抗病冬瓜品系對 PRSV-W 免疫基因的分子標 誌之 AFLP 分析 以冬瓜自交系 TVI 4204 為抗病親 本（P1）及 TVI 11577 為感病親本（P2），試驗田 生產 P1、P2、F1、F2、BC1P1 及 BC1P2 等族群，
其幼苗同時進行人工接種 PRSV-W，接種後以目測 紀錄病徵並以 ELISA 確認病毒感染情形。依各裔群 之發病比率進行卡方檢定（Chi-square test），確定 F2 裔群中植株抗感比仍極接近 1：3（抗病性由一 對隱性基因控制）。選取 F2 裔群中分離的抗病（R）
或感病（S）植株，以植物基因體 DNA 純化試劑組
（Plant Genomic DNA Purification Kit, GeneMark, Taiwan）分別萃取其 DNA。依據 bulked segregate analysis（BSA）（Michelmore et al., 1991）的原則，
逢機混合 5 或 7 株的 DNA 為一個樣本，R 和 S 各 有 2 個樣本以供試驗。利用 IRDye® Fluorescent AFLP kit （ LI-COR, USA ） 其 中 含 MseI primers
（containing dNTPs）及 IRDye®-labeled 700 EcoRI primers 各 8 組，以各種 MseI/EcoRI 組合的引子對，
依使用說明書，進行 AFLP 的選擇性擴增（selective AFLP amplification），每個樣本各 2 重複。完成全 部 64 種組合的引子對選擇性擴增，其產物經電泳 後以 LI-COR automated DNA analyzer 呈相，分析其 結 果 顯 示 其 中 的 8 組 （ M-CAA/E-ACA, M-CAA/E-ACT, M-CAA/E-ACG, M-CAC/E-AAG, M-CAG/E-AAG, M-CAG/E-ACG, M-CAT/E-AAC 及 M-CAT/E-AGC ） 在 抗 病 品 系 和 1 組
（M-CAG/E-ACA）在感病品系具有明顯專一之多 型性條帶（圖 64）。
南 部 地 區 瓜 類 病 毒 病 害 調 查 台 灣 位 於 亞 熱 帶，瓜類作物終年均可栽培，病毒病害普遍發生，
常見危害瓜類的病毒有：胡瓜嵌紋病毒（Cucumber mosaic virus, CMV ） 、 木 瓜 輪 點 病 毒 ─ 西 瓜 型
（ Papaya ringspot virus - Watermelon strain, PRSV-W）、矮南瓜黃化嵌紋病毒（Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV ） 、 西 瓜 銀 斑 病 毒
（Watermelon silver mottle virus, WSMoV）、胡瓜 綠斑嵌紋病毒（Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV）及南瓜捲葉病毒（Squash leaf curl virus, SqLCV）…等，可區分為 Topovirus、Potyvirus、
圖 64 利用 IRDye Fluorescent AFLP kit 進行 AFLP，各種引子（primers）反應後，抗病（R2 或 R4）與感病（S1 或 S3）族群 所呈現的多型性圖譜。如箭頭所指即為 M-CAT 引子所擴增出來在兩個抗病族群中都有，但感病族群中皆無的條帶。
Geminivirus、Cucumovirus、Tobamovirus 等五類。
這些病毒在不同瓜類作物的感染率各有差異，而病 毒感染時期的 不同對於植株 造成的影響也 有程度 上的差異。調查高屏地區洋香瓜及西瓜產區之病毒 病害發生，其中以 ZYMV 感染最為嚴重（分別為 44%及 46%），PRSV-W 次之（分別為 33%及 34%）； 胡 瓜 產 區 之 病 毒 病 害 發 生 ， 則 以 ZYMV 為 主
（51%），CGMMV 次之（36%）。田間不同病毒 複合感染情形極為普遍（10-32%），其中以 ZYMV 與 PRSV-W 複合感染為主（55%），ZYMV 與 CMV 複合感染（25%）或 ZYMV 與 CGMMV 複合感染
（20%）則較少。複合感染對於植株造成的病徵比 單一病毒感染之病徵嚴重，病毒單獨感染多出現輕 微的斑駁嵌紋捲曲，複合感染易出現葉片及果實嚴 重畸型或頂芽壞疽，造成植株矮化及生長停滯。
