生物指示劑評估研究成果已發表於中華民國環境工程學會，第二十 一屆廢棄物處理技術研討會，本研究將研討會論文修訂後，作為本章之 研究結果，修訂重點如下：
z FDA 評估生物指示劑之準則
z Attest 1291 RRBI 未符合 FDA 之評估準則 z 偽陰性代表 RRBI 偵測極限之問題
z 調查 RRBI 使用現況結果中，未列入統計之醫院情況
4-1 摘要
本研究調查我國醫院使用快速判讀生物指示劑 (rapid readout biological indicator, RRBI ) 進行高溫高壓滅菌生物檢測的現況，探討 RRBI 一定的操作條件下，是否錯用型號。另以實驗探討 RRBI 快速判讀 法及顏色判讀法的一致性，以及錯用RRBI 對一致性的影響。本研究自行 設計問卷，委託財團法人環境資源研究發展基金會協助調查全台灣20 家 醫院，主要調查滅菌鍋型式 (gravity displacement, vacuum-assisted)、操作 溫度 (121 oC, 132 oC ) 及使用 RRBI 的型號 (Attest 1291, Attest 1292)。本 研究使用重力式滅菌鍋，操作溫度121 oC 進行試驗，滅菌時間為 3、5、
6、7 分鐘，除了 3 分鐘進行 3 重複試驗外，其餘滅菌時間各進行 4 重複 試驗，每次試驗放入Attest 1292 及 1291 各 10 支，滅菌後使用 Attest 290 自動培養判讀機 (Auto Reader) 進行快速判讀，之後再將 BI 移至 55 ~ 60
oC 的培養箱中，繼續培養 24 ~ 48 小時後進行顏色判讀。
調查結果顯示，受訪醫院的31 組高溫高壓滅菌鍋中，錯用 RRBI 比 例達16.1 %，其中又以真空式滅菌鍋，操作溫度 121 oC 時錯用比例最高，
占全部錯用60 %。在快速判讀法和顏色判讀法一致性方面，正確選用 RRBI 時，兩種判讀系統一致性達 75.3%，並呈現出快速判讀法較為保守 的結果；而在錯用RRBI 方面，兩種判讀系統一致性降至 40.7 %，並出 現59.3 % 的偽陰性，但就本研究的滅菌時間範圍，無法看到偽陰性的趨 勢。另外由於本研究調查對象及樣本數有限，因此對於錯用的真實嚴重 程度不得而知，因此建議針對此議題再進行大規模調查，並加強宣導正 確選用RRBI。
關鍵字：高溫高壓滅菌法、快速判讀生物指示劑、醫療廢棄物
4-2 前言
高溫高壓蒸氣滅菌法是目前最普遍使用的滅菌方法，為了確保滅菌 效能良好，必須定期檢測以確認滅菌鍋之效能 (Doornmalen et al.,
2005)，而滅菌鍋效能評估一般可分為 3 種：機械效能監測、化學測試法、
生物測試法，其中又以生物測試法被認定為評估滅菌效能最理想的方式 (Albert et al., 1998；Rutala et al., 1993；Rutala et al., 1996；Schneider et al., 2005；Vesley et al., 1995) 。
近年來滅菌鍋效能進行生物檢測時，大多使用生物指示劑 (biological indicators, BIs) 為主，有些滅菌措施指引建議，滅菌時 BI 與滅菌物品需 同時置入滅菌鍋以檢測效能，或滅菌鍋停機未使用一段時間後，至少每 週進行一次生物檢測以確保機組效能正常 (Association for the
Advancement of Medical Instrumentation, 1993；Association of Operating Room Nurses, 1994)。目前市場上有許多種型式 BI，其中以美國 3M 公司 之快速判讀生物指示劑 (rapid readout biological indicator, RRBI) 最被廣 泛應用，由於傳統型BI 在滅菌後需培養 24 ~ 48 小時，待孢子生長後，
觀察培養液顏色是否變化來判讀，滅菌物品需暫時隔離它處，無論滅菌 物品為可重複使用之醫療器械或感染性廢棄物，隔離擱置將會提高處理 成本 (Vesley et al., 1992) ；另外，如未落實隔離擱置，病患將會有感染 的風險或造成環境二次污染 (Alfa et al., 2002；Rutala et al., 1993)。而 RRBI 僅需 1 ~ 3 小時等待判讀時間，將可改善傳統 BI 培養時間過長的缺 失，在市場上受到廣泛的使用。
