國立宜蘭大學化學工程與材料工程學系(研究所)

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國立宜蘭大學化學工程與材料工程學系(研究所)

碩士論文

Department of Chemical and Material Engineering National Ilan University

Master Thesis

台灣傳統中草藥的抗菌性研究與劑量響應曲線量化抗菌性 之可行性評估

Toxicity assessment on antibacterial activities of Chinese medicinal plant extracts

指導教授:薛仲娟博士

研究生:羅定宏

英文姓名:Luo Ding-Hung

中華民國 98 年 7 月

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英文摘要

This first-attempt study tended to quantitatively provide dose-response assessment with threshold model upon in-vitro antibacterial activity of some Chinese medicinal plant extracts. Plant extracts in various concentrations spiked with the reporter bacterium Escherichia coli (ca. 104 cfu ml-1) were first spread onto LB agar plates. The determination of inhibition zone via disc diffusion method was then carried out for assessment of antibacterial activity.

Antibacterial activities of two groups of crude plant extracts obtained by maceration (mac.) and decoction (dec.) were significantly different from each other. Extracts of Phyla nodiflora (mac.), Coptis chinensis Franch (mac.) and Coptis chinensis Franch (decoction) were found to be more appropriate to be

antibacterial agents for possible therapeutic uses and Phyla nodiflora (mac.) seemed to be the most feasible one.

Keywords: Antibacterial activity, medicinal plants, dose-response analysis, threshold model

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中文摘要

本研究試圖發展一簡易快速精準的方式進行藥草對細菌之毒性測試:對 台灣本土民間常用治療腸炎、下痢、或肝炎等有類似功效的六種藥草進行 抗菌性檢驗。台灣民間常用藥草如珠仔草(Abrus cantoniensis Hance )、黃連 (Coptis chinensis Franch.)、九層塔(Ocimum basilicum L. )、鴨舌癀 (Phyla nodiflora Greene)、車前草(Plantago major L.)、蒲公英(Taraxacum mongolicum

Hand. –Mazz)。

將本土之六種藥草分別進行甲醇之浸泡萃取(mac.)及熱萃取(dec.),再將各 藥草萃取液製成抗菌檢驗所使用之藥草抗菌萃取液,並對大腸桿菌

(Escherichia coli UVT1)及大腸桿菌(Escherichia coli UV68)做為指標微生 物。以紙錠擴散法(Disc diffusion method)的方式檢驗藥草之抗菌性,並與抗 生素(ampicillin)進行抗菌效果比較。以毒理學中之劑量響應(Dose -response) 曲線,量化各藥草萃取物對 E. coli UVT1 及 E. coli UV68 之抗菌效果。並將 瓊脂稀釋法(Agar dilution method)所得之的最小抑制濃度(minimum

inhibitory concentration ,MIC)值與經由 Dose –response 所預估之 EC0(意義同 MIC)作比較,以確認 Dose –respons 應用於評估藥草抗菌性之可行性。

在所有測試的藥草萃取液中,以鴨舌癀(mac.)、鴨舌癀(dec.)及黃連(dec.) 的抗菌效果最好,經由抗菌能力的量化與 MIC 的比較後發現,鴨舌癀(mac.) 最具未來分離純化的潛力。

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另外也對各藥草之萃取液進行總類黃酮類、總酚類、總花青素原含量之 分析,調查以上成分的含量是否會直接影響到抗菌效果以作為未來分離、

純化的研究指標。

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誌謝

經過了兩年的奮鬥與打拼,終於到了畢業的日子!首先要感謝薛老師給我一個寬廣的舞 台與很大的支持,讓我能充分的揮灑自己的想法。相同的,也要感謝陳博彥老師,對我 的研究始終扮演著燈塔的角色並且也給予很大的幫忙與支持,感謝兩位老師一路上的幫 忙與指導,我可說是兩位老師的學生,能夠成為您們的學生,真的很幸福!謝謝您們!

也要感謝一路相伴的實驗室夥伴們!亦師亦友的嘉儀,總是能和我討論方向及困難的數 據,平時的打打鬧鬧、看 Ptt 的嘻笑,都會是我難忘的回憶!曾經共事的學妹鈺筑、小 芬,感謝妳們始終以超強的行動力來支持我的想法,使我的研究能快速的進展!就算路 上有崎嶇不平的地方,我們也一起克服過,能夠和妳們共事是我的榮幸!也要感謝學弟 韋德,在煩雜的工作下總是能一起搞笑、一起嬉鬧,常常都能保持愉快的心情!謝謝你,

不過…『爪子』與『瓜子』搞清楚了嗎?特別要感謝化材系技士詹先生對實驗室大小事 務的幫忙,因為你的幫忙讓實驗室更好!最重要的是要感謝家人的支持,感謝母親、哥 哥、大嫂、乾爹與姪女阿羚總是在我失意、難過時,不曾離開的看顧著我,求學路上有 你們的支持,我才能走到今天!感謝你們為我奉獻的一切!也要感謝女友妙紜,當我壓 力大、脆弱的時候給我無盡溫柔的陪伴,謝謝你總是包容沒有耐性的我,謝謝你陪我這 麼久,這段日子讓你辛苦了!

能夠和各位相遇或共識,真的是我的福氣!感謝你們!

沒有你們,我根本就做不到!再次感謝各位對我求學路上、生活上的支持與幫忙!

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內文目錄 頁數

英文摘要................... Ⅰ

中文摘要................... Ⅱ

誌謝..................... Ⅲ

一、 前言.................. 1~3 二、 文獻回顧

2.1 抗菌及成分分析文獻回顧............ 4~10 2.2 模式中草藥之概述............... 10~12 2.3 基本毒理學分析................ 12~17 三. 材料與方法

3.1 藥草之取得................. 18 3.2 化學藥品、材料與儀器............. 18 3.3萃取方法.................. 19~20 3.4 成分分析方法

3.4.1 總酚含量測定................ 20

3.4.2 類黃酮含量測定............... 20

3.4.3 總花青素原測定............... 20~21

3.5 菌株.................... 21

3.5.1 菌體培養.................. 21

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內文目錄 頁數

3.6.1 抑菌圈測試(Disc diffusion method)........ 22 3.6.2 最小抑制濃度(MIC)之測量........... 22~23 3.7 抗菌效果以劑量響應曲線(Dose-response)

評估...................... 23~24 四、 結果與討論

4.1 量化藥草抗菌性與最小抑制濃度之比較....... 25~31 4.2 藥草萃取物中之有效活性成分含量比較....... 32~34 五、結論................... 35~38 六、未來展望................. 39 七、參考資料..................

46 八、圖與表..................

47~72

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圖目錄 頁數

(圖 2.3.1)典型之 Dose-response 曲線........ 47

(圖 2.3.2)典型治療曲線與毒性曲線之差異..... 48

(圖 2.3.3)劑量與毒性響應圖............ 49

(圖 2.3.4)不同毒性物質之劑量-響應曲線

(Dose-response curve)可能毒性比較理論圖....... 50

(圖 2.3.5)劑量-響應曲線在低劑量濃度時之不同假設

曲線示意圖.................... 51

(圖3.4.1)總酚類含量檢量線............ 52

(圖3.4.2)總類黃酮類含量檢量線.......... 53

(圖 3.4.3)總花青素原含量檢量線.......... 54

(圖 3.5.1.1)E. coil UVT1 及 E. coil UV68 生長曲線圖.. 55

(圖 4.1.1)各藥草萃取物的抗菌劑量響應曲線比較.... 56

(圖 4.1.2)由(圖 4.1.1)中數據密集分布區之放大圖.... 57

(圖 4.1.3)(A)蒲公英與(B)鴨舌癀之熱萃取與浸泡樣品

萃取抗菌劑量響應曲線比較圖............. 58

(圖 4.1.4)車前草之熱萃取與浸泡樣品萃取抗菌劑量響

應曲線比較圖................... 59

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圖目錄 頁數

(圖 4.1.5)(A)黃連、(B)九層塔、(C)珠仔草之熱萃取與浸

泡萃取抗菌劑量響應曲線比較圖.............. 60

(圖 4.1.6)所有藥草之浸泡萃取抗菌劑量響應曲線比較

圖......................... 61

(圖 4.1.7)所有藥草之熱萃取劑量響應曲線比較圖.... 62

(圖 4.2.1)各藥草萃取液總酚類含量比較圖........ 63

(圖 4.2.2)各藥草萃取物總類酮類含量比較圖....... 64

(圖 4.2.3)各藥草萃取物總花青素原含量........ 65

(圖 4.2.4)各藥草萃取物的總酚類、總類黃酮類、總花青

素原含量組圖..................... 66

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表目錄 頁數

(表 2.1.1)常用抗生素的抗菌機制分類整理表..... 67

(表 2.2.1)本土六種中草藥之已知有效成分表.....

