制 ... 68

圖 4- 31 以 CID 鑑定 glutathione sulfinic acid(m/z 340)之結構 ... 69

圖 4- 32 Cys 樣品及 2.5×10-4 _{M ABTS}●+_{與 1.25×10}-4 _{M cys 混合液之質譜}

圖 ... 69

圖 4- 33 Uric acid 樣品及不同階段下 2.5×10-4 _{M ABTS}●+_{與 1.25×10}-4 _M

uric acid 混合液之質譜圖 ... 70 圖 4- 34 ABTS●+與 uric acid 反應之 EIC 圖 ... 71

圖 4- 35 不同抗氧化物質加入 ABTS●+後的下降趨勢圖 ... 72

圖 4- 36 四種抗氧化劑的混合液以及不同階段下與 6.25×10-5 _{M ABTS}●+

的反應過程質譜圖 ... 74

圖 4- 37 三種不同品牌的紅酒質譜圖(VESI+_{) ... 76}

圖 4- 38 2.5×10-4 _{M ABTS}●+_{與 10 mg 三種品牌紅酒的混合液質譜圖77}

圖 4- 39 ABTS●+_{與 Coronas 紅酒反應時，m/z 514 與 m/z 515 的 EIC 圖}

... 78

圖 4- 40 (A) ABTS(2.5×10-4 _{M)；(B) ABTS 與 10 mg 紅酒(Coronas) 混合}

的結果 ... 79

圖 4- 41 三種不同品牌的紅酒質譜圖(ESI-_{) ... 80}

圖 4- 42 (A)酒石酸；(B)蘋果酸 ... 80

XIII 圖 4- 44 三種廠牌紅酒批次加入 ABTS●+的個別離子訊號變化 ... 81 圖 4- 45 2.5 × 10-4 _{M ABTS}●+ _{與 20 mg 紅酒(Coronas)的混合前後之質譜} 圖(ESI-_{) ... 82} 圖 4- 46 不同食品使 ABTS●+衰減的程度(%) ... 83 圖 4- 47 紫甘藍菜樣品及不同階段下 2.5×10-4 _{M ABTS}●+_{與 4 mg 紫甘藍} 菜混合液的質譜圖 ... 84 圖 4- 48 紫色洋蔥樣品及不同階段下 2.5×10-4 _{M ABTS}●+_{與 4 mg 紫色洋} 蔥混合液的質譜圖 ... 85 圖 4- 49 2.5 × 10-4 _{M ABTS}●+_{及與 1.25 × 10}-4 _{M 苯二酚的三種異構物混} 合液之質譜圖 ... 87 圖 4- 50 推測鄰苯二酚與 ABTS●+反應機構 ... 88 圖 4- 51 間苯二酚與 ABTS●+反應生成之 m/z 623 的 CID 圖 ... 89 圖 4- 52 間苯二酚與 ABTS●+_{反應生成之 m/z 623 產生斷片途徑 ... 89} 圖 4- 53 間苯二酚與 ABTS●+_{反應中出現之 m/z 380 的 CID 圖 ... 89} 圖 4- 54 間苯二酚與 ABTS●+_{反應中出現之 m/z 380 產生斷片途徑 . 89} 圖 4- 55 推測間苯二酚與 ABTS●+_{反應之途徑 ... 90}

圖 4- 56 間苯二酚與 ABTS●+_{反應時，ABTS}●+_{與生成物的 EIC 變化90} 圖 4- 57 1.25×10-4 _{M 苯二酚的三種異構物使 2.5×10}-4 _{M ABTS}●+_衰減的 趨勢圖 ... 91

圖 4- 58 1.25 × 10-4 _{M 之 ABTS}●+_{的乙醇稀釋液及與 6.25 × 10}-5 _{M 苯二} 酚的三種異構物在乙醇溶液中混合之質譜圖 ... 92

XIV 圖 4- 59 以 UV 分析 1.25×10-4 _{M 苯二酚三種異構物與 2.5×10}-4 _M ABTS●+的反應狀況 ... 94 圖 4- 60 1.25×10-4 _{M 苯二胺的三種異構物使 2.5×10}-4 _{M ABTS}●+_衰減的 趨勢圖 ... 95 圖 4- 61 不同階段下 2.5×10-4 _{M ABTS}●+_{與 1.25×10}-4 _{M 間苯二胺混合液} 的質譜圖 ... 96

圖 4- 62 間苯二胺與 ABTS●+反應生成之訊號的 CID 斷片圖： (A)m/z

619 斷片資訊；(B)m/z 621 斷片資訊 ... 97 圖 4- 63 間苯二胺與 ABTS●+反應生成 m/z 619 與 m/z 621 的 EIC 圖98 圖 4- 64 不同階段下 2.5×10-4 _{M ABTS}●+_{與 1.25×10}-4 _{M 對苯二胺混合液} 的質譜圖 ... 99 圖 4- 65 不同階段下 2.5×10-4 _{M ABTS}●+_{與 1.25×10}-4 _{M 鄰苯二胺混合液} 的質譜圖 ... 100 圖 4- 66 鄰苯二胺與 ABTS●+_{反應所生成的鄰苯二胺自由基進行之聚合} 或縮合反應 ... 100 圖 4- 67 UV 偵測苯二胺異構物與 ABTS●+_{反應 4 分鐘時的圖譜 .. 101}

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文氏管電噴灑游離質譜法(VESI-MS)在總抗氧化能力

研究上的應用

指導教授：何永皓 博士 國立高雄大學應用化學系(碩士班) 學生：李雅雯 國立高雄大學應用化學系(碩士班) 摘要 本實驗室所開發的文氏管電噴灑游離質譜法(VESI-MS)，具有線上即時偵測的特 性，本研究利用 VESI-MS 分析抗氧化物和 ABTS 自由基陽離子(ABTS●+)的混合液，

藉由比較 ABTS●+與抗氧化物反應前後其強度衰減的程度，探討不同物質間總抗氧化 能力的差異。不同於傳統離線的光譜學方式，VESI-MS 除了可以提供物質總抗氧化 能力的資訊，更可以同時對反應中間產物和產物進行鑑定，追蹤反應過程中特定化合 物的變化，協助對抗氧化反應的機制進一步的了解。 為了方便 VESI-MS 的應用，我們首先改善了 ABTS●+的生成方式，以硫酸銨取 代傳統的硫酸鉀做為氧化劑，大幅降低質譜圖判讀上的複雜度和不確定性，反應近一 小時就能將 80~90%ABTS 轉換成 ABTS●+，若以微波加熱法取代水浴法，則可以進一 步加速 ABTS●+的生成。當以 VESI-MS 分析 vitamin C、Trolox、uric acid 等化合物各 別與 ABTS●+反應時，所得到的相對抗氧化能力與已知資料一致，展現了以 VESI-MS 探討物質總抗氧化能力的可行性和可信度。此外 VESI-MS 質譜圖顯示，反應時 Trolox● 會進一步反應生成 [Trolox- H2]，而 GSH●則聚合成的 GSH-GSH，顯示兩種不同的反 應途徑，證實使用 VESI-MS 有助於了解抗氧化的機制。將 VESI-MS 應用於紅酒和洋 蔥等樣品的研究時，雖然可以提供樣品相對總抗氧化能力的數據，但囿於含量和游離 效率等原因，並無法提供樣品中特定化合物的抗氧化途徑等相關內容。 針對同分異構物在抗氧化力上的差異性，我們比較了苯二酚和苯二胺的三種位置 異構物與 ABTS●+反應結果，顯示苯二酚異構物的抗氧化力大小依序為對位>鄰位>間 位，這與文獻報告間苯二酚具有最強的抗氧化力結果牴觸，當改以 UV/Vis 進行離線 分析或是更改溶劑或濃度，結果仍是顯示間苯二酚抗氧化力為最弱。至於反應途徑， 質譜圖顯示鄰苯二酚可進行脫氫生成 1,2-benzoquinone，間苯二酚則無法進行脫氫， 而是與 ABTS●+形成加成物。當改以苯二胺探討位置異構物效應，則抗氧化力大小依 序為間位>鄰位>對位，恰巧與苯二酚異構物排序相反，顯示雖然-OH 與-NH2同樣為

2 具有推電子能力的官能基，但與 ABTS●+反應時可能有不同的反應途徑，例如鄰苯二 胺與 ABTS●+反應時，所生成的鄰苯二胺自由基會進一步縮合成兩種不同的產物，而 在三種苯二胺異構物中，對苯二胺自由基陽離子相對穩定。間苯二胺的反應途徑則與 間苯二酚不同，而尚無法推導出符合觀察所得的中間產物或產物結構。 關鍵字：文氏管電噴灑游離質譜法、即時偵測、ABTS、抗氧化力、反應機制、同 分異構物、苯二酚、苯二胺

3

Studying of total antioxidant activity by Venturi

electrospray ionization mass spectrometry

Advisor: Dr. Yeung-Haw Ho Department of Applied Chemistry National University of Kaohsiung

Student: Ya-Wen Li

Department of Applied Chemistry National University of Kaohsiung

ABSTRACT

The Venturi electrospray ionization mass spectrometry (VESI-MS) developed by our laboratory was able to perform on-line real-time analysis. Here, we used VESI-MS to analyze compounds produced from reaction between antioxidant and ABTS●+. Total antioxidant activity was calculated based on relative intensity of ABTS●+ before and after addition of antioxidant. Not only investigated total antioxidant activities of sample, VESI-MS differ from off-line spectrometric methods can also identified intermediate and product generated from the reaction between antioxidant and ABTS●+. Results provided information regarding to reaction mechanisms of antioxidant activity.