RRBI 除了可快速判讀外，其本身仍保有傳統顏色判讀的功能，因此 有研究比較快速判讀及顏色判讀的一致性，而這些研究證實，快速判讀 和顏色判讀相當一致，但較為保守 (Albert et al., 1998；Rutala et al., 1993；Rutala et al., 1996；Schneider et al., 2005；Vesley et al., 1992；Vesley et al., 1995)。
然而不同型號RRBI 有不同的操作條件，例如 3M 公司的 RRBI 分為 兩種型號 (Attest 1291and Attest 1292)，不同型號 BI 可檢測的滅菌鍋型式 (gravity displacement and vacuum-assisted) 及操作溫度 (121 oC and 132 oC) 不同，若實際操作人員對RRBI 使用條件未完整了解，即可能錯用。本研 究欲調查我國醫院使用RRBI 檢測高壓蒸氣滅菌時，是否錯用，再依據問 卷調查結果及進行實驗驗證，探討正確使用與錯用時對於快速判讀及顏 色判讀一致性的影響。
4-3 研究方法 4-3-1 問卷調查
本研究自行設計「我國醫院高溫高壓滅菌鍋使用及效能試驗現況調 查」問卷，並委託財團法人環境資源研究發展基金會於執行衛生署「95-96 年度醫療機構廢棄物減廢與資源回收輔導計畫」時，代為轉交至各醫院 滅菌鍋使用單位填寫，一共調查全台灣20 家醫院，主要調查全台醫院目
前使用的滅菌鍋型式 (gravity displacement, vacuum-assisted)、操作溫度 (121 oC, 132 oC) 及生物檢測使用的 RRBI 型號 (Attest 1291 及 Attest 1292)，以了解是否有錯用 BI 的情形。
4-3-2 生物指示劑
RRBI 使用之指標菌為 Bacillus Stearothermophilus (B.S)，菌種編號為 American Tissue and Culture Collection 7953，RRBI 具有包含至少 105 B.S 孢子的長條紙片 (spore strip)，培養液為改良的 tryptic soy broth (TSB) 裝 於玻璃安瓿 (ampule) 中，將 TSB 安瓿與 spore strip 一同置入塑膠管柱 中，滅菌後將玻璃壓碎，使培養液流出與孢子接觸開始培養。TSB 中添 加4-methylumbelliferyl-alpha-D -glucoside，該物質與孢子上
alpha-D-glucosidase 酵素結合反應後即會產生螢光物質，使用 Attest 290 自動培養判讀機 (Auto Reader) ，可在 1 至 3 小時內偵測螢光反應，由於 該酵素比孢子更加抗熱，因此偵測殘留酵素即可判定滅菌是否完全；另 外RRBI 仍具有傳統 BI 的顏色判讀，其原理為 TSB 中添加紫色溴甲酚 pH 指示劑，滅菌後若仍有孢子存活時，經 24 ~ 48 小時的培養，孢子生 長過程產生的酸性代謝物會使溴甲酚轉變成黃色，用肉眼即可觀察。而 3M RRBI 分成 1291 及 1292 兩種型號，不同型號可適用檢測的滅菌鍋形 式 (gravity displacement and vacuum-assisted)、操作溫度 (121 oC and 132
oC) 及培養判讀時間皆不相同，兩者比較如 table 4-1 所示。
Attest 290 Auto Reader 同時具有培養及偵測螢光反應的功能，在判讀 的過程中，290 Auto Reader 維持理想的溫度 (55 ~ 60oC)，以及定時偵測 螢光反應。本研究每次使用一支未經滅菌BI 作為陽性控制組 (positive control)，以確保 Auto Reader 判讀功能正常。
Table 4-1. Autoclaving temperatures and incubation times required for different types of rapid readout biological indicator (RRBI).
