本研究滅菌處理效能評估試驗完成後，將成果整理撰寫為期刊格 式，直接納入本論文五章。
5-1 摘要
本研究使用四種判讀方式 (螢光、顏色、化學及菌落計數)，評比不 同操作條件之滅菌效能 (performance evaluation)，並實證包封程度對滅菌 效能的影響，期能提供政府修訂滅菌處理操作規範及效能查核準則之參 考。
本研究使用121G (重力模式、121oC、60 分鐘) 及 135V (真空模式、
135oC、45 分鐘) 兩種操作條件，分別進行 4 重複試驗。試驗時將團狀報 紙及空針筒填充於滅菌用塑膠袋中，封緊袋口置入高溫高壓滅菌鍋，於 袋內 (IB)、針筒內 (IBN) 及袋外 (OB) 各放置 2 支 1292 快速判讀生物 指示劑 (RRBI) 及 3 支 1243 化學指示劑 (CI) 後進行滅菌，試驗後 CI 以肉眼判讀，1 支 BI 進行快速及顏色判讀，另 1 支 BI 以 HPC 計數殘餘 菌落數再計算log kill。
在121G 試驗中，OB、IB 及 IBN 快速判讀陽性比例分別為 0%、75%、
75%，顏色判讀及 CI 結果亦同。OB 的 log kill 平均值達 5.0，而 IB 及 IBN 的平均值則降至1.7 以下；在 135V 方面，OB、IB 及 IBN 所有判讀方式 的陽性比例皆為0%，且 OB 的 log kill 皆>5，IB 及 IBN 的平均 log kill 皆為5.2。
本研究RRBI 快速、顏色及 CI 判讀的結果一致性達 100%，且 RRBI 判讀與HPC 試驗結果趨勢相近，但 RRBI 陰性判讀時並非無菌，證實有 其偵測極限，因此BI 陰性判讀可能未必符合現行法規標準之 log kill 須達 5.0 之規定。本研究證實 121G 的滅菌效能易受包封程度所影響，而 135V
較能克服包封的蒸氣阻絕，因此建議修訂滅菌操作規範，規定廢棄物的 包封材質，或於滅菌時將廢棄物同時破碎，以克服包封對蒸氣阻絕的影 響，或操作於真空模式135 oC，以確保完善之滅菌。
關鍵字：醫療廢棄物、高溫高壓滅菌法、快速判讀生物指示劑、菌落數 檢測
5-2 前言
目前我國感染性醫療廢棄物大多採用專用焚化爐焚化處理，但由於 廢棄物中含氯量高達2.7% (Li et al., 1993)，且專用焚化爐操作不穩定易 產生不完全燃燒，使得醫療專用焚化爐戴奧辛排放係數高達4400 ng/kg，
為一般混燒焚化爐的40~60 倍 (Wang et al., 2003；江，2004)。另外感染 性廢棄物必須以冷凍清運，使得該處理方式成本居高不下 (30~50 NT/kg)。目前國際趨勢已朝向將感性廢棄物現地滅菌解碼 (onsite
decoding) 後，再併入大型焚化爐焚化或掩埋等方式處理 (江，2004)，不 僅可有效降低戴奧辛的排放量，更可降低處理成本及運輸過程二次污染 的風險。我國環保署於民國90 年修訂頒布「有害事業廢棄物認定標準」，
將第四、六、七目之感染性廢棄物，及符合「事業廢棄物貯存方法及設 施標準」以黃色容器貯存之感染性廢棄物，經滅菌處理後可改認定為一 般事業廢棄物，但實施以來僅有3%的感染性廢棄物採用此處理方式，可 能原因為國內高溫高壓滅菌處理設備及操作規範不健全，以及缺乏滅菌 處理效能的查核準則等。
目前我國關於滅菌處理之操作及效能規定，僅有衛生署於民國90 年 頒布的「部分感染性醫療廢棄物滅菌處理標準及相關規定」可供遵循，
其中滅菌溫度、時間、蒸氣壓及機體填充率已有明文規定，但滅菌操作
模式 (vacuum & gravity)、廢棄物包封程度及滅菌後達不可辨識性等皆未 考量；在滅菌效能評估規定方面，僅規定使用嗜熱桿菌芽孢 (Bacillus Stearothermophilus, B.S) 作為測試，消減率須達 5 log10以上，然而廢棄物 滅菌處理的單位，技術上難以落實此種效能評估，目前實務上大多採用 生物指示劑 (biological indicator, BI) 評估滅菌效能，但 BI 是否能符合法 規要求，必須進一步研究之。
因此我國如欲推動感染性廢棄物高溫高壓滅菌解碼處理，必須檢討 目前的滅菌操作規定，建立更健全可行的法規。本研究參考現行法規之 操作條件進行試驗，比對不同滅菌模式、溫度及時間的滅菌效能，並模 擬廢棄物滅菌處理的實務操作，進行包封度對滅菌效能影響的實測研 究。目前國內並無訂有高溫高壓滅菌效能的查核準則，本研究使用四種 判讀方式進行測定，包括BI 的快速判讀、顏色判讀、化學指示劑及菌落 計數等，並評比各種判讀結果探討其一致性，以提供政府訂定查核準則 之參考。
5-3 研究方法
5-3-1 生物及化學指示劑