First, we modified common ABTS●+ generating method. Potassium persulfate was replaced by ammonium persulfate to eliminate potassium adducts appeared in mass spectrum that complicated the interpretation of spectrum. About 80~90% of ABTS was converted to ABTS●+ after adding ammonium persulfate for one hour. Conversion rate was further accelerated by using microwave heating method. Results from studies of vitamin C, Trolox, and other antioxidants with VESI-MS were consistent with other research. It demonstrated that VESI-MS was capable to investigate total antioxidant activity. Mass spectrum obtained from Trolox system showed intermediate Trolox● was reacted to form [Trolox- H2]. In contrast with Trolox, glutathione (GSH) produced GSH-GSH. Studies of

total antioxidant activities of red wines and onion were unable to provide information related to reaction mechanisms.

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isomeric effect on antioxidant activities. The order of antioxidant activity of benzendiols was para->ortho->meta-position, which was inconsistent with meta-benzendiol has strongest antioxidant activity reported by other researcher. We further investigated the issue with off-line UV/Vis and different solvent and the results agreed with that obtained from VESI-MS. Different products were formed when benzendiols reacted with ABTS●+. ortho-Benzendiol underwent dehydrogenation to form 1,2-benzoquinone. On the contrary, meta-Benzendiol free radical cannot remove hydrogen atom but underwent addition reaction with ABTS●+. The order of antioxidant activity was reversed to meta->ortho->para- when antioxidants were changed to phenyldiamines. Among phenyldiamine free radicals, para-Phenyldiamine was the most stable. ortho-para-Phenyldiamine free radical was dimerized to two different products. meta-Phenyldiamine formed several products and the structure of these compounds are still unknown. The reaction mechanism of meta-Phenyldiamine is differ than that of meta-Benzendiol.

Key words: Venturi electrospray ionization mass spectrometry (VESI-MS), on-line monitoring, ABTS, antioxidant activity, reaction mechanism, isomers, benzendiol, phenyldiamine.

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第一章 前言

生物系統中的活性氧或自由基(reactive oxygen species, ROS or free radical)一直以來處於消除與生成的平衡狀態，因此其扮演了雙重角色， 微量可幫助生物體的代謝，但過多的自由基則可能會造成生物體的傷害， 例如老化、癌症、心血管疾病、免疫功能障礙或神經系統的病變。1_自然 界中有許多的天然物具有抗氧化的功能，例如蔬菜水果等，適時攝取這 些食品能抑制體內的活性氧與消除自由基以防止生物體受到傷害，因此 瞭解這些食品之總抗氧化能力是科學家們關注的重點。 以往常用光譜方法研究物質抗氧化力的強弱，使分析物與

2,2’-azino-bis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid (ABTS) 或

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)等具有發光團的自由基分子混合並以 UV-visible 觀 察吸光度變化來定義抗氧化力，或是偵測螢光物質添加抗氧化劑前後被 自由基(OH●_、O 2●-)抑制放光的程度來判斷，隨後也有以層析為主串聯質 譜儀或電化學儀器的線上方法，陸續被開發出來進行物質抗氧化力的研 究，但無法針對反應的過程有更詳細的了解。2-7 不同於現今使用的線上分析抗氧化力的方法，本實驗室將使用 2013 年由楊瑞崎所開發的自動進樣裝置 8_{，稱為文氏管電噴灑游離質譜法}

(Venturi electrospray ionization mass spectrometry, VESI-MS)來偵測物質的 總抗氧化能力。此方法藉由電噴灑游離源端所使用之 desolvation gas 在高 速流動時，於 ESI tip 的前端形成 Venturi effect 造成的壓力差來推動樣品 液以達到連續自動進樣的效果，並成功將其運用在即時偵測水楊酸水解

6 苯並咪唑的有機反應之過程、茶葉化學的實驗、果皮表面殘留農藥之偵 測及藍瓶實驗的氧化還原之反應，顯示了 VESI-MS 有即時偵測反應的優 點，並能廣泛的應用。 研究初期我們探討生成 ABTS●+的最佳化，並將方法應用至質譜儀上 進行分析，以單管進樣(sVESI)的方式即時偵測反應的過程，同時觀察自 由基生成時訊號的改變，輔助了解後續與抗氧化劑反應的資訊。

本研究也以 sVESI 即時偵測 ABTS●+與 vitamin C、水溶性維他命 E、

glutathione 等抗氧化物質反應的狀況，並收集連續的資料點繪出動力學的 變化來觀察不同物質使 ABTS●+衰減的趨勢與程度來比較抗氧化能力的 差異，但缺點是反應液沒有分離，可能有基質(ex:過硫酸銨)干擾判圖的情 形，而藉由雙管進樣(dVESI)的方式偵測分析物與基質的混合液以幫助我 們釐清圖譜上訊號的來源。因此 VESI-MS 提供了光譜法所無法獲得的資 訊，可偵測物質使 ABTS●+_{衰減的程度來定義抗氧化能力，也能協助我們} 推斷反應的機制，並且成功應用在分析食品的總抗氧化力。 將 VESI-MS 進一步應用於苯二酚和苯二胺的同分異構物(鄰位、間 位、對位)與 ABTS●+_{反應的探討，瞭解同分異構物中取代基的位置，或是} 相同位置不同取代基對削減 ABTS●+_{能力的影響，並藉由所得質譜圖資料} 嘗試理解反應機制。

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第二章 文獻回顧

過 去 許 多 研 究 報 告 指 出 活 性 氧 或 自 由 基 (oxygen free radicals or reactive oxygen species, ROS) 在生物系統處在平衡的機制下，以協助生物 體的代謝機能，但若濃度過高卻會造成生物體的傷害，在自然界所存在 的天然物中有能抑制活性氧與消除自由基的抗氧化劑，可消除過多的自 由基以維持生物體在正常的生理機制，因此天然物中所含有之抗氧化劑 的活性大小成為關注的焦點，近年來人們重視身體保健的議題而讓抗氧 化劑在生活中亦扮演重要的角色。1 在正常的生物體中應具有抗氧化防禦的能力，包含抗氧化酵素等來 防禦體內活性氧與自由基的傷害，如穀胱甘肽(glutathione，GSH)，而在 自然界中亦有天然的抗氧化劑，例如天然物中可能含有維他命 C、β-胡 蘿蔔素或維他命 E、酚類化合物及黃酮類物質等，因此了解這些天然物的 抗氧化能力即成為重要的議題。2, 10 一般在檢測物質抗氧化力的方式多是以光譜學方式進行，藉由偵測 自由基與抗氧化劑反應前、後之吸收度變化來判斷該物質的抗氧化能力， 機 制 上 分 為 兩 大 類 ， 一 種 是 靠 著 物 質 的 氫 原 子 轉 移 (hydrogen Atom Transfer; HAT)的能力來判斷抗氧化力大小，亦稱為質子耦合電子轉移

(proton Electron Transfer, PCET)，如:以 DPPH●分析抗氧化能力時，其與抗

氧化劑反應會形成 DPPH-H，而另一種則是靠著檢測電子轉移的能力來 推 測 抗 氧 化 力 (electron Transfer, ET) ， 如 : ferric reducing ability of

plasma(FRAP)或 oxygen radical absorbance capacity(ORAC)，但 ABTS●+的

8

說明。2, 3, 11

經過光譜偵測自由基與抗氧化劑混合前後的數值變化，科學家常會 以 不 同 的 定 義 方 式 計 算 各 種 分 析 物 間 的 抗 氧 化 能 力 ， 如 ： Trolox equivalent antioxidant capacity(TEAC) 、 vitamin C equivalent antioxidant capacity(VCEAC)等，可將光譜吸收度的變化量數據化較容易做比較，而 不同的研究團隊，開發來分析抗氧化能力的做法也有所差異。藉由與不 同的自由基運作下，以 UV 光譜分析物質的總抗氧化力，或者將樣品經 過 HPLC 分離後，和自由基反應的訊號變化來瞭解單一物質的抗氧化力。

