本研究主要評估生物指示劑判讀系統，以及實證高溫高壓滅菌成效，
以作為操作規範及效能查核準則之參考。本研究之方法分以下6 節說明，
包括各種指示劑使用方式、滅菌鍋之操作、菌落數檢測方法、生物指示 劑評估、滅菌效能評估及數據統計分析。
3-1 各種指示劑使用方式 3-1-1 生物指示劑
本研究使用3M Attest RRBI 進行生物指示劑判讀系統及滅菌效能評 估之研究，以下將分別說明RRBI 的構造、適用條件、使用方式及自動培 養判讀機。
I. 構造
RRBI 構造如 figure 3-1 所示，以下依各部位分別說明 (3M Health Care, 2005)：
Figure 3-1. RRBI 結構分解圖
1. Cap：BI 之試管蓋，上緣有 6 個孔隙可供蒸氣通入內部，依不同 型號分為2 種顏色，Attest 1291 及 1292 藍色蓋及褐色蓋區別。
7 6 5 4 3 2
1
2. Filter：覆蓋於試管蓋及試管間，其材質可讓水蒸氣穿透，並阻絕 外來細菌進入試管內而造成污染。
3. Growth Media：主要為 tryptic soy broth，另添加
4-methylumbelliferyl-alpha-D-glucoside (4-MUG) 及紫色溴甲酚 (bromocresol purple) pH 指試劑，未使用前保存於玻璃安瓿 (ampule) 中與孢子隔離，待滅菌後壓碎玻璃使其流出，潤濕孢子 進行培養判讀。
4. Macroporous Material：具孔隙之吸水織物，可將螢光物質濃縮聚 集於試管底部協助判讀。
5. Spore strip：乾式孢子紙條 (dry spore strip)，其中包含至少 1 × 105 colony forming unit (CFU) 的 B.S 孢子 (American Tissue and Culture Collection 編號 7953)。
6. Label：可填寫試驗日期、批次及相關資訊的標籤，其上含有製 造日期、菌種名稱、產品型號及玫瑰色之化學指示條 (暴露高溫 蒸氣則轉變成褐色)。
7. Vial：軟式聚丙烯塑膠試管，裝載孢子紙條 (spore strip)、吸水織 物 (macroporous material) 及培養液的玻璃安瓿 (ampule of media)。
II. 適用條件
3M Attest RRBI 不同型號適用於不同的滅菌模式及溫度，判讀時間亦 不同，依據3M BI product profile，RRBI 可分為 Attest 1291 及 1292 兩種 型號，table 3-1 為兩種 BI 適用的滅菌鍋操作模式、溫度及判讀時限 (3M Health Care, 2004 a；3M Health Care, 2004 b；3M Health Care, 2005)。Attest 1291 快速及顏色判讀時間較 Attest 1292 短，但僅適用於 132 oC 重力式滅
菌模式，而Attest 1292 可適用 121 oC 重力式及 132 oC 真空式滅菌模式，
可見Attest 1292 適用層面較廣實用性較高，但應特別注意判讀前所須培 養時間。目前3M 未有適用 121 oC 真空式滅菌模式之 BI，因此建議於該 操作條件時，選用其他效能評估方法 (附錄二、三)。
Table 3-1. 不同型號 RRBI 適用之操作條件及培養判讀時間 Incubation time
Fluorescent Growth
Opperating temperature Attest RRBI 1291 1 hr 24 hrs
Gravity-displacement 132 oC
Vacuum-assisted None
Attest RRBI 1292 3 hrs 48 hrs
Gravity-displacement 121 oC
Vacuum-assisted 132 oC
III. 使用方法
RRBI 使用方法如下：
1. 依滅菌操作條件選用正確 RRBI 型號，參考 table 3-1 2. 於 label 上註明試驗相關資料，如日期、編號等 3. 置入滅菌鍋進行滅菌
4. 滅菌後取出立即壓下試管蓋使其密閉
5. 待約 5~10 分鐘使 BI 冷卻
6. 置入 290 Auto Reader 破碎槽壓碎玻璃安瓿
7. 輕敲 BI 底部使培養液潤濕 spore strip
8. 置入 290 Auto Reader 等待一段時間後進行快速判讀
9. 快速判讀後移至潮濕培養箱，繼續培養 24~48 小時後進行顏色判讀
IV. 自動培養判讀機
3M Attest 290 自讀式快速判讀培養機 (290 Auto Reader) 可偵測 RRBI 的螢光反應，並提供 BI 培養的溫度條件 (60±2 oC)。290 Auto Reader 具有 1 個壓碎槽 (crusher) 及 12 個培養槽，crusher 提供安全便利 的方式壓碎玻璃安瓿 (ampule)，以保護操作人員；藍色及褐色培養槽分 別用來判讀Attest 1291 及 1292 RRBI。使用 290 Auto Reader 前先暖機 30 分鐘，使培養槽升溫至適當溫度後再進行判讀 (3M Health Care, 2003)。