68

(表 2.3.1) Probit 單位及反應率轉換關係表...... 69

(表 3.7.1)Probit 轉換公式代號對照表 70

(表 4.1.1)各藥草萃取物 EC

0

、EC

50

、EC

100

值及計算回

歸公式表..................... 71

(表 4.1.2)各藥草 EC

0

與 MIC 之比較......... 72

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一. 前言

台灣是一島嶼地形且地理位置特殊,是由約在 600 萬年前歐亞大陸板塊 及菲律賓板塊相互擠壓而形成之高山島嶼(稱為蓬萊造山運動),全島長度 約 400 餘公里但緯度卻橫跨熱帶及亞熱帶地區,而地形更是特殊!從盆地 地形到海拔 3000 餘公尺之高山皆有,其中海拔 3500 公尺以上的山峰有 50 多座,3000 公尺以上更多達 200 多座,在 3 萬 6000 平方公里的面積來說,

台灣可說是高山密度世界之冠,也因為如此獨特的地形及地理條件,孕育 出台灣多樣化的生態及許多本土特有的物種,所以開發具地方特色之生物 資源,對資源有限的台灣永續發展更是重要,因此本研究以開發台灣本土 生物資源為起點,找尋具有經濟價值之植物來評估其中草藥使用上之可行 性評估。我國的中草藥醫學發展已有相當之水準,且中草藥的使用流傳已 久,在中國傳統草藥醫學上具有不可抹滅之價值與意義,因此台灣中草藥 科學化開發與利用是有其必要性!所以台灣有得天獨厚的研究環境及條 件,進行相關研究之探討確實十分重要!

再者由於抗生素使用多年,已促使細菌變異產生抗藥性,且抗生素或合 成藥物常有副作用存在,所以開發新藥物以避免未來病菌感染時之難以醫 治,已是當務之急、刻不容緩之目標。長久以來各國民間均有留傳已久之 藥草使用,若以此類草藥為出發來研究,再經科學方法確認有治療效果且

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無毒性,並且能分析出有效成分,使其有效性及應用價值大為提高,更是 開發豐富新藥源之一大課題。

而且可建議在常被病菌傳染肆虐之低開發中國家(或缺乏抗生素或合成藥 物治療之地區)使用這些易取得之有效藥草進行治療,其經濟價值自是不可 限量。例如:腹瀉常發作於嬰兒與在低開發中地區流行之傳染病,在台灣 治療發炎或腹瀉傳統藥草常使用如珠仔草(Abrus cantoniensis Hance-於下文 簡稱 AC)、黃連(Coptis chinensis Franch. –或簡稱 CC)、九層塔(Ocimum basilicum L-或簡稱 OB)、鴨舌癀(Phyla nodiflora (L.) Greene-或簡稱 PN)、車

前草(Plantago major L.- 或簡稱 PM)、蒲公英(Taraxacum mongolicum

Hand.-Mazz-或簡稱 TM)等,上述六種植物,栽種方便且取得不難,因此在 世界各地亦廣汎被使用。大腸桿菌(Escherichia coli)在低開發中地區常是造 成腹瀉之病源[1],亦是會導致嬰孩腹瀉脫水致死,造成高死亡率主要因素之 一。一般而言大腸桿菌(E. coli )在食品及飲用水中的含量被視為重要的衛生 指標,更為環境評估微生物。本研究首次嘗試使用在毒理學上普遍運用之 劑量響應(Dose- response)分析法來量化比較各藥草間之抗菌效果。此可行性 評估研究選用 E. coli DH5α 經照射紫外光所產生的突變菌株 E. coli UVT1 作 為抗菌測試的指標微生物。以紙錠擴散法(Disc diffusion method)的方式進行 測試,紀錄不同萃取物所產生的抑菌圈大小,並且經經由分析計算數據,

並比較劑量響應曲線所推估所得之 EC0與最小抑制濃度(MIC)的差異,並同

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時探討各種藥草量化抗菌效果的可行性。另外,對各藥草之萃取液進行總 類黃酮、總酚、總花青素原含量之分析,調查以上成分的含量是否可能會 直接影響到抗菌效果之因子。同時來比較以兩種不同萃取方法萃取各藥草 而得之萃取液所造抗菌效果及成分含量的差異以作為後續中草藥科學化開 發分離、純化有效成分的重要指標。

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二. 文獻回顧

2.1 抗菌及成分分析文獻回顧

自 1928 年抗生素盤尼西林(penicillin)問世後,藥物濫用就是一直都是存在的議[1],有鑑於現今致病菌的抗藥性問題日益嚴重,世界各國皆積極推出量化藥用 植物之抗菌效果及分析及純化其中抗菌成分,以找尋對抗日趨嚴重致病菌抗藥 性的可行策略。在國內外對傳統草藥抗菌性的研究[45]在近十年內年如雨後春筍 般的出現,乃是因應日趨嚴重致病菌抗藥性的問題更是反應出『取之於自然、

用之於自然』之永續發展理念,各國均投入草藥、植物中有效抗菌成分的分離 研究。

長期以來,抗生素就成為人類對抗病菌傳染疾病的重要醫藥來源,而在 1950 年代歐美,陸續開發出各種的抗生素,且因應世界人口之暴增,抗生素生產也 達到了顛峰,世界年產能更由約 900 公噸到現在高達有 22000 餘公噸,並且持 續上升[1],隨著人類醫學的進步與變化,大量的仰賴抗生素已是不爭的事實,但 是亦由於如此廣泛的使用抗生素,卻也造成了致病菌逐漸產生抗藥性的問題。

致病菌抗藥性的問題日益嚴重之個案中,許多臨床及學術研究提出金黃色葡萄 球菌對抗生素 methicillin 產生嚴重的抗藥性(稱為 MRSA)[3][4],也有許多菌株

(例:肺炎鏈球菌等)對 ampicillin 也產生了抗藥性。[1][2] 若抗藥性的問題不改善 而持續惡化,便會造成院內感染的問題難以控制,此主要是因為抗生素的濫用

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逐漸導致抗藥性產生,而使得被感染後無一抗生素能治療的困境[1]。目前最引起 注意的抗藥性菌株為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),在民國八十五年 時台灣發現的金黃色葡萄球菌的抗藥性比例比歐美各國高[1][4],有 60%的金黃色 葡萄球菌菌株對 methicillin 產生抗藥性,細菌造成抗藥性是因細菌本身基因產生 突變,產生對抗生素的抗藥性,而細菌所產生的基因突變,乃是源自於自然界 中的基因交換,帶有盤尼西林分解酶(penicillinase)基因的葡萄球菌在五十年前被 發現,而最近發現的抗 penicillin 腸球菌,則發現其中的抗藥性基因並非新生成,

而是源自於葡萄球菌的舊基因片段,而此對基因也並非是複製品,而是為了能 與腸球菌結合而修正的基因片段,抗藥性基因片段在各種不同的致病菌中不斷 的修正、交換,就逐漸開始出現具多重抗藥性的致病微生物[3]。當人類使用抗生 素時,抗生素會殺死體內大多數的病菌,但是卻有少數的病菌不會被殺死,但 病菌群落的數量也大大的減少,使得病症減輕許多、或消失,但是抗菌性的基 因卻已經留在未被消滅的病菌體內,在有其他病菌入侵人體時,就有機會將抗 藥性基因轉殖給其他的病菌[3][4],因而產生抗藥性。抗生素是強力又有效的醫 藥,但是抗藥性問題也隨之而來,可能因抗生素效果極佳,才使病菌不得不進 行基因上的改變以求生存,

中草藥萃取物的抗菌性,可被視為新型藥物的研發來源[2],中草藥之功效雖然 在典籍上有清楚的記載,但是其抗菌機制在尚未分離出單一有效成分前,可能 無法了解其抗菌之機制,若出現與抗生素不同的抗菌機制或產生全新的抗菌機

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制,將可能使抗藥性的問題獲得解決。

由(表 2.1.1)中可看到,典型抗生素 penicillin(ampicillin 屬 penicillin 型之抗生 素)與 tetracycline 的抗菌機制,ampicillin 是屬於抑制細胞壁生成的抗菌機制,

而 tetracycline 則是屬於抑制蛋白質生成形的抗菌機制,而中草藥萃取物是屬於 何種抗菌機制,可能待有效抗菌成分分離才可進行鑑定並釐清其抗菌效果是否 有協同作用。在 2003 年台灣大學提出對小球藻萃取物的抗菌機制研究[6],將大 腸桿菌經由小球藻萃取物處理後,再與抗生素 cefodizime 處理之對照組,以 SEM 掃描其菌體型態比較後,發現其型態並未相同,因此辦別可能抗菌機制不相同

[6],中草藥萃取物還要經由分離單一抗菌有效成分,才能進行新藥開發之流程,

但可藉由『推測』抗菌機制再配合實驗(如:SEM 掃描、蛋白質電泳…等)來縮 短流程,而由中草藥所分離的新抗菌成分,其毒性與治療性之劑量關係,是後 續可被研究與評估的重點。