2.1 分析抗氧化能力方法之介紹

分析抗氧化能力有許多種方式，大致上分兩類，分別為間接偵測總 抗氧化能力及直接偵測總抗氧化能力。間接偵測的方式最常使用的是 oxygen radical absorbance capacity(簡稱 ORAC)，先透過 Fenton-type 的反

應理由 H2O2在金屬(如:鐵、銅、鉻)的存在下反應生成 OH●，化學式如下：

Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- + OH●

當 檢 測 分 析 物 的 總 抗 氧 化 能 力 時 ， 將 OH● _{溶 液 與}

malondialdehyde(MDA)與 thiobarbituric acid(TBA)混合，原因是 MDA 與

TBA 可形成一加成物，並且在 UV 中有最大吸收波長 532 nm，而 OH●的 存在反而會抑制此加成物生成，使觀察到的 532 nm 吸收度不明顯，但若 在此溶液中添加了具有抗氧化能力的分析物後，OH●_{被消除有利於形成} MDA 與 TBA 的加成物，此時觀察到的 532 nm 強度上升，代表能消除的 OH●越多，則分析的樣品之抗氧化能力越強。5, 6 而 在 1999 年 Prio 等 人 以 2,2'-Azobis(2-amidinopropane)

9 dihydrochloride(以下簡稱 AAPH)自行解離所形成以碳原子為中心之自由 基分子會與螢光劑(luminol、crocin)結合產生螢光的特性，由螢光光譜儀 偵測螢光劑的放光的數值了解分析液中自由基的含量，當添加有抗氧化 能力的物質後可抑制自由基分子與螢光劑的結合，使螢光值產生改變， 抑制的程度則反映物質的抗氧化能力。12

直接偵測總抗氧化能力的方式最常見的有 ferric reducing ability of plasma(或 ferric antioxidant power，簡稱 FRAP)，此反應中不需要自由基

的參與，可藉由鐵離子(3+_{)還原成亞鐵離子(2}+_{)的能力來估算抗氧化劑的} 抗氧化力，通常使用 UV 偵測亞鐵離子(2+_{)在 593 nm 的吸收度變化量來} 量測分析物的總抗氧化能力，但並非所有具有抗氧化能力的物質都可將 鐵離子(3+_{)還原成亞鐵離子(2}+_{)，如生物體中常見的 GSH，已知其有消除} 自由基的能力，卻無法將鐵離子(3+_{)進行還原，因此需使鐵離子(3}+_{)與 H} 2O2 反應所生成 OH●_{與抗氧化劑進行消除反應，藉由偵測所添加的 MDA 及} TBA 結合形成加成物的狀況間接獲得分析物的抗氧化能力，此即為上述 ORAC 的方法。3, 12 另一個最常也是最廣泛被用來分析物質抗氧化能力的方式是 Trolox equivalent antioxidant capacity(簡稱 TEAC)，通常會配置多種濃度的 Trolox

當作標準品，再與2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)(以

下簡稱ABTS●+)深綠色的自由基分子進行反應，當 ABTS●+透過質子轉移

或是電子轉移的方式還原成 ABTS 時，在 415 nm(最大的吸收波峰)、645 nm、728 nm 的吸收度會產生變化，並藉由不同濃度的 Trolox 造成的

10

經由與 ABTS●+作用後產生的吸收度變化來換算成相對 Trolox 清除自由

基的濃度，以 TEAC 值表示(mM/mg)，例如 TEAC 值為 2 mM/mg 時，表 示 1 mM 的樣品濃度相當於 2 mM 的 Trolox，因此值越大，抗氧化能力越 強。3, 4, 11, 13

在 2002 年時 Kim 等人提出 vitamin C equivalent antioxidant capacity(簡 稱 VCEAC)定義總抗氧化能力，將標準品改成 vitamin C，並以不同濃度 之 vitamin C 與 ABTS●+結合後，紀錄下降量製作成檢量線，之後測試其 他抗氧化劑時，即將結果換算成相對 vitamin C 清除自由基的濃度。而檢 測抗氧化能力的自由基除了 ABTS●+，作者也以 DPPH●為媒介作分析，利 用其在 517 nm 下有較強的吸光值，當與抗氧化劑結合後，DPPH●會將抗 氧化劑上的質子轉移到自己身上而使原來的 517 nm 吸光度下降，若吸光 值越低則代表的抗氧化能力越強6_{，然而其結構的特性使其只能與脂溶性} 物質作用，因此偵測水溶性物質有一定的限制。14

2.2 檢測物質抗氧化力的作法

關於抗氧化能力檢測的研究多是以光譜方式進行檢測物質的抗氧化 能力，並且搭配不同的自由基及作法分析抗氧化劑標準品與真實樣品， 例如使抗氧化劑與自由基溶液混合後，計算反應時間並取點分析自由基 的吸收度之變化來得知分析物的抵銷自由基的能力。 在分析的作法上也陸續發展出線上的偵測方式，如 HPLC 後方接兩 台偵測器與 pump，使進樣的物質可同時觀察到分離後的結果並使其能繼 續和自由基溶液混合並偵測訊號變化以得到物質的抗氧化能力，並將方 法應用於偵測食品的抗氧化力及不同食品之間的差異。

11

也有一些研究採用 electron paramagnetic resonance(EPR)，即藉由 spin-trap 的試劑抓取未配對電子並使其在磁場中運動，以了解添加抗氧化劑 前後電子訊號之差異來定義分析物的抗氧化能力。 本研究將以實驗室所開發之 VESI-MS 的方式，針對物質的總抗氧化 能力進行分析，藉由質譜儀所提供的資訊同時了解自由基與抗氧化劑反 應時的反應路徑。

2.2.1 利用光譜分析法

發展抗氧化能力的分析前期多是以光譜方法來分析，藉由自由基與 抗氧化劑反應，使自由基可產生消除反應而使該光譜的吸收度出現變化。 1997 年 Miller 等人 15挑選 ABTS●+為檢測的自由基，藉由此自由基 可親水與親油的特性分析樣品並做排序。作者以兩種不同的方法生成

ABTS●+，一種是 metmyoglobin 在過氧化氫的存在下進行氧化，形成 ferryl

myoglobin radical，再去氧化 ABTS 形成 ABTS●+；另一種是以過硫酸鉀

來氧化 ABTS 形成 ABTS●+_{。已知其吸收波峰在 645 nm、734 nm 或 815}

nm，當 ABTS●+溶液加入不同濃度的 Trolox 後，ABTS●+吸收度會下降，

再藉由計算溶液中 ABTS●+_{的殘餘量製作成檢量線，並取用 ascorbic acid、}

α-tocopherol 及 uric acid 等化合物與 ABTS●+_{反應，以 TEAC 的表示法定}

義這些化合物間的抗氧化力，作者也將這兩種不同 生成方法得到的

ABTS●+來測試抗氧化劑，根據 UV 光譜於 734 nm 的吸收度變化之結果

以 TEAC 值表示如下表 2-1，可發現除了 ferulic、p-coumaric、caffeic acid 的差異約是 8-10%外，其餘化合物的 TEAC 都很接近，而總結所有物質 之抗氧化力，最大是 quercein，最小為 ascorbic acid、uric acid 及 α-tocopherol

12

且 TEAC 值皆在 1 左右，顯示三種化合物與 Trolox 的抗氧化力很接近。

表 2- 1 Myoglobin/ABTS 與 ABTS●+ decolorisation method 測試抗氧化劑

之 TEAC 值15 1999年時，Re等人11也因ABTS●+於水溶液系統或親油性系統都能應 用的特性，檢測黃酮類、肉桂酸類、類胡蘿蔔素、一般人體中常見之抗氧 化劑及食品的抗氧化力，實驗藉由UV光譜儀觀察ABTS●+的在特定波長下 的吸收度變化並以TEAC值定義所分析的物質之抗氧化力，作者將上列物 質與ABTS●+混合後之吸光度變化在反應1分鐘、4分鐘、6分鐘紀錄一次， 並以TEAC值表示法來比較各物質的抗氧化能力，結果如下表2-2，在這些 群組類型中，皆可看到化合物與ABTS●+的反應時間越長，大致上會使 TEAC值有所增長，並以類胡蘿蔔素的TEAC值最大，代表抗氧化能力為 最強，類黃酮類中的quercetin的抗氧化力也與類胡蘿蔔素差不多，肉桂酸 類的化合物次之，而相對弱的是人體中的抗氧化劑，而在此群組中除了 GSH較其他三種的TEAC值略大一些外，其餘三種的抗氧化能力值都很接 近1，代表這三種的抗氧化能力也與Trolox的能力相當。