台 灣 萊 豆 病 毒 病 發 生 調 查 及 病 原 種 類 鑑 定 97 年 6 月至 98 年 11 月分別於台中和台南 7 處萊豆 田中採集疑似病株葉片（圖 65），以蠶豆萎凋病毒 2（Broad bean wilt virus 2, BBWV-2）、菜豆普通嵌
紋病毒（Bean common mosaic virus, BCMV）、菜 豆普通嵌紋壞疽病毒（Bean common mosaic necrotic virus, BCMNV）、菜豆黃金嵌紋病毒（Bean goden mosaic virus, BGMV）、黑點豇豆嵌紋病毒（Blackeye cowpea mosaic virus, BlCMV）、菜豆黃化嵌紋病毒
（Bean yellow mosaic virus, BYMV）、胡瓜嵌紋病 毒（Cucumber mosaic virus, CMV）、豌豆種媒嵌紋 病毒（Pea seed-borne mosaic virus, PSbMV）、花生 條斑病毒（Peanut stripe virus, PStV）和 Agdia Poty
（potyviruses）等抗體進行間接法免疫酵素分析
（indirect ELISA）。結果在 76 個樣本中，未發現 與 B B W V - 2 或 B G M V 抗 體 正 反 應 者 ； 在 與 potyviruses 抗體正反應的 45 個樣本當中，包括 40 個 BCMV、3 個 BCMNV、42 個 BlCMV、25 個 BYMV、11 個 PSbMV、及 36 個 PStV 被檢出，其 中 B C M V 、 B l C M V 、 P S t V 有 血 清 交 互 反 應
（cross-reactions）現象；此外尚有 3 個樣本與 CMV 抗體呈陽性反應，28 個樣本具疑似病徵卻無法從上 述抗體反應中檢出。樣本中與 BCMV 抗體呈陽性反
圖 65 萊豆田間發生疑似病毒病的植株葉部病徵。
應者，以汁液接種 Chenopodium quinoa，經單斑分 離得到病毒分離株（c8、c9 和 c12），將其繁殖保 存作為試驗的接種源及對照，c8、c9 和 c12 仍然與 BCMV、BlCMV 及 PStV 抗體同時有交互反應。以 Pot I-HRP5 引子對進行反轉錄聚合酵素連鎖反應
（ RT-PCR ） ， 以 c9 分 離 株 病 毒 RNA 為 模 板
（template），可增殖出 1.4-kb 的核苷酸（CP 基因）， 經基因解序，並與 GenBank 其他病毒基因序列範內 對 應 之 核 苷 酸 進 行 比 對 ， 結 果 c9 與 Accession U34972.1 （ PStV ） 相 同 度 最 高 為 89.2% ， 與 DQ054366.1（BCMV）相同度為 88.3%。另有 CMV 分 離 株 （ CMV-lima ） 亦 以 萊 豆 病 葉 汁 液 接 種 C.
quinoa，經 3 次單斑分離得到。取其 total RNA 以 Cucumovirus-專屬引子：CPTALL-3 及 CPTALL-5
（Choi, et al.,1999）進行 RT-PCR，可增殖出 1kb 的核苷酸（RNA 3 含 CP 的部份），經基因解序，
與其他基因序列範內對應之核苷酸進行比對，顯示 CMV-lima 與 subgroup IB（strains Nt9 and Tfn）相 同度最高為 95-96%，與 subgroup IA（strains Y and Fny）相同度為 93-94%，與 subgroup II （strains LS and Q）相同度為 77-78%。從田間調查結果顯示 BCMV 普遍發生於經濟栽培的萊豆田，CMV 僅偶 然發生。病毒鑑定結果指出 BCMV 為 Peanut stripe strain，CMV 則屬於 subgroup IB。
甘 藷 長 絲 狀 病 毒 快 速 檢 測 技 術 之 建 立 利 用 病毒核酸序列 設計廣泛性及 專一性引子進 行逆轉
錄─聚合酵素連鎖反應（RT-PCR）檢測病毒，或應 用基因選殖與 細菌表現蛋白 系統於甘藷病 毒之分 離、鑑定及抗 體之製備，可 依選定基因片 段之不 同，製備出廣泛性或專一性檢測用抗體，以此技術 進行抗體試劑製備，排除了甘藷病毒無適當系統性 增殖寄主及病毒增殖需 8-10 天等限制因子，3-5 天 即可純化得所需蛋白，進行免疫注射。且因不含植 物蛋白於利用酵素連結抗體法（ELISA）檢測時發 現其對健康植物無背景反應。目前應用專一性引子 進行逆轉錄─聚合酵素連鎖反應（RT-PCR），可檢 測 出 四 種 不 同 病 毒 ， 即 甘 藷 羽 狀 斑 駁 病 毒