由於抗藥性問題普遍受到各國的重視,所以開始對傳統性替代藥材深入探索,

亦因此投入傳統草藥的抗菌性研究。當然中草藥的應用是為了避免抗藥性的問 題再度發生及惡化,從藥用植物中分離出天然的抗菌化合物更是研究中之重點 及當務之急。[2]目前發現藥草在分離純化前,未經由科學化辨認有效化合物及抗 菌機制前,其有效性目前可能還是無法跟抗生素相比。因此,為了讓藥草的抗 菌效果更加顯著及加強,所有的藥草都必須經過萃取的程序,目前所使用的萃 取方法有很多種(如:浸泡萃取、熱萃取、超音波萃取、微波萃取…等)[7~13]

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但收率(yield%)及產率(針對特定成份而言)卻有所不同,萃取程序除了要讓抗 菌效果更顯著外,亦是為了類比傳統的使用方法。

在藥草中含有許多活性成份(如:總酚類等),而不同的活性成份也都有不同 的效果,在許多文獻中指出黃酮類、酚類、花青素原具有抗氧化的性質,而酚 類或多酚類及黃酮類更是具備了抗菌活性,酚類或多酚類的抗菌機制為利用酚 類化合物上之氧化基,達到抑制微生物體內酵素的功用[45],這種機制跟抗生素 tetracycline 類似,而黃酮類的抗菌機制則是因黃酮類化合物具親脂性的結構會

破壞微生物的細胞膜[45],因此本研究也針對總酚類、總類黃酮類的含量進行檢 測,以瞭解此兩種活性物質的含量是否影響抗菌效果。

在臨床及流行病學來看,1990 年日本爆發大流行的出血性大腸桿菌 (Escherichia coli O157:H7),兒茶(Acacia catechu)、盾住木(Peltophorum pterocarpum)、番石榴(Psidium guajava)、石榴皮(Punica granatum)、沒食子

(Quercus infectoria)、茜草科兒茶鉤藤(Uncaria gambir)…等的酒精或水萃取物對 此菌株顯示出高度的抗菌性,最小抑制濃度(Minimum Inhibition Concentration, MIC)約在 0.09 到 0.78 mg/mL 之間[7],在中亞地區也有提出傳統草藥對於多種致 病菌的抗菌性研究,對 27 種黎國的傳統草藥以水、甲醇萃取物進行抗菌測試,

分別對於大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙 門氏菌(Salmonella enteritidis)…等致病菌的 MIC 值約分布在 1/2 到 1/3.5 之間 (plant extracts volume/LB broth, v/v),且大多數的藥草都具有抗菌性[8],在南非也

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有相關於傳統草藥抗菌性的研究,Halleria lucida L.是南非常見的傳統草藥,目 前已有兩種成分從此中植物中被分離;hallerone 和 halleridone, Halleria lucida L.藥草雖然只對革蘭氏陽性菌(gram-positive)有抗菌效果而其 MIC 約在 1

mg/mL[9]。Halleria lucida L.萃取物具有消滅自由基的活性,葉部萃取物的抗自 由基(ABTS.)活性大於人工的抗自由基藥劑 BHT[9],目前文獻指出自由基的消 滅能力或許和存在於植物內之活性成分含量有關聯(如:黃酮類、總酚類、花 青素…等成分)[10][21],在某些具有優異抗自由基活性的水果中也具有抗菌性。

在對葡萄籽萃取物的相關研究[10~12]中指出,Vitis vinifera 葡萄籽富含酚類、黃酮 類等天然化合物,而酚類化合物具有優異的抗自由基和抗病毒功效,因自由基 可能會攻擊 DNA 鏈使之突變而產生癌症,所以抗自由基效能被視為許多健康食 品的重要性質,黃酮類化合物則是有許多種類已經被鑑定出有抗菌和抗氧化的 功能(如:Rutin、Quercertin…等)[10~12][22~23][45]

,所以酚類、黃酮類化合物的含 量可說和抗自由基、抗氧化、抗菌效果息息相關。Vitis vinifera 葡萄籽萃取物對 於大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門氏菌…等菌株皆有抗菌效果,

萃取物中分離出沒食子酸(gallic acid)對於大腸桿菌和沙門氏菌有抗菌的活性

[9],植物中各種不同種類的活性成分與所產生效果,可作為未來分析、分離單一 有效成分的方針,可將分離的目標及範圍進一步的縮小。台灣有許多傳統草藥,

有些藥草顯示對腸胃道壞菌(如:幽門桿菌)具有抗菌效果,以 50 種藥草經由 乙醇萃取再濃縮後,對 10 種幽門桿菌進行抗菌測試,以白花藤

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(Plumbagozeylanica L.)、月桃花(Alpiniaspeciosa (Wendl.)K.Schum)、雞屎藤 (Paederiascandens (Lour.)Merr.)、木棉花(Bombax malabaricum DC.)的效果最佳 (MIC=5.12~0.64 mg/mL),所測試的藥草中鴨舌癀(也是本研究所選取的藥草之 一)是具抗幽門桿菌活性的藥草之一[13]。鴨舌癀在中草藥典籍中具有清熱解毒、

消腫化瘀的效果[14],因為植物內可能具有對抗胃、腸道菌的成份,所以對於相 似的症狀都有治療效果,若能將其單一有效抗菌成分分離便可以進行新藥開發 的流程,且未經分離與純化的藥草萃取液就有顯著的抗菌效果,那代表萃取物 中抗菌活性成分含量高或抗菌成分的效果佳。藥草的抗菌效果除了取決於藥草 本身的性質外,再者就是如何運用萃取的方法和溶劑來有效的提高產率,以化 合物結構與官能基的觀點來看,選用極性恰到好處的溶劑,才能將有效的將目 標化學物質萃取而出。

本研究針對六種台灣常見並常用於治療腹瀉、發炎等症狀的藥草,對指標微 生物大腸桿菌 UVT1 及 UV68 進行抗菌性的評估,並且調查植物內的活性成分 含量是否影響到抗菌的效果,以進一步的推測抗菌的有效成分是屬於何種類型 之化合物,作為日後進行化合物辨認的參考,以利於進行抗菌有效成分的分離 和純化! 雖然未經分離純化的中藥草萃取物,在抗菌效果或治療效果上,可能 無法和抗生素或單一藥物(如:降血壓藥、抗癌藥…等)相比,且中草藥萃取 效能有其極限(如:收率、萃取技術…等),單一有效成分分離、純化也不易達 成,但台灣中草藥醫學已相當成熟,藉由健康食品及藥膳的概念,可能不需服

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用很高劑量濃度的藥草萃取物在長期飲食中服用,就可能達到保健之目的。正 確且長期的使用安全無虞(即無毒性之疑慮)的藥草萃取物,可能在低劑量之 下抑制病菌生長或達到保健之功效[2]。在許多地區傳統草藥不一定只使用在醫藥 的領域,也有可能是食物的添加劑或香料或是藥膳飲食之食材,所以藉由健康 食品的概念,傳統藥草的附加價值也逐漸的被重視[2],而藥草萃取物中含有的活 性成分含量(如:總酚類、總類黃酮類、花青素原…等),可能與萃取物抗氧化、

抗自由基…等能力有直接之關連,可說是中草藥萃取物的附加 價值。文獻指 出,酚類、黃酮類化合物可能有抗氧化或抗菌的活性[10~12][45],但在未分離前其 作用機制仍然無法完全的了解,因此也可探討藥草萃取液中總酚類、總類黃酮 類含量與抗菌是否有關連。

2.2 模式中草藥之概述

以下對六種所使用的藥草學名、功用及已知的化學成分介紹:

臺灣民間傳統使用藥用植物,車前草(Plantago major L.)、鴨舌癀(Phyla nodiflora Greene)、九層塔(Ocimum basilicum L.)、珠仔草(Abrus cantoniensis Hance)、黃連

(Coptis chinensis Franch.)、蒲公英(Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz)、車前草 (Plantago major L.,或簡稱PM),為車前草科(Plantaginaceae)多年生草本植物,

生長於潮濕的環境,有消炎、止咳的作用,常被用來治療腸炎、痢疾、黃疸、

腹瀉等[14~15],其全草及種子皆有療效,易繁殖[14],水萃取物對於某些致病性真

菌具抑制效果,萃取物對於人類腺病毒(adenoviruses)效果佳[17]。鴨舌癀(Phyla

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nodiflora Greene,或簡稱PN),為馬鞭草科(Verbenaceae)多年生草本植物,有清

熱作用,用於治療腹瀉、痢疾、腸炎等[14],其生命力、繁殖力極強,醇類萃取 物具抑制幽門桿菌(Helicobacter pylori)的效果[10][14]。九層塔(Ocimum basilicum L,或簡稱OB),為唇形科(Labiatae)一年生直立草本植物,適生長於熱帶至溫帶