13

研究也應用至食品的抗氧化力檢測的工作上，作者取來果汁萃取液 做為樣品分析，並且也能看到樣品隨著反應時間的增加，其TEAC值隨之 增加，藉此得知果汁的抗氧化力。

表 2- 2 不同反應時間下各抗氧化劑之 TEAC 值(±SD, n=3)11

同年，Van den Berg等人2也以ABTS●+為測試的自由基，作者表示過去

的生成方法中如以血肌紅蛋白和過硫酸氫氧化ABTS生成自由基，或是以 過硫酸鹽類合成ABTS自由基，皆可能對測定的TEAC結果產生干擾，因 而改以2,2’-azobis-(2-amidinopropane)(簡稱ABAP)為氧化劑生成ABTS●+ 以消除可能的干擾。作者以乙醇、THF等有機溶劑先以UV光譜儀分析樣 品與ABTS●+_{混合後在734 nm的波長吸收度之變化，並且轉換數據為} TEAC的數值以比對，發現在乙醇溶劑中獲得的TEAC數值較高，因此後 續實驗所有樣品之溶劑皆以乙醇來解決水溶性與脂溶性樣品的溶解度問 題。表2-3為過去生成方法與改良生成方法所測得的TEAC值，以10 sec的

Compounds 1 min 4 min 6 min

Plasma antioxidant

Ascorbic acid 1.05±0.02 1.05±0.03 No change α-tocopherol 0.89±0.05 0.97±0.06 No change

Glutathione 1.13±0.03 1.28±0.04

Uric acid 1.0±0.06 1.01±0.06 No change

Flavonoids Quercetin 2.77±0.02 3.03±0.02 3.1±0.05 Kaempferol 1.02±0.07 1.02±0.06 No change Hydroxycinnamates Ferulic acid 1.69±0.04 1.84±0.06 1.90±0.05 p-Coumaric acid 1.51±0.03 1.82±0.05 2.0±0.07

Caffeic acid 0.99±0.05 0.98±0.06 No change

Carotenoids

β-Carotene 2.47±0.03 2.57±0.03 No change Lycopene 3.01±0.13 3.08±0.10 No change

Food extracts

Orange juice 1.77±0.22 2.22±0.40 2.31±0.44 TEAC Persulfate Decolorization Assay

14 時間點為快速反應的數據，6 min為長時間的反應數據，並與舊有方法所 生成ABTS●+測得的數值比較，顯示作者改良生成方法測得的TEAC大致 上有提升，因此作者表示生成方法對於分析物質抗氧化能力上可能有影 響，於表2-3中也能看到常被使用的抗氧化劑如:維他命C(ascorbic acid)與 維他命E(α-tocopherol)的TEAC值很接近1，代表兩者與Trolox抗氧化力是 相差不遠的狀況，與其他文獻的結果相似。 表 2- 3 ABTS●+分別在血肌紅蛋白、過硫酸氫氧混合液與在 ABAP 混合 液中所測試樣品獲得的 TEAC 值2 2002 年 Kim 等人 14為了可將食品中的抗氧化物質以 mg/100 mL(或

g)表示，因而開發 VCEAC 法分析酚醛類的化學物質，包含 gallic acid、 quercetin、epicatechin、catechin、vitamin C、rutin、chlorogenic acid 與 Trolox，

以 ABTS●+_{與 DPPH}●_{的自由基分子分別針對以上物質進行氧化還原反應，}

採取光學儀器偵測 ABTS●+_{在 734 nm 波長或 DPPH}●_{在 517 nm 波長下的}

吸收度變化，並根據抗氧化劑用量對自由基分子產生的吸收度下降變化 繪製成直線關係，並以 VCEAC 值表示所測得的抗氧化力數值並做比較，

15

在 DPPH●系統中之排序為：gallic acid > quercetin > epicatechin > catechin

≧ vitamin C > Trolox > rutin > chlorogenic acid；而在 ABTS●+的系統中排

序則有些不同：gallic acid > quercetin > epicatechin > catechin > vitamin C > rutin > chlorogenic acid >Trolox，作者也提到會有兩者不同的結果的關

係乃是因使用測試的自由基不同而導致，並提及使用 ABTS●+為自由基的

優點是可在水溶性或脂溶性環境進行實驗，與分析物作用的時間相對短，

如在分析食品的實驗中以 ABTS●+或 DPPH●與 Gala apple 作用(圖 2-1)，

可發現氧化還原的速率在前 10 秒非常快速，然後隨著反應時間增加逐漸 緩慢，但因 DPPH●只能與脂溶性物質作用，反應性較無 ABTS●+的良好， 因而使其需要約 30 分鐘才能反應達平衡，但 ABTS●+的反應時間卻可以 縮短至 10 分鐘達到平衡，使 Gala apple 的結果與維他命 C 相比更能使其 抗氧化能力被凸顯出來。 圖 2- 1 (A)Gala apple (, 1.2 g/100 mL)與維他命 C(, 2 mg/100 mL)分別

與 ABTS●+_{在 37℃反應 10 分鐘所得到曲線圖;(B) Gala apple (,1.2 g/100}

mL)與維他命 C(, 2 mg/100 mL)分別與 DPPH●在 23℃反應 30 分鐘所得

到曲線圖14

根據許多文獻報導指出生活中的蔬果、蜂蜜或酒類飲品是目前已知 富含許多抗氧化劑的食品，包括抗壞血酸(維他命 C)，類黃酮，酚類，類 胡蘿蔔素衍生物及有機酸等的抗氧化物質，因此在 2006 年時 Ozgen 等人

16 16 _{以光學方法配合不同檢測方式來分析五種水果的總抗氧化力，實驗過} 程中作者分別以 ABTS●+(pH 值=4.5 與 7.4)、FRAP 與 DPPH●測試了紅莓、 黑莓、紅覆盆子、黑覆盆子及紫色葡萄的抗氧化力，如下表 2-4。 表 2- 4 各種食品分別以 ABTS(pH=4.5)、DPPH●及 FRAP 測試 120 分鐘 時的 TEAC(μmol)(presented±SD)16 作者發現黑色的莓果在不同的分析方法下得到的 TEAC 值相較於紅 色莓果都是比較大的，其中又以黑色覆盆子的 TEAC 值為最大，因此他 們推斷此為分析的樣品中抗氧化能力最強的水果。 食品中酒類飲品的抗氧化力分析也常是研究的對象，已知葡萄的抗 氧化物質多存在表皮、種子與莖上，且這些化合物的種類或含量可能也 會因產地的環境與氣候而有所不同，並且影響著酒的顏色與味道，在過 去已有人研究過類似的課題，但多著重在生化的性質研究，因此於 2007

年 Paixão 等人 17_{以 DPPH}●_、ABTS●+_{與 FRAP 分析法檢測紅酒、白酒及}

rosè wine 的抗氧化力，並以 Folin-Ciocalteu 試劑檢測酒類飲品中苯酚類 物質的含量，以了解其含量與抗氧化能力的關係，結果顯示三種方式的

分析下同樣是 ABTS●+_{測得的值較另外兩個方法的數值大，而下表 2-5 為}

實驗數據，可發現相同種類的酒不會因產地而使苯酚類物質含量差異太

Fruit extracts ABTS FRAP DPPH

Black raspberry 43.8 ± 1.9 93.1 ± 2.5 75.4 ± 1.5 Red raspberry 14.5 ± 0.2 34.7 ± 0.1 25.3 ± 0.4 Blackberry 19.2 ± 0.6 46.0 ± 2.6 35.0 ± 3.1 Purple grape 9.1 ± 0.2 26.6 ± 0.9 14.2 ± 0.4 Strawberry 11.5 ± 0.4 24.9 ± 0.7 15.9 ± 0.1 Assay methods

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大，因而彼此間的總抗氧化力也相差不大，但比較不同種類的酒時，可發 現紅酒的苯酚類物質含量較其他兩者高，使其有較強的抗氧化能力。

表 2- 5 不同酒類以 DPPH●、ABTS●+及 FRAP 分析所得之總抗氧化力數

值(average±%RSD, n=3)17

For the antiradical activity (AAR) measurements, samples were diluted 1:10.

a. Antiradical activity (Trolox equivalents – TRE). b. Reducing power (quercetin equivalents – QE).