目前國際上進行日常滅菌查核時，考量其方便性，大多以BI 評估高 溫高壓滅菌鍋之滅菌成效 (AAMI, 1993；AORN, 1994)，本研究使用 3M Attest 1292 Rapid Readout Biological Indicator (RRBI)，產品批號 2008-07 DX，內含 3.1×106 CFU B.S 之長條紙片 (spore strip)，及包裝於玻璃安瓿 (ampule) 中的 tryptic soy broth (TSB) 培養液。滅菌後將 BI 取出冷卻約 10 分鐘，壓碎 TSB ampule 使培養液潤濕 spore strip，置入 3M 290 Auto Reader 培養判讀槽開始培養，經 1 ~ 3 小時可得知判讀結果，RRBI 快速 判讀原理已有若干研究探討 (Albert et al., 1998；Alfa et al., 2002；Rutala et
al., 1993；Rutala et al., 1996；Schneider et al., 2005；Vesley et al., 1992；
Vesley et al., 1995)。快速判讀後將 BI 移至潮濕的培養箱中繼續培養，如 BI 仍有孢子存活，生長過程產生的酸性代謝物會改變 TSB 的酸鹼值，使 得TSB 中紫色 pH 指示劑轉變成黃色，48 小時內可用肉眼觀察判讀。因 此Attest 1292 具有快速判讀 (rapid readout) 及培養生長判讀 (spore growth) 兩種方式，本研究均加以採用。
本研究另外使用3M 1243 Steam Chemical Indicator (CI) 進行試驗，為 符合Association for the Advancement of Medical Instrumentation (AAMI) Class 5的多參數指示劑。CI內含蒸氣及溫度感應化學藥碇 (chemical tablet)，以及化學物滲透紙蕊條 (paper strip for chemical wicking)，包覆在 鋁箔薄片及具蒸氣調節穿透之表層紙片 (steam rate controlling paper) 中，鋁箔封底阻礙蒸氣中的水氣穿透，而表層紙片則控制蒸氣的穿透率 (3M Health Care, 2006)。化學藥片在乾燥時熔點為139 oC，遇蒸氣則熔點 降低，熔融後為黑色液態物，當高溫蒸氣維持一段時間後，黑色液態物 則滲透紙蕊條至Accept區域，可視為陰性判讀，反之則視為陽性。CI可查 核滅菌是否符合各操作條件，包括溫度、時間及飽和蒸氣等因子，以查 核機組設備是否正常操作，依前人研究建議 (Rutala et al., 1993；Schneider et al., 2005)，本研究將同時使用RRBI與CI評估滅菌效能，並比對兩者判 讀之差異。
5-3-2 異營菌培養計數方法
依據我國法規規定，高溫高壓滅菌效能 (log kill = log C0/C1，其中 C0為BI 內原始孢子菌落數；C1為滅菌後 BI 殘餘孢子菌落數) 以 B.S 進 行測試，log kill 須達 5 或以上。本研究參考 3M 公司 Spore Strip Total Count 1292 (3M Health Care, 2005) 的方法，取出 BI spore strip 殘餘的 B.S 孢
子，並依照美國Standard Method 9215 Heterotrophic Plate Count (HPC) (APHA, 1998) 之 Pour Plate Method，培養及計數孢子菌落數。本研究遵 守各項品管基準，使用tryptic soy agar (TSA) 為培養基，在 56±2 oC 下培 養48±2 小時後計數菌落數，再依照 BI 原始菌落數計算 log kill 值，量化 為滅菌效能數值，比對法規限值及指示劑的判讀結果。
5-3-3 高溫高壓滅菌鍋
本研究使用中國醫藥大學附設醫院之高溫高壓滅菌鍋進行試驗，機 體設置於第一醫療大樓手術室，廠牌型號為Getinge Castle 133，可操作 重力 (gravity displacement) 及真空 (vacuum-assisted) 兩種滅菌模式，最 高可操作溫度為141 oC，機體容積為 110 L。本研究參照法規規定及 1292
70%後，於袋內中央處放置一個無菌針筒，再將兩種指示劑 (BI 及 CI) 分 別置入塑膠袋及針筒內，封緊袋口後置入滅菌鍋內中央處，另在塑膠袋 外部放置兩種指示劑作為對照組。本研究共使用3 種不同包封方式進行 試驗，以評估包封阻絕對滅菌效能的影響，3 種包封條件之指示劑分別標 示為OB (out bag)、IB (in bag)、及 IBN (in bag and needle)。
本研究兩種滅菌操作條件皆進行4 重複試驗，試驗時各包封條件內 皆放置2 支 BI 與 3 支 CI，其中 1 支 BI 使用快速及顏色判讀法進行判讀，