潮溼的環境,多為人為栽種,常被用於治療胃痛、消化不良、腸炎、腹瀉、跌 打損傷等,亦被用做香料,全草皆具療效[14~16]也具有抗氧化之功效[18]。珠仔草 (Abrus cantoniensis Hance,或簡稱AC),為豆科(Leguminosae)多年生灌木植物,

生長於山坡地陽光充足處,有消炎、鎮痛作用,常用於治療肝炎、胃痛、黃疸、

跌打損傷等症狀,其種子有劇毒,使用時多將其去除 [14][16]

黃連(Coptis chinensis Franch.,或簡稱 CC),為毛茛科(Ranunculaceae)的多年生 草本植物,有野生及人工栽種,有清熱、鎮靜、明目的功效,可治療腹瀉、痢

疾等症狀[14~16],具抑菌功效,且對多種流感病毒具抑制作用[19],多取其根莖為

[14~16]。蒲公英(Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz,或簡稱 TM),為菊科

(Compositae)蒲公英屬的多年生草本植物,可生長於山坡、草地、田野等地,及 略帶鹼性的土質,有清熱、抗菌、消炎、消腫等功效,常用於治療肝炎、膽囊 炎、胃炎、腸炎、痢疾等症狀[14][16],其水的熱萃取物對金黃色葡萄球菌

(Staphylococcus aureus)、溶血性鏈球菌(Streptococcus haemolyticus)有較強的殺菌 效果,對綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、傷寒桿菌(Salmonella enterica serovar Typhi)、肺炎雙球菌(Diplococcus pneumoniae)、腦膜炎球菌

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(Meningococcus)、白喉菌(Diphtheria pertussis)等亦具一定抑制效果,醇類萃取 物對於鈎端螺旋體(Leptospirosis)及某些真菌亦具抑制效果,全株皆具療效[14][20]

上述六種植物,皆為傳統的臺灣民間藥用植物,易栽種,易取得,大部份有 消炎、清熱、抗菌等作用,具治療腹瀉、胃痛、消化不良…等功效。取此六種 藥用植物類比一般使用方式-煎煮、酊劑,改水以溶劑甲醇,進行 12 小時熱萃 取(decoction)及 24 小時浸泡萃取(maceration),將所得之萃取物的溶劑以減壓濃 縮方式去除,加入適量之二甲亞碸(DMSO)溶解[33],以測試其對指標微生物 E.

coli UVT1 及 E. coli UV68 的生長是否亦具抑制效果。

本研究首次嘗試使用毒理學上普遍運用之劑量-響應分析(Dose-response analysis)來量化抗菌效果,大腸桿菌是環境衛生評估微生物,故選用 E. coli DH5α 經照射紫外光所產生的變異種 E. coli UVT1 及 UV68[34]作為抗菌測試的目標。以 紙錠擴散法(Disc diffusion method)的方式進行測試,紀錄不同萃取物所產生的抑 菌圈(Inhibition zone)大小,並且比較各藥草對兩種萃取方法所造成抗菌效果的差 異,且與瓊脂稀釋法(Agar dilution method)所得之最小抑制濃度(MIC)與量化所 得之 EC0比較,以評估量化之可行性。[35]

2.3 基本毒理學分析

毒理學之劑量響應曲線(Dose-response curve)

科技日新月異、突飛猛進的發展下,引入無數新的化學物質於工業應用,許

(26)

多化學物質在未被探討其可能毒性的衝擊前提下,卻以被廣泛的運用。此種現 象處處可見,最明顯之例子是早期 DDT 之運用,因此開發經濟可行性之毒性分 析,刻不容緩。

事實上,毒理學最早期普遍應用於環工、藥物開發…等領域,基於毒理學乃 是源自及探討與人類健康相關的學問,因此演變出許多評估的模式,而劑量響 應(Dose-response)就是其中的一種最基本之評估模式。[36~38]

劑量響應(Dose-response)是一探討『劑量』與『毒性反應』關係的理論,在藥 物開發的領域中,在人類醫學的進步之下,『安全與有效的治療』成為被同時廣 泛討論的重點[36][37],優良的藥物最好是能夠將低劑量投藥與有效期延長的條件 下達到治療效果,而透過劑量響應的分析就可以清楚了解藥物在劑量範圍不同 時對測試對象所產生的毒性反應(或治療效果),(圖 2.3.1)為一般劑量響應的 常見典型曲線,由 A、B、C、D 四條曲線的分佈位置可以判斷因毒性所產生的 反應。圖中的曲線在相同的 Response 基準下,曲線呈現越低劑量(亦即越往左 邊)則毒性反應越明顯,其中斜率較小的曲線(較粗之曲線),代表物質所產生 之毒性反應較弱,而 ECCruve A及 ECCruveD則是代表曲線 A 與曲線 D 最小可產生 毒性的劑量濃度到對大毒性的劑量濃度之區間,由此數線的長短可判別毒性物 質的毒性,圖中 ECCruve A之比 ECCruveD較短,代表毒性物質 A 的毒性較毒性物 質 B 強,相對的曲線 D 的斜率(Slope D)也比曲線 A 來的平緩,所以量化曲線的 斜率與毒性物質的最大及最小劑量濃度範圍是有正比之關係。

(27)

在藥物研發的範疇內,有效的治療曲線與毒性曲線之間的關係(圖 2.3.2),將 會被更深入的討論,MaxED 是藥物治療的最佳劑量濃度,此時是維持最小毒性 的治療劑量,若劑量濃度再增加治療效果會微幅增加後達最大值不再增加,但 毒性也隨之上升。若劑量濃度再持續的增加到最大可容忍的毒性劑量濃度,即 為 MTD,所以 MTD 為最大可容忍的治療劑量濃度上限,劑量濃度再增加都因 劑量所產生的毒性,而為不可接受之劑量濃度。[36]

在本研究將只討論測試微生物對藥草萃取物的毒性反應,以了解及推測藥草萃 取物在不同濃度下的抗菌效果。

當測試微生物受到毒性作用使生理活性受到影響時,就會產生如(圖 2.3.1)

的 S 型曲線分佈,在(圖 2.3.3)可更清楚的看出劑量響應曲線所要探討的重點,

在(圖 2.3.3)中可分為『無效應』(No-effect)、『正比效應』、『最大效應』

(Maximum-effect)三區域。由無效應範圍是指劑量 0 到最小會產生效果所需的劑 量之範圍(亦即 EC0),而最小可產生效果所需之劑量範圍稱為『閥值』(Threshold) 劑量,在閥值劑量以下測試微生物完全沒有毒性反應,可能測試為生物體內產 生一『防衛機制』抵抗毒性物質的作用使本身不受毒性物質的影響。在正比效 應區域劑量原則上是與毒性反應成正比之關係,且毒性物質已超過防衛機制可 容忍之極限,因此測試微生物會產生毒性反應,所以當劑量超過閥值時就會開 始有毒性抑制效果產生,而當劑量持續增加達到某一劑量而使測試微生物完全 失去指標活性時,就稱為『最大效應』,測試微生物會以失去生理活性或死亡來

(28)

表現。[39]

實質上,將不同種類的毒性物質對測試微生物進行測試,若毒性物質對測試 微生物的毒性作用不同時,應會產生不同的劑量響應曲線(Dose-response

curve),若比較不同曲線的閥值,可得知不同毒性物質在低濃度下的毒性反應,

如(圖 2.3.4)所示在最大效應的部份也有 Max1<Max2 的差異,但是並非 Max1

<Max2 就等於 Th1<Th2,因為毒性物質在高濃度和低濃度的毒性反應並非一 致。

一般常見的『毒性劑量-反應模式』至少有為 Probit、Weibull 及 Logit 三種評 估模式[41],這三種評估模式都基於不同之假設發展而成,Probit 模式示假設毒性 物質對於測試微生物的容忍度本身為常態分布,Weibull 模式則是假設毒性物質 和測試微生物產生某些化學作用,而 Logit 模式則是假設毒性反應的形式與測試 為生物體內的某種酵素作用相似。

Probit 模式是一般最常用的劑量-反應模式[42],此模式也被廣泛的使用在各領

[37~39],主要將實驗經驗而得之經驗模式,假設生物對毒性物質的容忍度分佈

為對數之『常態分佈』(Log-normal disribution),其主要以毒性物質之對數值與 反應率之 NED (Normal equivalent deviation)具線性關係為評估基礎,其中反應率 及測試微生物對毒性物質之反應比值。此模式將劑量-反應模式之 S 型曲線,

轉換成為 NED 尺度上的直線關係,例如: 原劑量-反應曲線 50%反應率之位置 對應到 NED scale 上對應值為 0,84.1%反應率對應為 1,而 NED scale 之座標

(29)

加 5 即轉換為 Probit 座標,Probit 單位及反應率與毒性物質劑量間之轉換關係如 下:

Z B

A

Y   log

 

 

 

 

 

 

2 1 5

5 .