於 2011 年時，Floegel 等人3_{以 ABTS}●+_{與 DPPH}●_{的自由基藉由 UV} 光譜儀檢測吸收度的變化來了解美國人飲食中常見的 50 種食品包含蔬 菜、水果與果汁飲料的抗氧化能力，並以第三種檢測方法(ORAC)來比較 兩種自由基檢驗對於這 50 種物質的檢測結果的準確性。他們發現因為 ABTS●+的有脂溶性與水溶性佳的特性，與 50 種食品的反應性都較 DPPH● 佳，因此與 ORAC 檢測的結果相關性很高，代表 ABTS●+較能準確分析物 質的抗氧化能力。將檢測數據換算成 mg VCE/100 g 來表示這 50 種食品 的抗氧化能力，並將食品歸納成三大類救即蔬菜、水果與果汁飲料，得到 下圖 2-2，顯示不管以哪種自由基所檢測出來的總抗氧化力中以水果的抗 氧化力為三者中最強的，其次是蔬菜，最弱的是飲料。

18 圖 2- 2 以 ABTS●+與 DPPH●檢測法檢測三大類食品的抗氧化力(mg VCE/100 g)長條圖3 在分析食品的研究上，慢慢有科學家會使用 HPLC/UV(或 PAD)並且 連接 MS 作為分析的工具，例如 2007 年時 Baltrušaitytė 等人18_發表的論 文中是以不同的地區、季節的蜂蜜作為探討抗氧化能力的題材，為使數 據有對照組的比較，使用 ABTS●+與 DPPH●之自由基分子與所有收集的樣 品混合並以 HPLC 結合 MS 做為偵測的工具，先針對所有與抗氧化劑有 關的物質進行層析，再以物質之滯留時間判定混合物中的物質種類，以 積分面積等作為計算的根據，並藉由 MS 中的資料了解所收集之蜂蜜的 成分與抗氧化能力，結果發現花粉蜜的 kaempferol 含量較蜂蜜高，因此 抗氧化能力比蜂蜜高。文中也提到和 Kim 等人的研究中 14_{相同的看法，} 因 ABTS●+屬水、脂溶性物質，相較於 DPPH●的測定時間都可以有效縮短， 且呈現的能力皆比 DPPH●高。在同年 Ahn 等人19_{以類似的題材作為研究，} 取自中國各地所產的蜂膠為樣品，同樣以 HPLC-PDA 與 MS 連用，先將 樣品進行分離後，以 ABTS●+與 DPPH●做測試，藉由觀察分析物在添加自

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由基前、後的吸收度差異了解各地蜂膠中所含苯酚類、類黃酮類物質的 含量來得知各地蜂膠的抗氧化力與差異。作者發現於不同地點所產之蜂 膠，成分會因當地環境與氣候而有差別，具有強大抗氧化能力的蜂膠內 所含物質通常是 caffeic acid、ferulic acid 與 caffeic acid phenethyl ester， 其中以雲南所產之蜂膠所測出來抗氧化物質含量最高，因而為所有樣品 中擁有最佳抗氧化能力的產品。 2015 年時，Kiprovski 等人5以不同品種之蕎麥種子維分析對象，作 者使用 HPLC/DAD-MS 作為分析工具，藉此得知蕎麥種子的主要成分之 差異，並且以 HPLC 的積分面積計算物質含量。他們先參考 1983 年 Doke 等人的方法 20_{將 O} 2●-、nitroblue tetrazolium(NBT)及各個蕎麥種子混合， 而蕎麥種子的存在可抑制 O2●-使 nitroblue tetrazolium(NBT)還原，並以 560 nm 的吸收度來分析 NBT 被還原的程度大小來估算不同品種之蕎麥種子 的抗氧化能力。作者也使用 DPPH●_{與 OH}●_{的自由基測試這些蕎麥種子被} 抑制的程度以估算不同品種的蕎麥種子抵銷自由基的能力，並比較這三 種分析方法測得的抗氧化能力之差異。 所得結果如圖 2-3，他們發現以 O2●-為自由基與 NBT 結合的方式測 出的數值是三種方法中最低的，比較品種的不同時，則發現其中 Lokve 品 種的蕎麥種子在三種檢測方法中為所有蕎麥種子中抵銷能力較差的，而 Novosadskay 品種反而只有在 DPPH●與 OH●的分析方法下是所有種子中 消除自由基能力最好的，作者解釋不同自由基測試這些品種蕎麥種子獲 得的大小排序不同之原因可能和其與不同品種的蕎麥種子混合後之反應 性好壞有關，其中也提到這些不同品種的蕎麥種子之抗氧化能力普遍都

20 很強，因此在人類飲食中對於健康的重要性。 圖 2- 3 不同品種蕎麥種子消除 DPPH●、O2●-(NBT test)、OH●的能力5 隨著分析方法的演進，有些科學家提出以線上偵測的方式分析物質 的抗氧化力，因此於 2001 年 Koleva 等人 21_{以 HPLC 為進樣的方法讓經} 前處理的樣品進入管柱中進行分離，並以 UV 或 PDA 為偵測器了解分離 後訊號的分布情形，接著溶液不流至廢液桶，而是在另一端接上一個

pump 注入 ABTS●+，使分離後的物質與其在 reaction coil 中進行反應後，

在後端再使用另一台 UV/Vis 偵測器偵測反應後的情形，最後即有兩張圖 譜可以對照，藉此了解混合物中具有抗氧化力的訊號分布(圖 2-4)，但此 方法只能使用定量方式計算此混合物的抗氧化力卻無法明確對物質作定 性。

21 圖 2- 4 Koleva 等人研究抗氧化力所用的實驗設計圖21 2007 年時 Li 等人 1_{也使用相似的裝置分析 ABTS}●+_{與油品的氧化還} 原反應之情形，並且於 DAD 後方接上質譜儀以了解樣品中的成分(圖 2-5)。 圖 2- 5 Li 等人研究抗氧化力所用的實驗設計1 而線上分析的方式除了光學儀器連用質譜儀外，也可以連用電化學 方法來分析抗氧化劑的抗氧化力，2011 年嘉義大學古國隆老師的實驗室 開發了 HPLC-ECD(HPLC-electrochemical detector)的線上偵測法，裝置示 意圖如圖 2-6。10

22

圖 2- 6 線上流動相互補系統串聯電化學偵測器裝置示意圖10

上圖 2-6 在 UV 後方接上網版印刷電極來同時側抗氧化劑的氧化電 位，同時以氧化還原電位去定義抗氧化指數。

在 抗 氧 化 能 力 的 分 析 上 ， 也 有 科 學 家 以 electron paramagnetic resonance(EPR) 則 是 以 spin-trap 的 試 劑 (ex: 5,5-dimethyl-1-pyrroline-N-oxide，DMPO)抓取溶液中未配對電子後，使其在磁場中產生作用力而震 動，藉由偵測器了解磁場中電子運動的強度來判斷溶液中電子的多寡， 當自由基與抗氧化劑混合時，則溶液中的自由基被消除，在 EPR 的分析 下會發現電子運動的強度有下降的情形，因此當運動強度越小，表示分 析物消除自由基的能力佳。7 食品中含有各式的醣類，2003 年 Morelli 等人 6_{則以 EPR 的方式分} 析各式醣類消除自由基的能力來了解抗氧化力，作者同時也使用另外兩 種光譜的分析方法作為對照組，比較兩種方式的差異。作者以 Fenten

reaction 方式合成實驗所需的自由基(OH●)，並以不同醣類(deoxyribose、

sucrose、maltose、glucose、fructose、sorbitol)進行混合以光譜與 EPR 偵

23 下的吸收度變化差異都不大，而以 OH●為自由基，在 EBT 的協助下分析 以上醣類的變化，只有在 deoxyribose 與 sucrose 的吸收度上隨濃度變化 較顯著，但若使用 EPR 方法分析醣類顯示消除自由基的狀況都比光學方 法來的佳，且可發現雙醣如:maltose 與 sucrose 消除 OH●的量較多，因此 作者提出以 EPR 為檢測醣類消除自由基的能力的最佳方式，並且得到雙 醣抵銷自由基的能力較單醣強的結論。 許多文獻指出茶類飲品中含有兒茶素等相關衍生物，是具有抗氧化 力的物質，因此常是科學家研究的對象，2014 年時 Azman 等人22_{以 white}

tea 為目標物，成功的使用 EPR 的檢測方式了解 white tea 抵銷自由基的 能力，並以 ferulic acid 為標準品做為比較的對象，如下表 2-6，作者發現 無論是 white tea 萃取物或是 ferulic acid 的濃度提升，都會使 EPR 測得的 訊號強度降低，代表消除自由基的能力會隨之提升，而固定測得的 EPR 訊號強度時，white tea 萃取物的用量又比標準品 ferulic acid 少，因此作 者推論含有兒茶素相關衍生物的 white tea 消除自由基的能力比 ferulic acid 佳。