Incubation Time Autoclaving
Temperature Fluorescent Growth Attest RRBI 1291 1 hr 24 hrs
Gravity-displacement 132 oC Vacuum-assisted None
Attest RRBI 1292 3 hrs 48 hrs Gravity-displacement 121 oC
Vacuum-assisted 132 oC
4-3-3 高溫高壓滅菌鍋
本研究使用的高溫高壓滅菌鍋為中國醫藥大學學士後中醫學系所提 供，機體設置於中國醫藥大學臨床技能試驗實驗室，廠牌型號為Barnstead International ST 75925，屬於重力式 (gravity displacement) 高壓滅菌鍋，
溫度範圍為100 ~ 136 oC，本研究設定為 121 oC，壓力 16~17 psi，每日試 驗前進行空機滅菌5 分鐘，預熱機體及確保機體內無菌，預熱後滅菌鍋 升溫至121 oC 的平均進氣時間 (come-up time) 為 790 秒，滅菌後壓力降 至0 psi 的平均排氣 (come-down time) 時間為 114 秒。
4-3-4 試驗方式
本研究參考文獻進行實驗設計 (Rutala et al., 1993；Rutala et al., 1996；Schneider et al., 2005；Vesley et al., 1992；Vesley et al., 1995；Alfa et al., 2002)，根據製造商規定，Attest 1292 及 1291 僅可用來檢測重力式滅 菌鍋，操作溫度分別為121 oC 及 132 oC 時，本研究操作溫度為 121 oC，
因此以Attest 1291 作為模擬選用錯誤的情況，而 Attest 1292 為正確選用 的對照組。
依據美國食品與藥物管理局 (Food and Drug Administration, FDA) 評估RRBI 之準則，試驗時必須使用部分滅菌 (marginal sterilization)、完 全滅菌 (all kill) 及無效滅菌 (all survival) 的操作時間，其中部分滅菌意
指有30~80% BI 呈現 growth positive，且要達到部份滅菌之操作條件，僅 能改變「滅菌時間」來獲得(CDRH, 2001)。因此本研究選用 6 個不同滅 菌時間及1292 BI 進行前測試 (pretest)，前測試滅菌時間分別為 3、5、7、
9、10 及 15 分鐘 (不包含進氣與排氣時間)，結果顯示 3 分鐘為無效滅菌 時間，7 分鐘為完全滅菌時間，介於兩者之間為部份滅菌時間，最後選用 3、5、6 及 7 分鐘等 4 個操作時間進行正式試驗。
試驗時將BI 放置於具有特殊篩孔的金屬架上，為了使每支 BI 受到 一致的高溫蒸氣暴露，BI 間須保持平行不可重疊，並且擺放的間距要相 等，其後將此金屬架放在滅菌鍋的金屬盤上，再將金屬盤放入滅菌鍋置 物架的最底部。每次試驗各置入10 支 1291 及 1292 BI，除了操作時間 3 分鐘時只進行3 重複試驗之外，其餘操作時間均進行 4 重複試驗。滅菌 完成後取出BI 放入 Attest 290 Auto Reader 進行快速判讀，之後再將 BI 移至55 ~ 60 oC 的潮濕培養箱中繼續培養，根據製造商規定，Attest 1291 需要培養24 小時才可進行顏色判讀，而 Attest 1292 則需 48 小時。
4-4 結果
研究初始調查全台20 家醫院，最後獲得 9 家醫院共 31 組高溫高壓 滅菌鍋樣本，其中北區3 間、中區 2 間及南區 4 間，表示受訪醫院地域 分佈平均，其餘11 間醫院未回覆問卷，所有調查的結果如 table 4-2 所示，
現階段台灣部分醫院產生錯用RRBI 的比率達 16.1 %，且在真空式滅菌 鍋操作溫度121 oC 時錯用率最高，占全部錯用的 60 %，另外使用真空式 滅菌鍋操作溫度132 oC 的比率為 77.4 %，可見使用真空式滅菌鍋及較高 溫的操作參數為目前的趨勢。
所有RRBI 驗證結果如 figure 4-1 所示，當滅菌時間為 3 分鐘時，在所 有正確選用的1292 RRBI 中，無論是快速判讀或顏色判讀法皆呈現陽性反