290 Auto Reader 具有紅、黃、綠 3 種指示燈，黃燈表示正在進行培 養判讀程序，不可移動或碰觸BI；紅燈亮起(+)表示偵測到螢光反應，判 讀為陽性表示滅菌失敗，如機體已開啟響鈴功能，則會響起警示鈴聲；
快速判讀時限內未偵測到螢光反應，則綠色指示燈(-)亮起，表示滅菌成 功，290 Auto Reader 外觀及燈號如 figure 3-2 所示。
Figure 3-2. 290 Auto Reader 培養判讀槽及指示燈
3-1-2 整合性化學指示劑
參考文獻建議監測措施 (AAM, 1993；張等，2004)，滅菌過程可用 化學指示劑監測各種操作參數，因此本研究採用3M 1243 Steam Chemical Integrator 監測滅菌操作參數，其構造與使用說明如下：
I. 構造
3M 1243 Chemical Integrator 為整合性包內化學指示劑，構造如 figure 3-3 所示 (3M Health Care, 2006)，內部包含蒸氣溫度感應化學藥片
(chemical tablet) 及化學物滲透紙蕊條 (paper strip for chemical
wicking)，而外部以鋁箔薄片(AL-foil bottom cover) 及蒸氣穿透調節紙片 (Steam rate controlling paper) 加以包覆，鋁箔薄片可阻礙蒸氣穿透，而表 層紙片則控制蒸氣的穿透率。
II. 適用條件及用法
依據AAMI ST-60 的化學指示劑分級，3M 1243 Chemical Indicator (CI) 屬於第5 級多種參數測定指示劑，屬於整合性 (integrator) 化學指示劑，
可查核滅菌過程是否符合各種操作條件，如溫度、時間及飽和蒸氣等因 子，可快速檢測滅菌過程是否異常。
Chemical tablet 在乾燥環境下熔點為 139 oC，接觸水蒸氣則熔點降 低，適用於118~138 oC 的高溫蒸氣滅菌程序，不適用於乾熱式、環氧乙 烷或其他低溫的滅菌方式。Chemical tablet 接觸高溫蒸氣熔融為黑色液態 物，透過紙蕊條向前方滲透，當高溫蒸氣維持足夠的時間，黑色物質滲 透至Accept 區域，即可視為陰性反應，可透過 display window 觀察，如 figure 3-3 所示。使用時將 1243 CI 置入機體內各角落或滅菌布包內，滅 菌後取出可立即判讀。
3-2 高溫高壓滅菌鍋操作程序
本研究進行RRBI 操作溫度比較性評估，以及廢棄物高溫高壓滅菌效 能實證研究等兩大主題，其採用的高溫高壓滅菌鍋機組大小、操作模式 及使用方式皆不相同，本章節將分別說明兩機組的規格及操作方式。
3-2-1 生物指示劑評估試驗之機組
RRBI 評估試驗使用的高溫高壓滅菌鍋，由中國醫藥大學學士後中醫 學系所提供，機體設置於中國醫藥大學臨床技能試驗實驗室，機體外觀 及操作面板如figure 3-4 及 3-5，機體規格如 table 3-2 所示。
本研究使用溫度121 oC，壓力 16~17 psi 進行試驗，每日試驗前預先 空機滅菌5 分鐘，以預熱機體確保機體內無菌，預熱後升溫至 121 oC 的 平均進氣升溫時間 (come-up time) 為 790 秒，滅菌後壓力降至 0 psi 的平 均排氣降溫時間 (come-down time)為 114 秒，而操作程序如下：
Figure 3-3. 3M 1243 CI 之結構圖 (3M Health Care, 2006)
1. 打開電源
2. 在水箱中加入 5~7 L 去離子水
3. 放入滅菌物品關上槽門，並加以鎖扣 4. 設定滅菌條件(溫度、時間、乾燥時間) 5. 按下 start cycle 開始滅菌
6. 滅菌完成機體發出 5 聲警示響鈴
7. 將槽門微開按下 start cycle，開始乾燥程序 8. 打開槽門取出滅菌物品
9. 關閉電源
Table 3-2. RRBI 評估試驗滅菌鍋機體規格
項目 規格
廠牌 Barnstead International
型號 ST 75925
溫度範圍 100~136 oC
內鍋容積 34 L
外觀大小 57W × 62D × 43H cm
重量 38.5 kg
滅菌模式 重力式
蒸氣來源 內鍋直接加熱水體產生
Figure 3-4.
RRBI 評估試驗滅菌鍋外觀
Figure 3-5. RRBI 評估 試驗滅菌鍋操作面板
3-2-2 滅菌效能實證試驗之機組
滅菌效能實證研究使用中國醫藥大學附設醫院之高溫高壓滅菌鍋，
機體設置於第一醫療大樓手術室，機體外觀與操作面板如figure 3-6 與 3-7 所示，相關規格如table 3-3：
Table 3-3. 滅菌效能實證試驗之滅菌鍋機體規格
項目 規格
廠牌 Getinge-Castle
型號 MC 3533
最高操作溫度 141 oC
內胴容積 110 L
夾套體積 27.6 L 內胴最高壓力 2.8 kg/cm2 夾套最高壓力 2.8 kg/cm2
滅菌模式 重力式及真空式
蒸氣來源 外部儲存蒸氣導入
Figure 3-6.