表 2- 6 以 EPR 方式檢測 white tea 萃取物與 ferulic acid 的訊號強度及樣

24

2.2.2 非光譜的分析方法

除了借助光學儀器分析物質消除自由基的能力之方法外，本研究欲 以實驗室在 2013 年所開發的自動進樣裝置來作為分析物質總抗氧化能力 的 工 作 ， 此 技 巧 稱 為 文 氏 管 電 噴 灑 游 離 質 譜 法 (venturi electrospray

ionization, VESI)8，藉由電噴灑游離源端所使用之 desolvation gas 在高速

流動時，於 ESI tip 的前端形成 venturi effect 造成一壓力差來推動樣品液 以達到連續自動進樣的效果，如圖 2-7 的裝置圖，可分完單管進樣(sVESI) 及雙管進樣(dVESI)的裝置，並且成功將其運用在偵測蛋白質水解反應、 水楊酸水解反應過程與 Backmann rearrangement 的動力學變化。 圖 2- 7 單管進樣(sVESI)及雙管進樣(dVESI)裝置圖 到了 2014 年更將 VESI 作廣泛的應用，包括苯並咪唑的有機反應， 可以 sVESI 的方式即時偵測反應的變化過程，並借助 dVESI 偵測反應中 可能出現的中間產物之鑑定，除此之外，在茶葉化學的分析實驗、果皮表 面所附著農藥之偵測以及藍瓶實驗的氧化還原之反應也有不錯的研究成 果，展現了 VESI 系統在質譜儀上廣闊的應用面 9_{，因此本研究將擴展}

25 VESI 的應用至偵測物質的總抗氧化能力，藉由 sVESI 能即時偵測的優 勢，了解抗氧化劑與自由基反應時的變化過程，並推導出可能發生的反 應機制，所能獲取的資料是光學儀器所無法提供的資訊，因而展現了 VESI 在偵測物質總抗氧化能力的優勢。

2.3 ABTS

●+

的生成方式

當 ABTS 與 氧 化 劑 如 ： 2,2'-Azobis(2-amidinopropane)

dihydrochloride(以下簡稱 AAPH)或 potassium persulfate (K2S2O8，以下簡

稱 PDS)進行氧化形成 ABTS●+_{，與抗氧化劑進行反應後，ABTS}●+_則會被 還原回 ABTS 的型態16_{，如圖 2-8。} 圖 2- 8 ABTS 與氧化態 ABTS●+結構 許多相關的研究中，科學家已發展出多種生成ABTS●+_{的方法，Miller} 等人於1997年時的研究中15_{，藉由血肌紅蛋白與H} 2O2的作用形成ferryl

myoglobin radical，之後添加到ABTS的phosphate buffered saline(PBS，

pH=7.4)的溶液中使ABTS能夠被氧化成ABTS●+，維持溶液在734 nm的吸

收度為0.700±0.02，並於暗室儲存以便後續分析抵銷自由基能力的實驗用。

但2002年時，Kim等人14_{則是選擇以AAPH為氧化劑，加入至ABTS}

的PBS溶液中(100 mM，pH=7.4)，使ABTS的濃度為2.5 mM，而AAPH 的濃度為1 mM，並將反應液置於68℃的水浴中持續加熱反應13分鐘後

26

可得到ABTS●+，調整ABTS●+溶液的734 nm的吸收度為0.650±0.02，並同

樣保存在暗室中備用，除此之外作者所使用的自由基溶液則是每天新鮮 配置。

Floegel 等人 3雖同樣以 AAPH 為試劑，並同樣使 ABTS 溶在 pH 值

為 7.4 的 PBS 溶液中，且兩者總濃度分別是 1 mM 與 2.5 mM，但與 Kim 等人的配方不同的是 PBS 的濃度為 10 mM，因此同樣於 68℃的水浴加 熱，則需要 40 分鐘才能得到 ABTS●+，並維持 734 nm 的吸收度為 0.650 ±0.02 以作為後續實驗用的溶液。 有些研究生成 ABTS●+時會使用過硫酸鹽類作為氧化劑，Re 等人 11 即以 PDS 為氧化劑來氧化 ABTS，他們先配置 7 mM 的 ABTS 水溶液， 並與 2.45 mM 的 PDS 混合在常溫的暗室中反應 12-16 小時以得到 ABTS●+， 分析強度時才以 pH 值為 7.4 的 PBS 溶液稀釋後偵測 734 nm 的吸光度維 持在 0.7±0.02；而 2006 年時 Ozgen 等人 16_{的研究中也以同樣的比例使} ABTS 與 PDS 進行反應，但作者以兩種不同 pH 值生成 ABTS●+，他們發 現當以 pH 值為 4.5 的醋酸緩衝液為溶劑所生成的 ABTS●+_{之穩定性較 pH} 值為 7.4 的佳，但缺點是 ABTS●+_{與抗氧化劑反應達到平衡需要較長的時} 間進行；而科學家也探討在不同溶劑下生成 ABTS●+_{與其穩定性的研究，} 在 2013 年時由 Guedes 等人23_{的針對 ABTS} 與 PDS 的溶解度做測定，以決定生成自由基時的最佳的溶劑，並了 解這些溶劑下 ABTS●+_{的穩定性，如表 2-7 則顯示了不同溶劑下 ABTS 與} PDS 是否可溶解的結果。

27

表 2- 7 ABTS 與 PDS 在不同溶劑下的溶解度23

由表 2-7 結果可發現 ABTS 不溶於 acetone 與 chloroform 溶液中，在 醇類或水溶液都可溶解，而 PDS 則是不溶於 acetone 與乙醇，而作者也 探討在不同溶劑下生成 ABTS●+_{的狀況，並且使 ABTS 與 PDS 在每個溶} 液中的濃度分別是 7 mM 與 2.45 mM，並且於室溫下進行反應，且得知 在 純 水 中 需 6 個 小 時 ， ethanol/water(1/1) 的 溶 液 需 要 11 小 時 ， methanol/water(1/1)的溶液需要 8 小時，而 acetone/water(1/1)的溶液下則 需要至 26 小時，是所有溶劑中時間最長的，作者也針對以上各個溶劑下 自由基的穩定性做測試，並發現在 acetone/water(1/1)的溶液是最不穩定的， 而在 methanol/water(1/1)溶液下是所有溶劑中能穩定至少 22 小時的配方。 然而不同的研究團隊所使用配方皆不盡相同，在 2002 年 Henriquez 等人 24 _{也針對 AAPH 與 PDS 做了一系列探討，同樣是 0.15 mM 的} ABTS/PBS，分別與 5 mM 的 AAPH 試劑於 45℃水浴中反應或 0.3 mM 的 PDS 反應在常溫與高溫下反應並將所有結果進行比較，作者發現 PDS 試 劑所需活化能比 AAPH 低，因此同樣於高溫與常態之下生成 ABTS●+_所 花費時間相對較短(如圖 2-9)，藉此節省實驗的時間。

28

圖 2- 9 (A)ABTS(0.15 mM)與 AAPH(5 mM)生成 ABTS●+的變化(空氣

中:□，氧氣中:△，氮氣中:●)；(B) ABTS(0.15 mM)與 PDS(0.3 mM)生成 ABTS●+的變化(50℃: ●，25℃: □) 24

2.4 苯二酚和苯二胺抗氧化力的相關研究

Phenolic antioxidants(AH)被廣泛應用在食品科學、製藥廠與化工產業 上，也發展出很多方式來分析其結構對於活性上的影響(structure-activity relationship，SARs)，主要藉由其消除自由基的能力來定義分析物的活性， 以往會使用 DPPH●分析簡單的酚類物質，而近期因 ABTS●+的親水與親油 性之特性關係，科學家常以此為自由基研究結構與消除自由基能力的關

