抑菌活性測試

3.6.1 抑菌圈測試(Disc diffusion method)^[35]

以紙錠擴散法(disc diffusion method)的方式量化藥草的抗菌效果，將 37℃，

125 rpm 下培養 5 小時並控制菌體濃度(10⁴ CFU/mL)之菌液 20μL 平板塗抹 於培養基上，再放置含有不同濃度的藥草抗菌萃取液的無菌濾紙（直徑為 D0=6mm）於塗抹過菌液的固體培養基(Agar plate)之上，進行抑菌測試。在 37℃下培養 12 小時，測量各種草藥萃取物所產生的抑菌圈大小(Inhibition zone，界定 6.5mm 以上為有效)。

3.6.2 最小抑制濃度(MIC)之測量^[6][35]

以瓊脂稀釋法(Agar dilution method)為界定 MIC 之方法，將 19mL 未凝固的

LB Agar 灌注在滅菌的容器中，在未凝固前加入 1mL 藥草 stock 溶液混和均 勻後，倒入培養皿中待其凝固後，將 37℃，125 rpm 下培養 5 小時並控制菌 體濃度(10⁴ CFU/mL)之菌液 2μL 直接點於含有抗菌物質的固體培養基上，

培養 12 小時後確認培養基上的菌是否生長（亦即判斷是否有菌落生成）。

MIC 定義為最小有抑菌效果之藥草抗菌萃取液的濃度。

3.7 抗菌效果以劑量響應曲線(Dose-response)評估^[37~38]

將最高濃度的藥草抗菌萃取液連續稀釋至其他的濃度，再以紙碇擴散法的 方式，使待測藥草之藥草抗菌萃取液充滿於直徑 6 mm 的無菌濾紙上(D0)，

置於平板塗抹過菌液的瓊脂平板之上，進行抗菌測試。在 37℃下培養 12 小 時，測量各藥草萃取物所產生的抑菌圈大小(D)。

取多次實驗所得之平均值（至少三重複），以抗生素 tetracycline (140μg/mL) 所產生之抑菌圈大小(DT)為基準（因 tetracycline 濃度在 140μg/mL 時，所 產生的抑菌圈略大於抗菌效果最佳的藥草抗菌萃取液，為避免數據點分佈 過於不均，所以選此濃度為參考），計算出各藥草萃取物之劑量響應(dose response)曲線，並與抗生素 ampicillin 之抗菌效果做比較。

本研究定義 P%的轉換關係公式為：

以藥草萃取液所造成之抑菌圈大小 D(mm)扣除濾紙原有大小 D0表示藥草萃 取液對菌珠所造成的抗菌效果，當 D=6 mm 時，即得 P%=0，表對菌珠不具 明顯抑制效果；若 D 值越大，且越趨近於 DT，P%則趨近於 100%，表對菌 珠的抗菌效果與濃度 140μg/mL 的 tetracycline 效果相近，亦及界定達完全 抑制，而計算出的 P%經由 Probit 轉換（表 2.3.1）可得參數 Y，再將參數 Y 對濃度 Z 半對數作圖並線性回歸得到劑量響應曲線公式(Y=A+B logZ)。

以 ECx的型式，表示達 tetracycline 濃度 140μg/mL 的 x %效果時（亦即藥 草抗菌萃取液產生之抑菌圈達 tetracycline 濃度 140μg/mL 所長生之抑菌圈 的 x％），所需的濃度劑量。當 P%為 0%，所對應之劑量濃度(EC0)，不足影 響菌株的生長，因此仍為菌體可忍受的毒性範圍內，無明顯的抗菌效果；

當藥草萃取物濃度大於 EC0，超出了菌株的可承受範圍，菌體之防禦作用趨 於飽和而無法正常的生長而出現抑菌圈，意義等同於 MIC，隨著藥草萃取 物濃度的增加，抑菌圈範圍亦擴大；當 P%趨近於 100%時，則表示與濃度 140μg/mL 的 tetracycline 效果越接近，亦為界定菌株完全抑制的標準為 EC100。