0 Y

erf P

其中,Y 為 Probit 轉換單位,而 A、B 則為經轉換後所得回歸線公式之截距、

斜率,Z 為表示到達相當對應抑制毒性所需之劑量濃度(單位:mg/mL),P 為 毒性物質對測試微生物的反應率(如:死亡、抑制生長之比率,單位:%),其 Probit 單位轉換與反應率轉換關係如(表 2.3.1)

本研究之目的為開發評估抗菌性之可行方法,將運用毒理學中之重要理論-

劑量響應曲線計算以紙錠擴散法(Disc diffusion method)所得之抑菌圈(Inhibition zone)大小,推估在不同濃度下毒性物質所造成之抑菌效果,將抑菌圈大小經由 Probit 轉換後可得如(圖 2.3.1)所示之劑量響應 S 型曲線,一般而言,若在實 驗數據點分布範圍內之響應值(亦即數據內插)較為可靠及精確,在外插推估 之理論值部分,由於在實驗數據點無法達到之範圍(如:超過溶解度之範圍或 劑量極為稀薄之條件範圍),因此在運用劑量響應曲線之計算推估上仍有誤差,

但是在毒性安全指標之定義上,外插之推導直接影響到食物及藥品殘留安全含 量之公定標準,所以極為重要,因此隨著科技進展,此公定標準門檻亦會有所

(30)

不同。因此外插值之推估在歸納及定義上,在一個國家科技水平實質上有相當 代表之意義。

在各種不同假設之前提(即使用風險與劑量之比值)下,在低劑量濃度的推 算曲線可能至少會有三種不同之結果(及外插理論值曲線)[43],如(圖 2.3.5)

所示。高劑量濃度時曲線趨勢差異不大,但在低劑量濃度時卻有三種不同之外 插推測曲線,圖中 Curve A、Curve B、Curve C 在相同的使用風險(Risk)下所使 用之劑量卻也有所不同,此三條曲線代表三種不同的閥值,而不同的閥值也代 表不同毒性作用模式。對於藥物而言,需要外插理論曲線的情形,此三種模式 可作為參考,Curve A 稱為『線性模式』(Linear model),此模式是假設一個或多 個的機制或毒性現象與致癌物質相關,無法讀出閥值所以無法運用,而 Curve B 稱為『半線性模式』(Sublinear model),此模式顯現比直線模式更低的使用風險,

可用於懷疑可能導致基因突變的物質上,無法找出閥值也無法運用,Curve C 稱 為『閥值模式』(Threshold model),若毒性物質經由劑量-響應曲線量化後,曲 線呈現此模式即可找出閥值,也可了解在任何對濃度下的劑量與毒性之毒理現 象,代表日後可進行後續之研究或應用。

(31)

三. 材料與方法

3.1 藥草之取得

由民間中藥店購得台灣本土種之車前草(Plantago major L.)、珠仔草(Abrus contoniensis Hance)、鴨舌癀(Phyla nodiflora (L.) Greene)、九層塔(Ocimum basilicum L.)、黃連(Coptischinensis Franck)及蒲公英(Taraxacum mongolicum

Hand.-Mazz)之乾燥藥材,再進行低溫 40℃~50℃磨粉而得之藥草粉末並儲 存於 6℃冰箱中。

3.2 化學藥品、材料與儀器

甲醇(ECHO HPLC grade)、二甲亞碸(TEDIA HPLC/spectro)、抗生素-四環 黴素(tetracycline) (SIGMA) 、抗生素-青黴素(ampicillin) (SIGMA)、矽油(聯 工化學)、Folin-Ciocalteu’s reagent(Fluka)、碳酸鈉(Na2CO3, SHIMAKYU)、

沒食子酸(Gallic acid,Lancaster)、硝酸鋁(Al(NO3)3, SHOWA)、乙酸鉀 (CH3COOK, SHOWA)、檞黃素(Quercertin, Alfa aesar)、香蘭素(Vanillin, SIGMA)、鹽酸(HCl, SHOWA)、兒茶素(Catechin, SIGMA)、Luria-Bertani broth (LB Broth, Miller; Difco) (每升含有 10 g Bacto tryptone, 5 g Bacto yeast

extract, 10 g sodium chloride)、Agar(CONDA USA)、濾紙(ADVANTEC 5A)、

分光光度計(Genesys 20, Thermo spectronic )、旋轉濃縮器(rotavapor)(RE111, Buchi)、水流抽氣機(WJ-20, SIBATA)。

(32)

3.3萃取方法

本研究使用兩種萃取方法,分別是12小時熱萃取(decoction, 或簡稱dec.)及 24小時浸泡萃取(maceration, 或簡稱mac.),以下分別介紹此兩種萃取方法:

熱萃取(decoction):

將萃取溶劑甲醇與藥草粉末以20:1(v/w)的比例混合置入圓底燒瓶中並與冷 凝管組裝後,採用間接加熱法熱萃取,加熱介質為矽油,加熱至萃取溶劑 沸點以上並維持,加熱12小時後降至室溫進行抽氣過濾,所得濾液為藥草 之粗萃取液(Crude extract),將粗萃取液利用旋轉蒸發器在80 rpm 70℃下 進行減壓濃縮去除所有萃取溶劑得藥草萃取物後連瓶稱重,加入適量之 DMSO回溶,製備成抗菌測試所用之藥草抗菌萃取液(式3.3.1)。 浸泡萃取(maceration):

將萃取溶劑甲醇與藥草粉末以20:1(v/w)的比例混合置入血清瓶中並放入磁 石,室溫下進行磁石攪拌24小時後進行抽氣過濾,所得濾液為藥草之粗萃 取液(Crude extract),將粗萃取液利用旋轉蒸發器在80 rpm 70℃下進行減壓 濃縮去除所有萃取溶劑得藥草萃取物後連瓶稱重,加入適量之DMSO回溶,

製備成抗菌測試所用之藥草抗菌萃取液(式3.3.1)。所有的藥草抗菌萃取 液,皆儲放在6℃冰箱內備用。

DMSO

ml

Wr Conc Wa

Stock

.

(單位:mg/mL)

(33)

式中,Wa為內含藥草萃取液去除溶劑後之藥草萃取物之瓶重,Wr為使用 DMSO將藥草萃取物溶解後殘餘之瓶重(DMSO加入量視溶解之情況而定,

一般大約加入5~6 mL),DMSOmL為DMSO加入的毫升數,Stock conc.為藥草 抗菌萃取液之濃度,單位為mg/mL。

3.4 成分分析方法 3.4.1 總酚含量測定[43]

依據Singleton等人(1965)的方法測定。藥草萃取液0.2 mL依序加入1 mL Folin-Ciocalteu’s reagent 及0.8 mL Na2CO3後混勻靜置30 分鐘,以分光光度 計在波長750 nm下測定其吸光值,以沒食子酸(Gallic acid)之標準曲線(圖 3.4.1)做為對照,計算出樣品中總酚類化合物之含量,結果以每克樣品乾 物中相等量的沒食子酸作為表示。

3.4.2 類黃酮含量測定[44]

參考 Jai 等人(1999)之方法經修飾後進行。取藥草萃取液 0.5 mL,加入 1.5 mL 去離子水、0.1 mL 之 Al(NO3)3 (10%)、0.1 mL 之 CH3COOK(1 M)及 2.8 mL 之 H2O,混合後於室溫下靜置 40 分鐘,以分光光度計於 415 nm 測定其吸 光值,並以 quercertin 之標準曲線對照(圖 3.4.2),計算出樣品中類黃酮 (flavonoids) 之含量。

3.4.3 總花青素原測定[45]

依據 Sun 等人(1998)的方法測定。以 0.5 mL 藥草萃取液加入 3 mL(4% 香蘭

(34)

素-甲醇混合溶液加入 1.5mL HCl)混合後於室溫下靜置 15 分鐘,以分光光 度計於 500 nm 測定其吸光值,並以 catechin 之標準曲線對照(圖 3.4.3),

計算出樣品中花青素原(proanthocyanidins)之含量。

3.5 菌株

研究中使用之藥草皆有治療腹瀉、清熱解毒之作用,而引起腹瀉主要原因 之一,可能是大腸桿菌生菌數超量,所以選用大腸桿菌做為測試微生物,

對藥草抗大腸桿菌之能力進行量化,所以採用 E. coli UV68 及 E. coli UVT1 進行實驗。

E. coli UV68 和 E. coli UVT1 為 E. coli DH5α 經紫外光照射後隨機變異所得

之菌株。[34]

3.5.1 菌體培養

將 E. coli UVT1 和 E. coli UV68 置於 LB 培養液,於 37℃,125 rpm 下,前 培養 12 小時,(圖 3.5.1.1)為 E. coli UVT1 與 E. coli UV68 之生長曲線圖,前 培養時確定菌體活性正常規格化,將前培養菌液取 1%(v/v)移入正式培養 5 小時後(亦即對數生長期末期之最佳生長活性),進行後續之抗菌測試。