係，2000 年時 Van den Berg 等人25_{則藉由 ABTS}●+_{探討不同數目的 aromatic}

hydroxyl group 的分子之消除自由基能力的快慢與能力，並分析反應 10 秒(反應速率快慢)與 6 分鐘(總能力)的 TEAC 結果，發現當 OH-group 數 目越多，反應速率緩慢，且消除自由基的能力也會因此而降低，顯示了苯 酚物質結構差異會影響消除自由基的能力。

29

2003 年時 Arts 等人 26 以 ABTS●+分析 hydroquinone(對苯二酚)、

catechol(鄰苯二酚)、resorcinol(間苯二酚)三種異構物之消除自由基能力 (以 TEAC 表示)，並與 superoxide scavenging、peroxynitrite scavenging 及 lipid peroxidation 分析的結果相比較。作者實驗發現間苯二酚(resorcinol) 的抗氧化活性比對苯二酚(hydroquinone)及鄰苯二酚(catechol)小，但其 TEAC 值卻比其他兩者大，與其他三種分析方法相比，三種異構物的排序 都是以間苯二酚為最小(圖 2-10)，且因為-OH 在不同的位子上會有推、拉 電子基的關係而影響反應速率，間位是屬於拉電子基的關係，因此反應 速率較另外兩個為推電子基的異構物慢。 圖 2- 10 三種異構物在不同分析方法下的分析結果：

(由最左邊開始的 y 軸是 superoxide scavenging activity (IC50 鄰苯二酚:

0.014 mM, IC50間苯二酚: 0.91 mM, IC50對苯二酚: 0.014 mM)；lipid

peroxidation (IC50鄰苯二酚: 10 mM, IC50間苯二酚: 1556 mM, IC50對苯二

酚: 156 mM)；peroxynitrite scavenging (IC50 鄰苯二酚: 2 mM, IC50間苯二

酚: 42.5 mM, IC50對苯二酚: 1.89 mM)；TEAC-values (鄰苯二酚:1.4, 間

苯二酚: 2.5, 對苯二酚: 1.3) 26

然而導致有這樣的結果是因在光譜圖中發現間苯二酚與ABTS●+反

應10秒時會進一步在550 nm左右生成一未知反應物(圖2-11)，然後消失形 成第二產物(470 nm)，但其他兩者並沒有此現象，因此作者推論此同分異

30 構物消除自由基的能力無法完整的以TEAC表示。 圖 2- 11 ABTS●+與間苯二酚的 30 秒內反應光譜圖變化(濃度為 10 μM )26 2004 年 Nenadis 等人 4針對各種苯酚類物質之同分異構物(鄰、間、 對異構物)探討個別消除自由基能力的差異與結構的關係，文中作者借助 兩種自由基來分析苯酚物質消除自由基的活性，以 DPPH●測試簡單苯二

酚及 polyhydroxylbenzoates 的活性，以 ABTS●+測試 hydroxycinnamates 的

活性，並探討以上物質與游離能、OH 鍵能在活性排序上的關係。作者發 現以大致上消除自由基的能力與 OH 鍵能的曲線關係較吻合，並且比較 在乙醇與緩衝溶液為反應環境分析的 TEAC 值是有差異的，原因在於以 動力學上來看，陰離子的存在會影響消除自由基的能力，因此分析物於 不同溶劑導致 pKa 值的不同造成獲得的 TEAC 值有所差異。實驗中，作 者 也 以 DPPH●測 試 鄰 、 間 、 對 位 的 苯 二 酚 分 析 下 降 率 結 果 是 鄰 位 (catechol)>對位(hydroquinone)>間位(resorcinol)與 Arts 等人的文獻中排序 相似26_{，但以 ABTS}●+_{分析間位的光譜圖卻有出入(與圖 2-11 比較)，Nenadis} 等人所做的光譜圖(圖 2-12)中 540 nm 左右的吸收度反而是隨反應時間而 增加，且未提到有第二產物的生成。

31

圖 2- 12 ABTS●+的 0-10 秒與 1-6 分鐘的光譜圖變化4

Bendary 等人27_{在 2013 年時則探討了 phenolic 與 anilines compounds}

結構與消除自由基能力的關係，作者使化合物都溶於乙醇中，再以 H2O2

-scavenging 與 DPPH● scavenging 的分析方法觀測這些 compounds，並以

efficient concentration(EC50)和 antiradical efficiency(AE)計算以上這系列物

質的抗氧化能力。作者發現以 DPPH●_{測得 phenolic compounds 的活性較}

anilines compounds 大 ， 乃 是 phenolic compounds 擁 有 較 低 的 bond

dissociation energy，因使其易失去 H 原子而導致，但 H2O2-scavenging 中

則是和苯環上的取代基之電負度相關，因-NH2的電負度較-OH 小，因此 較容易失去 H●_{，使測得消除能力的結果與 DPPH}●_{系統相反，作者也表示} 由於兩者反應的機制不同而使分析結果有如此的差異。實驗中，作者分 析苯二酚的抵銷自由基能力的排序在兩種方法的測試結果中皆得到鄰苯 二酚>對苯二酚>間苯二酚，作者提出在 H2O2-scavenging 的機制中是因鄰 位化合物的苯氧基與自由基反應時，會產生分子內的共振與分子內的氫 鍵，使分子穩定，因而容易讓鄰位化合物繼續被氧化，而 DPPH scavenging 的機制則只有牽涉到分子內氫鍵的強弱，然而對位化合物和 ROO●反應後 的苯氧基化合物會和空氣中的氧氣繼續反應生成另一化合物，減少了和

32 ROO●的反應，因此消除自由基的活性較鄰位不佳，間位則是因 OH group 會有些立體障礙，而使其消除自由基的活性更不佳。而苯二胺的消除自 由基能力的排序在 DPPH-scavenging 與 H2O2-scavenging 的結果相同，反 應機制和苯二酚相似，因此抗氧化能力大小為鄰苯二胺>對苯二胺，在這 篇文中作者並沒有針對間苯二胺的抗氧化能力大小去做探討。 本研究將 VESI-MS 的技巧延伸至分析同分異構物對於抗氧化能力的 影響(SARs)，同樣取用苯二酚的三種異構物探討其消除 ABTS●+的能力大 小來定義三者間的抗氧化能力，在不經過層析分離的情況下可即時偵測 反應的過程，了解三種異構物與 ABTS●+反應的機制以解釋造成抗氧化能 力差異的原因，我們將進一步將苯環上的兩個-OH 取代基改成-NH2，藉 此探討取代基對於消除 ABTS●+的能力之影響，而透過 VESI 即時偵測的 資訊，可獲取六種化合物分別與 ABTS●+作用時的反應途徑，提供光學儀 器分析時無法獲取的資訊，可比較過去文獻中對於苯二酚與苯二胺之同 分異構物和自由基作用時的反應機制所提出的推論。

33

第三章 實驗方法

3.1 藥品與儀器

藥品名稱 分子量 (g/mol) 廠牌 純度 (%) 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazo

line-6-sulphonic acid)(ABTS)

514.62 Sigma 98 2,2'-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) 271.19 Aldrich 97 Potassium persulfate 270.32 - - Ammonium persulfate 228.18 日本製藥 96.5 Vitamin C 176.12 Riedel-deHaën 99.7 Trolox 250.29 Sigma 97

Uric acid sodium salt 190.09 Sigma -

Glutathione 307.32 Sigma ≧98

Glucose 180.16 Acros 99

L-Cysteine 121.16 Sigma 97

o-Benzenediol (catechol) 110.11 Mallinckrodt ≧90

p-Benzenediol (hydroquinone) 110.11 Riedel-deHaën 99.5

34

o-Phenylene diamine 108.14 Alfa Aesar 98

m-Phenylene diamine 108.14 Aldrich 99

p-Phenylene diamine 108.14 Sigma 98

使用的溶劑有 HPLC 級甲醇(購買於 Macron)，以及去離子水。 紫外線光譜儀為 Hitachi，U-3010，觀察 ABTS 在不同的參數下轉換

成 ABTS●+_{的生成情形。質譜儀為 Micromass Q-TOF，使用的游離源為電}

噴灑游離(ESI)，在正電模式與負電模式下操作。ESI 裝置使用的霧化氣體 (nebuliser Gas) 流速 10 liters/hr，而去溶劑氣體(desolvation Gas) 的流速 為 300 liters/hr。分析時質譜儀的最佳參數為 source block temperature: 100℃、desolvation temperature: 180℃、TOF: 7200 V、MCP: 2700 V、 capillary voltage: 2600 V、cone: 25 V、collision energy: 3 V、gas cell: 5 psi。 離子碰撞誘導解離(collision induced dissociation，CID) 的碰撞氣體為氬氣 (Ar)。進樣方式為本實驗室楊瑞崎所開發的自動進樣裝置(self-pumping pump)8，其系統的操作流速會因溶劑不同而有所差異，約為 10.0-15.0 μL/min。