（SPFMV）、甘藷潛伏病毒（SPLV）、甘藷病毒 G（SPVG）、甘藷病毒 Y（SPVY）（圖 66）。利 用檢測抗體配合酵素連結抗體法（ELISA）或西方 轉漬法（Western blot）可檢測出甘藷羽狀斑駁病毒 與甘藷潛伏病毒。
感染鳶尾花引起嵌紋病徵之 Potyvirus 病毒鑑 定及利用細菌 表現病毒鞘蛋 白製備病毒多 元抗體 本研究於日本 進口之鳶尾花 植株發現黃化 嵌紋病 徴 之 葉 片 組 織 ， 以 E L I S A （ E n z y m e - l i n k e d immunosorbent assay）檢測出與 Potyvirus 屬病毒專 一性抗血清產生正反應，進一步純化罹病葉片之全 量核酸，利用 Potyvirus 屬之廣效性引子對 HRP 5/Oligo dT 進行反轉錄─聚合酶鏈鎖反應（Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR），
將預期 1.3-kb 核酸產物進行選殖及定序後，獲得一
圖 66 四種長絲狀複合感染於甘藷造成之病徵。
核酸選殖分離株 JI 2。JI2 分離株與 GenBank 上已 登 錄 之 鳶 尾 花 嵌 紋 病 毒 （ Butterfly flower mosaic virus，簡稱 BFMV，序號 AM774001）之鞘蛋白核 苷 酸 與 氨 基 酸 序 列 相 同 度 （ identities ） 均 大 於 99.6%，推測屬於相同病毒之不同系統。設計可增 幅 JI2 全 長 度 鞘 蛋 白 基 因 之 專 一 性 引 子 對 ， 經 RT-PCR 增幅後，將其選殖於表現載體 pET28b（+）
上，再轉型於 E. coli Rosetta（DE3）宿主內誘導大 量表現蛋白之生成，將分子量約 29.5 kDa 之表現蛋 白經兔免疫注射後，得到對應 JI2 之多元抗體（＃
162）。此多元抗體可應用於 ELISA、西方轉漬法
（Western blotting），及 SDS 免疫擴散反應（Sodium dodecyl sulfate immunodiffusion）與同源抗原產生專 一 性 反 應 。 針 對 JI2 之 已 知 核 酸 序 列 所 設 計 之 JI-up/JI-dw 引子對，利用 RT-PCR 可專一性地檢測 出感染 BFMV 之鳶尾罹病組織，此等自製以 JI2 分 離株為來源所 製備對應鳶尾 花嵌紋病毒引 子對及 抗體，可實際應用於進口鳶尾花種球之病毒監測，
提供了我國對此病毒之自主檢測能力之實質助益。
休 耕 地 雜 草 感 染 病 毒 之 發 生 調 查 採 集 休 耕 地雜草疑似感染病毒病害植株，進行生物檢定，分 離病原。接種各種不同之指示植物，探討其寄主範 圍。經血清試驗、PCR 試驗及病毒核酸抽取、分析 及解序，配合生物資訊，鑑定病毒種類。結果如下
（一）霧峰鄉野生牽牛花（Ipomoea sp.）上出現嵌 紋病徵，鑑定為 Sweet potato feathery mottle virus。
（二）霧峰鄉休耕地雜草白花鬼針草（Bidens pilosa L.）葉片上出現嵌紋病徵（圖 67A），經接種分離
為長絲狀病毒感染，核酸比對鑑定為 Bidens mottle virus，其寄主範圍包括菊科植物外，尚可感染豆類 等經濟作物。（三）將軍鄉休耕田中，發現龍葵植 株普遍出現皺葉嵌紋的病徵，從中可分離到 Pepper veinal mottle virus。（四）霧峰鄉洛葵普遍感染有 Basella rugose mosaic virus，此病毒與蝴蝶蘭黃化斑 點病毒（Phalaenopsis chlorotic spot virus, PhCSV）
的鞘蛋白有 96.8%的氨基酸相同，其分類地位尚未 確定。（五）古坑鄉柑桔園的覆蓋植物雙穎雀椑遍 感染有有 Maize dwarf mosaic virus（MDMV）（圖 67B），MDMV 可感染禾本科作物，是甘蔗嵌紋病 毒（Sugarcane mosaic virus）的一個 strain。（六）
陽明山已雜草化的藤三七感染有 Broad bean wilt virus 2（BBWV-2），BBWV-2 可感染多種作物。