單一菌落

移入LB培養液中前培養

取1 % 菌液 移至正式培養 37℃

125 rpm 12 hr

抗菌測試 37℃

125 rpm 5 hr

控制菌液濃度

(104 cfu/mL)

(35)

3.6 抑菌活性測試

3.6.1 抑菌圈測試(Disc diffusion method)[35]

以紙錠擴散法(disc diffusion method)的方式量化藥草的抗菌效果,將 37℃,

125 rpm 下培養 5 小時並控制菌體濃度(104 CFU/mL)之菌液 20μL 平板塗抹 於培養基上,再放置含有不同濃度的藥草抗菌萃取液的無菌濾紙(直徑為 D0=6mm)於塗抹過菌液的固體培養基(Agar plate)之上,進行抑菌測試。在 37℃下培養 12 小時,測量各種草藥萃取物所產生的抑菌圈大小(Inhibition zone,界定 6.5mm 以上為有效)。

3.6.2 最小抑制濃度(MIC)之測量[6][35]

以瓊脂稀釋法(Agar dilution method)為界定 MIC 之方法,將 19mL 未凝固的

(36)

LB Agar 灌注在滅菌的容器中,在未凝固前加入 1mL 藥草 stock 溶液混和均 勻後,倒入培養皿中待其凝固後,將 37℃,125 rpm 下培養 5 小時並控制菌 體濃度(104 CFU/mL)之菌液 2μL 直接點於含有抗菌物質的固體培養基上,

培養 12 小時後確認培養基上的菌是否生長(亦即判斷是否有菌落生成)。

MIC 定義為最小有抑菌效果之藥草抗菌萃取液的濃度。

3.7 抗菌效果以劑量響應曲線(Dose-response)評估[37~38]

將最高濃度的藥草抗菌萃取液連續稀釋至其他的濃度,再以紙碇擴散法的 方式,使待測藥草之藥草抗菌萃取液充滿於直徑 6 mm 的無菌濾紙上(D0),

置於平板塗抹過菌液的瓊脂平板之上,進行抗菌測試。在 37℃下培養 12 小 時,測量各藥草萃取物所產生的抑菌圈大小(D)。

取多次實驗所得之平均值(至少三重複),以抗生素 tetracycline (140μg/mL) 所產生之抑菌圈大小(DT)為基準(因 tetracycline 濃度在 140μg/mL 時,所 產生的抑菌圈略大於抗菌效果最佳的藥草抗菌萃取液,為避免數據點分佈 過於不均,所以選此濃度為參考),計算出各藥草萃取物之劑量響應(dose response)曲線,並與抗生素 ampicillin 之抗菌效果做比較。

本研究定義 P%的轉換關係公式為:

) ( )

(

) ( )

% (

0 0

mm D

mm D

mm D

mm P D

T

 

(37)

以藥草萃取液所造成之抑菌圈大小 D(mm)扣除濾紙原有大小 D0表示藥草萃 取液對菌珠所造成的抗菌效果,當 D=6 mm 時,即得 P%=0,表對菌珠不具 明顯抑制效果;若 D 值越大,且越趨近於 DT,P%則趨近於 100%,表對菌 珠的抗菌效果與濃度 140μg/mL 的 tetracycline 效果相近,亦及界定達完全 抑制,而計算出的 P%經由 Probit 轉換(表 2.3.1)可得參數 Y,再將參數 Y 對濃度 Z 半對數作圖並線性回歸得到劑量響應曲線公式(Y=A+B logZ)。

以 ECx的型式,表示達 tetracycline 濃度 140μg/mL 的 x %效果時(亦即藥 草抗菌萃取液產生之抑菌圈達 tetracycline 濃度 140μg/mL 所長生之抑菌圈 的 x%),所需的濃度劑量。當 P%為 0%,所對應之劑量濃度(EC0),不足影 響菌株的生長,因此仍為菌體可忍受的毒性範圍內,無明顯的抗菌效果;

當藥草萃取物濃度大於 EC0,超出了菌株的可承受範圍,菌體之防禦作用趨 於飽和而無法正常的生長而出現抑菌圈,意義等同於 MIC,隨著藥草萃取 物濃度的增加,抑菌圈範圍亦擴大;當 P%趨近於 100%時,則表示與濃度 140μg/mL 的 tetracycline 效果越接近,亦為界定菌株完全抑制的標準為 EC100

(38)

四、 結果與討論

4.1 量化藥草抗菌性與最小抑制濃度之比較

在選取抗菌性試驗之指標微生物過程中,經藥草抗菌性測試後發現,所有 的藥草對 E. coli UV68 所造成的抑菌圈都不明顯或無抑菌圈產生。

由(圖 4.1.1)藥草萃取物抗菌液依產生之抑菌圈經由劑量響應量化之成 果來看,由於數據密集分布在 10-4~108 mg/mL,因此針對數據密集分布的 區域放大可得(圖 4.1.2)。圖中曲線往趨於左邊者抑菌效果較佳,而圖中顯 示效果最佳者為抗生素 ampicillin,其次藥草方面抑菌效果較佳的三者分別 為鴨舌癀(mac.)> 鴨舌癀(dec.) > 黃連(dec.),鴨舌癀不論是熱萃取或浸 泡萃取都有顯著的抑菌效果,代表鴨舌癀可能含有較豐富之抗 E. coli UVT1 有效活性成分。圖中數據點的分佈差異,全因在於不同藥草間的抑菌效果 差異,而曲線的陡峭程度亦即代表指標菌株對各種藥草的容忍不同的範圍。

再者,由於藥草的抗菌性與其中成分組成有直接之關係,萃取方法與溶劑 的選擇更是直接控制其收率及有效成分組成之主要方法,因此以萃取的基 本原理來看;待萃取之目標物的極性必須和使用萃取溶劑相近,才能有達 到最佳萃取效果而不致於使有效成分損失過大,因此若選用極性溶劑萃取 藥草,而藥草萃取液的抗菌效果不顯著,但使用非極性溶劑萃取的抗菌效 果顯著,可能代表待測物中抗菌活性物質主要為非極性的化學物質占優勢

(39)

之組合!由此不同的萃取溶劑選取試驗可大約的預測抗菌活性物質的極 性,以確定抗菌活性物質的極性範圍,以作為分離抗菌活性物質的參考指 標。同時,藥草萃取的方式(如:熱萃取、索氏萃取…等)亦可能會影響 抗菌活性(例:熱敏感性或許會因加熱而變質),使用合適的萃取方法對 藥草的抗菌活性也相當重要。

(圖 4.1.3)中可看到,最佳抗菌效果的鴨舌癀(mac.)的曲線(圖 4.1.3.B) 在熱萃取的曲線左邊,也就是以浸泡萃取方式產生的抗菌性可能較熱萃取 方式為佳,若抗菌物質獲得率的概念來說,代表加熱程序之引入,可能會 破壞某些主要有效的抗菌活性物質或使其失去活性。

在萃取方法上產生明顯差異的蒲公英,此藥草的浸泡萃取還稍具抗菌性,

但經熱萃取後卻呈現較不明顯之抗菌性(圖 4.1.3.A),代表熱萃取可能較不適 用於蒲公英存留抗菌成分之作用,但浸泡萃取的抗菌效果也不顯著(抑菌 圈較小,約 6.5mm 左右),所以雖測,萃取的方法及溶劑可能需要重新選擇,

可選用極性低於甲醇的溶劑進行萃取,再經由抗菌測試探討其抗菌有效成 份之極性區域。

由(圖 4.1.4)是車前草的熱萃取與浸泡萃取的抗菌劑量響應曲線比較圖,

圖中可看到,不論是熱萃取或是浸泡的萃取方法之數據分布點皆集中於 p

%=15~20 之區間(註:萃取效果不佳或所選取的指標菌株之顯著性均可能 是效果不佳之原因),代表車前草萃取物的抗菌效果不佳,但是浸泡萃取與

(40)

熱萃取之曲線之陡峭程度卻也大不相同,其中車前草(mac.)之曲線過於平 緩(EC0到 EC100之區間過大)因此只作圖到 109 mg/mL,然而 109 mg/mL 還是 超過溶解度許多,推測是因數據點分布過於不均,導致劑量響應分析的精 準度大受影響。