應，表示3 分鐘為此機組滅菌失敗 (all survival) 的時間，並且在所有錯誤 選用的1291 RRBI 中也呈現相同的結果；滅菌時間為 5 分鐘時，有 73 % 的 1292 BI 快速判讀呈現陽性，而顏色判讀卻全部呈現陰性，顯示 BI 中無孢 子存活而快速判讀呈現陽性，偽陽性 (false-positive) 高達 73% (附錄五)。
Table 4-2. National survey results of autoclave type, operating temperature, and RRBI type.
Using Correct RRBI Using Incorrect RRBI Overall Gravity displacement
121oC 3 0 3
Cycle time (mins)
1292 Fluorescent 3hrs 1292 Spore Growth 48 hrs 1291 Fluorescent 1hr 1291 Spore Growth 24 hrs
Figure 4-1. Comparison of positive results obtained with rapid fluorescent readout and spore growth each for RRBI 1292 (at
correct temperature of 121 oC) and 1291 (at incorrect temperature of 121 oC).
在1291 BI 中，僅有 28 % 的快速判讀呈現陽性，卻有 100 %的顏色判
Table 4-3. Conformance statistics of test results obtained with rapid fluorescent readout and spore growth for different exposure time both by gravity displacement.
Biological Indicator Fluorescence1/Spore Growth2 Result Summary
Cycle Time3 ＋/＋ ＋/－ －/＋ －/－
Overall 30/150(20%) 37/150(24.7%) 0/150(0%) 83/150(55.3%) 1291 RRBI
3 min 30/30 0/30 0/30 0/30
5 min 11/40 0/40 29/40 0/40
6 min 0/40 0/40 35/40 5/40 7 min 0/40 0/40 25/40 15/40
Overall 41/150(27.3%) 0/150(0%) 89/150(59.3%) 20/150(13.3%) 1. Rapid Readout time of 3 hours for RRBI 1292 and 1 hours for RRBI 1291.
2. Growth time of 48 hours for RRBI 1292 and 24 hours for RRBI 1291.
3. Exposure time after the reaching preset temperature.
Table 4-3 為比較快速判讀與顏色判讀的一致性。當正確選用 1292 RRBI 時，將不同滅菌時間的 BI 全部加總，快速判讀與顏色判讀法判讀 結果一致 (+/+, -/-) 的比率為 75.3 %，偽陽性 (+/-) 的比率為 24.7 %，並 無偽陰性 (-/+) ；當錯誤選用 1291 RRBI 時，快速判讀法與顏色判讀法
判讀結果一致 (+/+, -/-) 的比率為 40.7 %，偽陽性比率為 0 %，偽陰性的 比率卻高達59.3 %。
4-5 結論與建議
文獻中 (Rutala et al., 1996；Vesley et al., 1995) 以 121 oC 重力式壓力 鍋驗證RRBI 時，滅菌失敗與滅菌完全的時間介於 5 ~ 15 分鐘，而本研究
文獻中 (Rutala et al., 1996；Vesley et al., 1995) 以 121 oC 重力式壓力 鍋驗證RRBI 時，滅菌失敗與滅菌完全的時間介於 5 ~ 15 分鐘，而本研究