效能試驗之滅菌鍋外觀
Figure 3-7.
效能試驗滅菌鍋操作面板
本研究參照法規及1292 RRBI 之適用條件，選定兩種操作條件進行 試驗，分別為重力式121 oC，滅菌 60 分鐘 (121G) 及真空式 135 oC、滅 菌45 分鐘 (135V)。重力式滅菌係將蒸氣直接導入機體內部，利用蒸氣 壓力，逐步將鍋內冷空氣壓縮至下方排氣口排除；真空模式則預先將機 體內部冷空氣抽除，再導入飽和蒸氣，較不易產生冷空氣排岀不全的問 題。本研究機組之121G 與 135V 的平均暖機時間 (come-up time) 分別為 1.7 及 14 分鐘，而滅菌後壓力降至 0 psig 的平均排氣時間 (come-down time) 分別為22 及 2.5 分鐘。其操作程序如下：
1. 打開總電源及蒸器閥並將機體開機 2. 待面板指示燈顯示 ready 按 open door 3. 打開鍋門置入滅菌物品
4. 關閉鍋門按下 seal door 5. 設定滅菌模式(真空或重力) 6. 設定滅菌溫度、時間及乾燥時間 7. 按下 start 開始滅菌
8. 滅菌後打開鍋門將滅菌物品取出 9. 關閉電源及蒸器閥
3-3 菌落數檢測方法
依據衛生署「部分感染性廢棄物滅菌處理標準及相關規定」，感染性 廢棄物以滅菌法處理者，以B.S 做為效能測試指標菌種，其削減率須達 5 log 10以上，為求得該效能指標，滅菌前須將已知數量孢子 (C0) 置入機 體中，待滅菌後取出培養，計數殘餘菌落數 (C1) 求得 log kill 值，其計 算公式如下：
log kill = log (C0/C1)……….(2) 由於菌種培養過程有許多變異性，以及滅菌後菌落數量通常較低，
因此為確保菌落數值的精確性與準確性，必須特別注重低濃度的品管基 準。此外我國法規對於評估效能的菌落數檢測方式並無規範，一般操作 單位難以遵循，因此本研究整理國外重要文獻，自行建立B.S 植菌 (Heterotrophic plate count, HPC) 程序、品管基準及菌落計數準則，其說明 如下：
3-3-1 嗜熱桿菌芽孢植菌程序
3M General outline 1292 Pop 已詳述記載 1292 RRBI 之 B.S 孢子培養 定量程序，因此本研究採用上述3M 之 B.S 取菌程序，並參考美國 Standard Methods 之 9215 Heterotrophic Plate Count (HPC) 中 pour plate method (APHA, 1998)，建立一套 RRBI 孢子標準植菌程序如下：
I. Dilution Water 製備(3M Health Care, 2004 c；APHA, 1998)：
1. Stock solution I：
將34 gm 的 KH2PO4溶於500 mL 的 DI water 中，以 1 N 的 NaOH 調整pH 至 7.2±0.5，再用 DI water 定量至 1L。
2. Stock solution II：
將81.1 gm 的 MgCl2.6H2O 溶於 1L 的 DI water 中。
3. Dilution Water (DW)：
取1.25 mLstock solution I 混合 5 mL stock solution II 後，再以 DI water 定量至 1 L，滅菌後冷卻備用。
II. Spore strip 取菌程序 (3M Health Care, 2004 c)：
1. RRBI 滅菌後待其冷卻，移除 BI 之試管蓋取出培養液安瓿 2. 以無菌鑷子取出 BI 內 spore strip，置入 50 mL 燒杯中。
3. 加入 10 mL 的 DW，使用均質機 (homogenizer) 以 10000 rpm 震 盪2 分鐘，如 figure 3-8 所示。
4. 完成菌種取樣，標示為 sample 1，稀釋率為 10-1。
本研究採用之均質機相關規格如table 3-4 所示，建議使用數字顯示 及轉速控制 (至少 10000 rpm) 之機組，操作體積至少低於 10 mL，且均 質棒直徑建議大於10 mm，以確保長條狀 spore strip 可確實絞碎，並且選 用可承受高溫高壓滅菌之均質棒。
Figure 3-8 RRBI spore strip 取菌程序示意圖
Table 3-4. 本研究均質機機體規格
項目 規格
廠牌 Heidolph
型號 SilentCrusher M 轉速範圍 5000 ~ 26000 rpm 可操作體積 1 ~ 1500 mL 均質棒直徑 1.2 cm
均質棒轉子寬度 9.3 mm
齒縫寬度 2 mm
均質棒長度 15 cm
III. 樣品稀釋程序 (3M Health Care, 2004 c；APHA, 1998)：
III. 樣品稀釋程序 (3M Health Care, 2004 c；APHA, 1998)：