相同的情形也發生在(圖 4.1.5)中,浸泡萃取較熱萃取的抗菌性佳,但 車前草(圖 4.1.3)、九層塔(圖 4.1.5.B)此兩株藥草對 E. coli UVT1 的抗 菌性不顯著,尤其是車前草不論是浸泡萃取或熱萃取,即使是在高濃度藥 草抗菌萃取液下的抗菌效果都不顯著,可能車前草本身對 E. coli UVT1 的 抗菌性就不明顯。九層塔的浸泡萃取和熱萃取劑量響應(Dose-response)曲線 很相近,代表浸泡萃取極熱萃取的抗菌效果相近,但九層塔對 E. coli UVT1 的抗菌性仍屬不顯著。在黃連對 E. coli UVT1 的抗菌性方面,黃連(mac.)較 黃連(dec.)抗菌效果佳,(圖 4.1.5.A)中可看到黃連(mac.)與黃連(dec.)的曲 線趨勢大略一樣,但是浸泡萃取之曲線比熱萃取要來的更趨向於低劑量(更 趨向左邊),代表要達到相同的抗菌效果黃連(mac.)所需的濃度劑量較黃連 (dec.)低,且黃連萃取物對於 E. coli UVT1 抗菌效果皆顯著,且黃連為治療 腹瀉的單方藥,這與 E. coli UVT1 的抗菌效果可能有其關連,而珠仔草為 台灣產之本草,其中草藥典籍內所記載也有治療腹瀉、痢疾之功用[14][16]在對 E. coli UVT1 抗菌效果呈現中度(較黃連及鴨舌癀差)之抗菌效果。

(41)

(圖 4.1.6)是所有藥草的浸泡萃取劑量響應(Dose-response)曲線比較圖,

此圖可看出各藥草浸泡萃取的抗菌性差異,其中曲線最為平緩的車前草,

而大多數的藥草曲線都集中在同一區域,代表 E. coli UVT1 對各種藥草的 耐受性可能相近,亦可能是所用萃取方法與指標抗菌分析方法無法完全獲 得出抗菌有效成分之作用,因此透過抗菌性的量化可清楚瞭解萃取方法及 溶劑對抗菌效果的影響,亦可用於萃取方法及溶劑的最佳化。

(圖 4.1.7)是所有藥草的熱萃取劑量響應(Dose-response)曲線比較圖,圖 中所有曲線平均的分佈而最左邊的曲線為黃連,黃連是所有熱萃取中抗菌 效果最好的藥草,此圖可看出各藥草熱萃取的抗菌性差異。

利用(圖 4.1.6)及(圖 4.1.7)兩張圖的交叉比對,再與(圖 4.1.3)及(圖 4.1.5)的熱萃取與浸泡萃取劑量響應曲線圖相比,可得知藥草究竟適不適 合此兩種萃取方法或萃取溶劑的合適性及藥草是否對 E. coli UVT1 具有抗 菌性有系統之了解。(例:萃取方法適用與否、萃取溶劑之極性是否恰當…等)

如(表 4.1.1)所示由 Dose-response 所得之三組數據 EC0、EC50、EC100, 來對藥草的抑菌性進行預測,並將表中之 EC0將及一般普遍使用之 MIC 值 兩相比較,並討論其差異以了解劑量響應曲線(Dose-response)運用於量化抗 菌效果可行性評估,假設 ECx值表示抑制測試微生物生長達 x%所需之劑量 濃度,由表上顯示部分的 EC50及 EC100值已經超過溶解度的上限(葡萄糖 的溶解度:2g/mL),故僅供量化之比較參考。表中之回歸公式(Y=A+B log

(42)

Z),斜率 B 值就毒理學上有來看之解讀,B 值越大(亦即斜率越大)則代 表測試微生物對藥草萃取物之耐受範圍越小(即從 EC0到 EC100的含蓋範圍 越小);反之,若 B 值越小(亦即斜率越小)則代表測試微生物對藥草萃取 物之耐受範圍越大(EC0到 EC100的範圍越大),因此 B 值越大則對未來之 應用性越佳,B 值越大也可能代表藥草萃取物中含有相當有效的成分或含 有相當多的有效成分,亦可作為後續分離有效成分的篩選門檻。但此容忍 範圍的大小與藥草萃取物對菌株產生抑制濃度(EC0)並無絕對關係,表中 ampicillin 的 B 值為 0.672;鴨舌癀(mac.)的 B 值卻為 2.42,但抗生素 ampicillin 產生抑菌效果濃度卻比鴨舌癀萃取物為低。在毒理學中,B 值若大於 1 代 表藥草萃取物對測試微生物屬急毒性,若小於 1 則代表藥草萃取物對測試 微生物屬於緩毒性,而急毒性的定義為暴露在毒性物質下對測試生物在 24 小時內就會造成傷害,而緩毒性也就是長期毒性定義為需要長期暴露或長 期低劑量的攝入可能造成次視為生物的傷害。本研究所測試的藥草萃取物 中,鴨舌癀(mac.)(2.42)、黃連(dec.) (1.93) 、黃連(mac.) (1.15)的 B 值皆大於 1,對測試微生物毒性容忍範圍較小,但抗生素 ampicillin 對測試微生物則 可視為毒性容忍範圍較廣,所以可知毒性容忍範圍跟抑菌效果沒有直接之 關連,只是說明藥草萃取物的濃度與抗菌效果之關係,與其藥草本身之抗 菌性並無直接之關連,僅是討論 EC0到 EC100的範圍之指標。

(表 4.1.2)中以 EC0與 MIC 值進行比較,由 Agar dilution method 所得之

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MIC 值都較 EC0值大,但以數量級的觀點而言大多還算是同一數量級內。

數量級(MIC/ EC0)下差異較小的藥草為:黃連(dec.)(1.22)、鴨舌癀

(mac.)(1.60)、鴨舌癀(dec.)(3.94),由 MIC 的大小比較也可看出抗菌效果受 萃取方法的影響甚鉅,表中除鴨舌癀、九層塔外,其餘四種藥草皆是浸泡 萃取的 MIC 較熱萃取低,推測抗菌活性物質可能具熱敏感性,在熱萃取的 程序中可能被熱能破壞或使其失去抗菌活性,而鴨舌癀、九層塔則是可能 要藉由熱能來達到良好的萃取效果。雖然由 Agar dilution method 所得之 MIC 值都較 EC0大,但數值大小的趨勢是相同的,但兩者因測試方法不同,所 得之結果當然也有所不同,其差異可能主要來自於測試方法本身敏感度的 差異,Agar dilution method 的測試敏感度較優於抑菌圈法。在 MIC 的比較 方面,Vitis vinifera 葡萄籽萃取物對大腸桿菌等測試微生物的 MIC 為

900ppm(0.9mg/mL)[9],而在針對多種阿根廷傳統草藥對大腸桿菌的 MIC 則 為 719~1762μg/mL(0.719~1.762mg/mL),比較之下研究中所使用的藥草效果 都沒有其他研究來的卓越,可能與藥草的萃取方式、溶劑和測試微生物的 敏感性有關,MIC 值雖然為公認評估抗菌能力之標準,但僅可得知藥草在 低濃度的抗菌效果,對於較高濃度的抗菌模式無法瞭解,藥草萃取物雖然 在尚未分離、純化前效果可能無法有效的提昇,但是仍可透過量化得知是 否具有分離純化的潛力。

劑量響應曲線(Dose-response)的精準度受抑菌圈法所得之抑菌圈大小數

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據影響很大,抑菌圈法是一種快速檢驗方法,但仍有些許問題需要克服與 解決,如:抑菌圈法的數據重現性不佳、抑菌圈法的人為變數較多不易控 制…等,都是會影響劑量響應曲線(Dose-response)精準度與精確度的重要原 因,但量化之結果 EC0與 MIC 值大小趨勢相同,只要改善抑菌圈法的問題 就可能提升劑量響應曲線(Dose-response)量化抗菌性的精準度與精確度,使 可行性有顯著的增加。

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4.2 藥草萃取物中之有效活性成分含量比較

(圖 4.2.1)為各藥草萃取物總酚類的含量圖,圖中含量較高為蒲公英(dec.)

>黃連(dec.)>蒲公英(mac.),蒲公英的熱萃取及浸泡萃取物總酚類含量都顯 著比許多的萃取物高出許多,但是蒲公英萃取物的抗菌效果卻不顯著,這 說明了蒲公英的抗菌效果可能與總酚類含量沒有直接的關聯,浸泡萃取與 熱萃取此兩種萃取方式,可能無法萃取出蒲公英中抗 E. coil UVT1 及 UV68 的有效活性成分,但是卻可以有效的萃取出蒲公英的酚類成分物質,而總 酚類的含量與許多活性作用都有關係(如:抗氧化、消滅自由基…等),以 活性物質的含量與抗菌效果互相比較,可以推測抗菌活性物質是屬於何種 類型的成分。

(圖 4.2.2)是各藥草萃取物的總類黃酮類含量圖,圖中含量較高的為黃 連(dec.)>蒲公英(dec.)>黃連(mac.),其中黃連(dec.)與蒲公英(dec.)的總類黃 酮類含量遠高於其他的藥草萃取物,且黃連(dec.)的抗菌效果顯著,因此推 測抗菌有效物質可能為類黃酮物質,日後可針對類黃酮物質進行分離、分 析,而蒲公英(dec.)的總類黃酮類含量也相當的高再與總酚類相互對照之 下,發現蒲公英(dec.)萃取物的抗菌效果雖不顯著,但卻有高含量的總酚類、

總類黃酮類,可能擁有抗氧化或消滅自由基的卓越性能[10][45],若將蒲公英 (mac.)與蒲公英(dec.)的抗菌效果相比,也可作為分離抗菌物質的參考,因蒲 公英的浸泡萃取還稍有抗菌性但熱萃取的抗菌性卻不顯著,日後應可以分

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析、比對此兩種萃取物的成份,以找出熱敏感性的物質是否就為抗菌活性 成分。

(圖 4.2.3)為各藥草萃取物的總花青素原含量,可看到除了黃連、蒲公 英此兩種植物的含量明顯的較其他萃取物多,其中含量較多的為黃連(dec.)