另一支BI 則使用 HPC 求得殘餘菌落數 (CFU)，再依據原始菌落數換算 為log kill 值。
5-3-5 統計方法
本研究將BI 之快速判讀、顏色判讀及 CI 判讀結果進行敘述性統計，
但著重於指示劑的陽性判讀比率；在HPC 數據方面，將兩種滅菌操作條 件之OB 視為對照組，使用無母數統計之 Wilcoxon Rank-Sum Test，分別 與IB 及 IBN 的 log kill 值 (n=4) 進行顯著性差異檢定。
5-4 結果
滅菌操作條件為121G 時，OB 的 BI 快速及顏色判讀陽性比例皆為 0% (n = 4)，CI 的陽性判讀比例也為 0% (n = 12)，顯示在 121G 的操作條 件下，該機體滅菌功能正常；在IB 的包封情況下，BI 快速及顏色判讀的 陽性比例為75% (n = 4)，CI 的比例亦同 (n = 12)；而在 IBN 的包封情況 下，所有判讀結果與IB 相同，其試驗結果如 table 5-2 所示。此外，本試 驗BI 快速判讀、顏色判讀及 CI 判讀的結果完全一致。
滅菌操作條件為135V 時，所有試驗結果如 Table 5-3 所示，OB 的 BI 快速及顏色判讀陽性比例皆為 0% (n = 4)，CI 的比例為 0% (n = 12)，
顯示在此操作條件下，該機體滅菌功能正常；在IB 與 IBN 的包封情況下，
BI 快速及顏色判讀陽性比例皆為 0% (n = 8)，CI 的比例亦同 (n = 24)；顯 示在所有的包封情況下，滅菌效能呈現良好。
Table 5-2. Indicator results of performance test for gravity displacement steam sterilization at 121 oC for 60 minutes
Incubation Positive/Total Tested
Indicator type Time (hr) Out bag In bag In bag and needle 1243 Comply CI
Color Change None 0/12 (0%) 9/12 (75%) 9/12 (75%)
Table 5-3. Indicator results of performance test for vacuum-assisted steam sterilization at 132 oC for 45 minutes
Incubation Number Positive Indicators/Total Tested Indicator type Time (hr) Out bag In bag In bag and needle
均達5.0 (n = 3)。由於兩種操作條件多數 OB (n = 6) 結果已符合法規標準
2. Wilcoxon Rank-Sum test 3. Outlier 不列入統計分析
5-5 討論與建議
在所有試驗條件下，RRBI 兩種判讀方式一致性達 100%，高於 Alfa 研究的85%，未產生如文獻所述快速判讀法較為敏銳或保守的情形
(Alfa et al., 2002；Rutala et al., 1993；Rutala et al., 1996；Schneider et al., 2005；Vesley et al., 1992；Vesley et al., 1995)，可能原因為本研究滅菌 時間較長，未產生邊際滅菌的情況 (marginal or partial sterilization)，使 得快速判讀法不致產生低估滅菌成效的偽陽性，此結果與過去研究相同 (江等，2006)。本研究所有 CI 判讀結果與 BI 完全相符，加上 CI 價格 便宜，以及滅菌後可立即判讀等優點，因此亦建議評估高溫高壓滅菌處 理效能時，將CI 搭配 BI 合併使用 (Schneider et al., 2005)。
目前國內大多採用BI 做為查核高溫高壓滅菌處理效能的依據，而 本研究使用HPC 量化滅菌效能，以利研判滅菌效能是否可符合法規。
過去也有相關研究 (Alfa et al., 2002) 將顏色判讀後的 BI 培養液取出培 養，然而培養液取出前已經過長時間的繁殖，無法得知滅菌後的殘餘菌 落數，僅可判定是否有孢子存活，且該研究僅將產生偽陰性的BI 進行 植菌，本研究則全面測定滅菌後BI 的菌落數，再與指示劑的判讀結果
過去也有相關研究 (Alfa et al., 2002) 將顏色判讀後的 BI 培養液取出培 養，然而培養液取出前已經過長時間的繁殖，無法得知滅菌後的殘餘菌 落數，僅可判定是否有孢子存活，且該研究僅將產生偽陰性的BI 進行 植菌，本研究則全面測定滅菌後BI 的菌落數，再與指示劑的判讀結果