3.2 生成 ABTS

●+

方法

探討 ABTS 與不同氧化劑進行反應，並且改變溫度、生成的濃度、 反應溫度、反應物比值與溶劑，以 UV-visible 光譜儀(簡稱 UV/vis)觀察 ABTS●+生成的情形以獲得最高的轉換率來得到最佳的合成條件。

3.2.1 AAPH 為氧化劑水熱法生成

參考 Floegel 等人3_{並做修改後，取 0.0128 g 的 ABTS 固體溶在 9 mL}

35 的 50%甲醇水溶液或 0.5%醋酸水溶液中，並與 1 mL 的 0.01 M 之 AAPH 水溶液均勻混合，使 ABTS 的起始濃度成 2.5×10-3 _{M，而 AAPH 的末濃} 度為 1 mM，並將溶液置於 68℃的水浴中反應，每 10 分鐘取出反應液， 以 HPLC-DAD 不接管柱狀況下直接進行分析，反應共 40 分鐘，實驗示 意圖如圖 3-1。

圖 3- 1 以 HPLC/DAD 檢視 AAPH 氧化 ABTS 實驗之流程: (A)反應瓶於 68℃水浴反應；(B)取原液 10 μL 稀釋成 1 mL；(C)分析

3.2.2 PDS 為氧化劑水熱法生成

參考 Henriquez 等人24_{的實驗方法做修改，使 ABTS 溶於純水，並探}

討 ABTS 起始濃度為 2.5×10-3 _{M 及 2.5×10}-4 _{M 之差異，同時調整氧化劑}

的濃度為 ABTS 的兩倍，以確保 ABTS 可完全轉換成 ABTS●+，接著使反

應液分別置於常溫與高溫進行合成工作，並以 UV/vis 探討於不同溫度下

36

圖 3- 2 以 UV/vis 檢視 PDS 氧化 ABTS 實驗之流程:(A)使 ABTS 於 50℃

水浴或常溫下與 PDS 反應；(B)取原液稀釋至 2.5×10-5 _{M；(C)以 UV/vis} 分析 取 ABTS 固體 0.0321 g 至 22.5 mL 的水中，放置於室溫或 50℃的水 浴預熱 3-5 分鐘，以移液管取 2.5 mL 的 5×10-2 _{M 之過硫酸鉀水溶液} (K2S2O8，或簡稱為 PDS)加入其中開始進行反應，使 ABTS 的起始濃度為 2.5×10-3 M，而 PDS 的濃度為 5×10-3 M，並以 UV/Vis 取不同時間點的反 應液進行分析，以探討於不同溫度下 ABTS●+生成的情形。。 配製 2.5×10-4 _{M 的 ABTS 水溶液時，則先準備 2.5×10}-3 _{M 的 ABTS}

stock solution(取 0.0321 g 的 ABTS 固體溶於 25 mL 的水中)，每次進行反 應時皆取其中 2.5 mL 至 20 mL 水中，放置於室溫或 50℃的水浴預熱 5 分 鐘，再以移液管取 2.5 mL 的 5×10-3 _{M 之 PDS 水溶液加入其中開始於不} 同環境下進行反應，使 ABTS 起始濃度為 2.5×10-4 _{M，PDS 的濃度為 5×} 10-4 M。實驗中也改變 PDS 的濃度為 5.7×10-4 M，與 2.5×10-4 M 的 ABTS 溶液在 50℃的水浴中反應生成自由基，以比較與原來條件之差異。將以 上不同條件下之反應液每 5-10 分鐘取點稀釋 10 倍後，以 UV 偵測 ABTS 與 ABTS●+_{分別在 340 nm 與 415 nm 的吸收度變化，並計算其轉換率。}

37

3.2.3 ADS 為氧化劑水熱法生成

以過硫酸銨((NH4)2S2O8，或簡稱為 ADS)取代 K2S2O8做為氧化劑使

ABTS 氧化成自由基陽離子，實驗時同樣先配製 2.5×10-3 M 的 ABTS stock

solution(取 0.0321 g 的 ABTS 固體溶於 25 mL 的水中)，每次進行反應時 皆由其中取 2.5 mL 至 20 mL 水中，放置於室溫或 50℃的水浴預熱 5 分 鐘，再以移液管取 2.5 mL 的 5×10-3 _{M 之 ADS 水溶液加入其中開始於不} 同環境下進行反應，使 ABTS 起始濃度為 2.5×10-4 _{M，ADS 的濃度為 5×} 10-4 M。 實驗也探討 ADS 濃度改變所帶來的影響，維持 ABTS 濃度為 2.5× 10-4 M，內含 5.7×10-4 M 的 ADS 溶液，並將溶液置於 50℃的水浴中進行 反應。 溶劑效應的實驗方法則是將 ABTS 分別溶於甲醇、醋酸緩衝溶液 (pH=4.53)、醋酸銨水溶液(pH 值=7.03)、氨水溶液(pH=9.63)，並配置成 2.5 ×10-4 _{M，內含 5×10}-4 _{M 的 ADS 水溶液，置於 50℃的水浴中進行反應。} 將以上不同合成條件之反應液每 5-10 分鐘取點稀釋 10 倍後，以 UV 偵測 ABTS 與 ABTS●+_{分別在 340 nm 與 415 nm 的吸收度變化，以了解} ABTS 於不同反應環境下生成 ABTS●+的反應時間與轉換率之差異。

3.2.4 ADS 為氧化劑 microwave 方式生成

配製 2.5×10-4 _{M 的 ABTS 水溶液 10 mL，內含 5×10}-4 _{M 的 ADS 水溶} 液，並將溶液放入微波爐(Sanyo EM-17P)加熱反應。選擇中微波(約 426 W)加熱 ABTS 水溶液，約 20 秒溶液顏色呈現深綠色後，立刻取出以冷 水冷卻，再將上述溶液以 UV 與質譜儀分析來了解方法之可行性。

38

3.3 樣品配製方法

3.3.1 抗氧化劑標準品配製

以 50%MeOH 水溶液為溶劑，配製 1.25×10-2 _{M 的維他命 C，並由此} 溶液稀釋成 6.25×10-3 _M、4.15×10-3 _{M、3.125×10}-3 _M、2.5×10-3 _{M 備用。} 其他抗氧化劑的標準品皆配成 6.25×10-3 _{M 備用。所使用溶劑中除了}

uric acid 以 0.8 M 氫氧化鈉水溶液為溶劑、Trolox 以 50%甲醇水溶液為 溶劑，其餘如 GSH、glucose、L-cysteine、苯二酚異構物(鄰、間、對位) 與苯二胺異構物(鄰、間、對位)皆以純水配製而成。

3.3.2 真實樣品配製

自家樂福採購紅酒三種，紫色甘藍菜與紫色洋蔥。 圖 3- 3 三種紅酒樣品 圖 3-3 的紅酒樣品由左至右的原產地與品名分別為原產地法國的羅 亞爾梭密黑狼莊園紅酒(Domaine De Nerleux)、優級波爾多豪攝雷勒紅酒 (Bordeaux)及原產地為西班牙柯羅那紅酒(Coronas)。三種紅酒皆以樣品瓶 分裝保存於室溫中，實驗時直接取樣品瓶中之溶液加入 ABTS●+水溶液進 行反應。

39 圖 3- 4 紫色高麗菜 圖 3-4 為原產地台灣的紫色高麗菜，實驗時取 5 g 的紫色葉片於果汁 機中(Ambi BL-2066)，加入 30 mL 水打成汁，以濾網過濾較大殘渣，再 使用抽氣過濾取出澄清液倒入 50 mL 定量瓶中，以 50%甲醇水溶液定量 至刻度線，裝入血清瓶中冷藏在冰塊中備用，樣品在上機前需使用孔徑 為 0.22 μm 的 filter 進行過濾才能使用。 圖 3- 5 紫色洋蔥 圖 3-5 為原產地台灣恆春的紫色洋蔥，實驗時將洋蔥切片，取 5 g 加 入果汁機中(Ambi BL-2066)，加入 30 mL 水至果汁機中打成汁，並以濾 網過濾較大殘渣，使用抽氣過濾取出澄清液倒入 50 mL 定量瓶中，以 50% 甲醇水溶液定量至刻度線，裝入血清瓶中冷藏在冰塊中備用，樣品在上 機前需使用孔徑為 0.22 μm 的 filter 進行過濾才能使用。