>黃連(mac.)>蒲公英(dec.),花青素原雖然還沒有相關研究指出與抗菌 效能有直接之關係,但是與抗氧化及消滅自由基性能卻息息相關,此兩種 性質在健康食品的領域內,扮演著很重要角色,在現今市面上的健康食品 或維他命,都有提及抗氧化性質,而花青素原的含量與抗氧化之功效有直 接之關係,且花青素原普遍存在於蔬果中,但要在某些蔬果(如:葡萄、

芥藍菜)中才會有較高的花青素原含量,探討藥草中的花青素原含量也是 了解藥草在醫療之外的附加價值,因中草藥在典籍中可見藥草本身就具有 不同的特質(如:清熱解毒、行氣活血…等),若能在健康食品的概念下,

以中草藥為添加物研發出複方的健康食品,將會是日後應用面的新契機。

(圖 4.2.4)為各藥草萃取物的總酚類、總類黃酮類、總花青素原組圖,

在此三張所呈現的組圖中,可看出黃連(dec.)不論在總酚類、總類黃酮類、

總花青素原相較於其他的藥草萃取物之下,皆有相當高的含量,黃連萃取 物有顯著的抗菌性,而黃連也是在中草藥中常見的藥材,而黃連的清熱解 毒之作用更是皆被中醫藥典籍與民間認可,以此分析各類活性成分含量之 數據來推測,黃連可能有卓越的抗氧化性質,可作為運用此藥的醫療價值

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外的附加保健價值之發展。

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五、結論

本研究之目的是開發量化中草藥抗菌性之方法,運用了劑量-響應曲線計 算抗菌效果之數據,以達到量化的目標。為了評估以劑量-響應曲線量化 抗菌性是否可行,由量化而得之 EC0將和由 Agar dilution method 所得之 MIC 比較,以判斷量化之精準度與可行性。

一、 在(表 4.1.1)是量化而得之 EC0、EC50與 EC100數據,但其中 EC50

有些是超過溶解度的(如:車前草(mac.)之 EC50=2.02×1012、九層塔(dec.) 之 EC50=1.06×104),而 EC100則是幾乎全部都超過溶解度(如:黃連 (mac.)之 EC100=1.37×105、珠仔草(dec.)之 EC100=1.08×107),在文獻回 顧中提及劑量-響應曲線的精準度受實驗的數據點分布甚鉅,因此造 成此現象可能是所測試中草藥的數據點大多分佈集中在 P%=50 以 下,所以造成 P%=50 以上的推算產生誤差,在某些藥草(例:車前 草(mac.))出現數據點幾乎都集中在 p%=10~20 之間,此情況之下不 只高濃度之推算是外差理論值,連低濃度的推算精準度都會受影響。

以低濃度推測曲線的觀念而言,藥草萃取物的低濃度外差曲線應屬

『閥值模式』,因中草藥行之有年,有毒性疑慮的藥草皆有清楚的記 載,但外差之三種曲線模式是由對毒性物質本身的了解(如:文獻記

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是未來可討論之議題),所以 EC0與 MIC 之比值,在本研究僅以數量 級比較之概念定義評估可行性。

二、 在(表 4.1.2)EC0與 MIC 的比較上,由 Agar dilution method 所得之 MIC 值都較 EC0值大,但以數量級的觀點而言大多還算是同一數量級 內,雖然由 Agar dilution method 所得之 MIC 值都較 EC0大,但數值 大小的趨勢是相同的,其差異可能主要來自於測試方法本身敏感度的 差異,Agar dilution method 的測試敏感度較優於抑菌圈法。

三、 劑量響應曲線(Dose-response)的精準度受抑菌圈法所得之抑菌圈大小 數據影響很大,抑菌圈法是一種快速檢驗方法,但仍有些許問題需要 克服與解決,如:抑菌圈法的數據重現性不佳(菌體的活性、數量等 皆會造成差異)、抑菌圈法的人為變數較多不易控制(如:抗菌紙碇 的放置、菌液平板塗抹的技巧…等),都是會影響劑量響應曲線 (Dose-response)精準度與精確度的重要原因,相信只要改善抑菌圈法 的數據穩定問題就可能有助於提升劑量響應曲線(Dose-response)量化 抗菌性的精準度與精確度。

四、 從(表 4.1.1)與劑量響應曲線圖(圖 4.1.1)來看,日後具應用或分 離價值的藥草萃取物,需具備 (1)B 值越大 (2)EC0越小 這兩條件者 為佳,因 B 值較大就表示 EC0到 EC100的區間越小,而 EC0越小則是 代表所需的劑量濃度不高就有抑制效果產生。若以『閥值』的概念來

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說,藥草萃取物的閥值越低(類似 EC0越低)越佳,且中草藥醫學發 展行之有年,每種藥材應使用的量在典籍上皆有記載,而此建議用量 也可作為中草藥科學化的參考依據,只要確定閥值在典籍內的建議用 量之內,就可能更進一步確定使用上的安全,而 B 值越大越佳所闡述 的則是 MaxED 的概念, MaxED 是藥物治療維持最小毒性的最佳治 療劑量濃度,所以 MaxED 也是越低越佳,而 MaxED 越低就代表由 閥值到 MaxED 的區間越小(類似 B 值之觀念),雖然 MaxED 越大 則代表藥物的治療毒性不高,但是也代表了此藥物治療效果並不佳,

若只需攝取不高的劑量,就能在達到有效的治療且毒性無虞才是最佳 的情況。

五、 若兩條件都具備則表示,可能萃取物中含有相當多的抗菌有效成分或 是抗菌效果卓越的有效成分,可作為分離純化的參考資料。

六、 運用劑量-響應曲線量化中草藥抗菌性應是可行的,運用劑量-響應 曲線最大的好處是可快速的分析在不同的萃取溶劑、萃取方法時,找 出最合適的萃取條件(以抗菌能力而論),由不同萃取方法的劑量-

響應曲線(圖 4.1.1)量化結果可得知,鴨舌癀最具後續分離、純化之 潛力(不論是浸泡萃取或熱萃取都具顯著之抗菌性),但還是以浸泡 萃取較適合鴨舌癀的萃取(圖 4.1.3),而黃連是一長久以來所用於治 療腹瀉之單方藥,其商業化之藥品更是成熟,其抗菌性也頗為顯著,

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但礙於藥材成本較高,日後之應用面可能受限。

七、 雖然本實驗並未使用不同極性之溶劑,同理於第五點;若使用不同極 性的萃取溶劑再將其抑菌數據經劑量-響應曲線量化後,應可以篩 選、鎖定抗菌有效成分可能的極性區域(由極性不同的溶劑萃取後,

所造成的抗菌效果差異可判別),可作為未來分離、純化的篩選條件 參考,可能節省許多時間及成本。

八、 在活性成份含量的分析中,對各藥草萃取物的總酚類、總類黃酮類與 總花青素原含量進行分析(圖 4.2.4),對於總酚類、總類黃酮類的含 量除了抗氧化之外,可能也和抗菌效果有關,但在本研究的數據中並 未看到此三類活性成份和抗菌效果有直接明顯之關連,但是黃連、蒲 公英的總酚類、總類黃酮類、總花青素原的含量豐富,可能在抗氧化 及消滅自由基能力會有很卓越的表現。中草藥發展以久且學理與技術 以相當成熟,現今在健康食品概念之下,若中草藥萃取物在尚未完全 分離出有效成分時可作為健康食品之添加劑,將會是很好的發展。

九、 萃取方法會造成有效活性成份含量的差異,在研究中發現經由熱萃取 的藥草萃取物的總酚類、總類黃酮類及總花青素原含量較浸泡萃取 高,可能在此三種成份熱萃取比浸泡萃取有更佳的取得效率,但抗菌 效果又有某些藥草是浸泡萃取物的抗菌效果較熱萃取物來的好(如:

鴨舌癀),推測可能是熱萃取會破壞有效成份的官能基是其失去活性。

數據

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參考文獻

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