第一節 鑑定人類卵巢黏液性囊腺瘤的典型鈣黏 蛋 白 (Identification of classical cadherin subtypes expressed in ovarian mucinous cystadenoma)
Part A. 材 料 (Materials)
實驗的檢體取自本院(中國醫藥大學附設醫院)接受卵巢黏液性 囊腺瘤切除手術的病人(3 位)，組織檢體取自囊腫中隔壁，以液態氮 急速冷凍保存。
Part B. 方 法 (Methods)
(1) RNA 的 萃 取 (RNA extraction) A. 儀 器 (Machine)
1.Source capture system ( Germfree Laboraties) 2.Centrifuges 5810R ( Germany )
3.Microcentrifuge ( Uover Laboratories, USA)
4.Sectrafuge 16M ( National LAbnet, USA) 5.TM firestek B206(Firstek Scientific )
6.Minigel Migration Trough Mupid-2(Cosmo Bio Co LTD, USA) 7.Rocker platform ( Bellco Biotechnology, USA) 8.UV box TFX20M ( Vukber Lourmat, France)
9.DS34 Polaroid Electrophrosis hood ( UK)
B 試 劑 (Reagents)
1.Trizol Reagent ( Life technologies, Inc., Gainthersburg, MD)
2.1X TBE Buffer 3.2% Agarose 4.Chloroform 5.Isopropanal 6.Ethyl alcohol
7.Diethyl Pyrocarbonate
8.Ethidium bromide ( 10mg/ml)
C 步 驟 (Procedure)
↓首先將取得的組織(剪碎)與 1ml 的 Trizol reagent 混合之後，
接著磨碎。
↓在 4℃下，以 8000rmp 離心 1 分鐘後，取出我們所需的上清液。
↓加入 0.2ml chloroform 均勻混合，在室溫靜置下 5 分鐘後，
接著在 4℃下，以 12000rpm 離心 15 分鐘，取出上清液(含 RNA)。
↓加 0.5ml cold isopropanol 於上清液中均勻的混合，接著於 室溫下靜置 10 分鐘後。
↓在 4 ℃下，以 13000rpm 離心 8 分鐘之後，留下沈澱物。
↓加 1ml 之 100% alcohol 於沈澱物中，均勻混合。
↓接著以 4℃、13000rpm 離心 5 分鐘，去除上清液，室溫靜置 5 分鐘(避免沈澱物過度乾燥)。
↓加入 40μl RNAse and DNAse free 之 sterile water，接著以 58℃加熱 10 分鐘使沈澱物溶解。
↓將所得的 RNA product run diagnostic gel，確認我們的 RNA。
↓置於負 80℃的冰箱中保存。
(2) 反 轉 錄 (Reverse transcription) A. 儀 器 ( Machine)
1. TM firestek HB-100 ( Fiestek Scientific ) 2. TM firestek B206 ( Firestk Scientific )
B. 試 劑 (Reagent)
1 Random primer ( Promegma, Madison, WI, USA ) 2. Oligo- dT primer ( Promegma)
3. M-MLVRTase ( Moloney murine leukemia virus ) ( Promegma)
4. 0.1 M DDT( Dithiotheatol) 5. dNTP ( Protech )
6. RNAsin ( Invitrogen) 7. MMLV RT buffer
C.步 驟 (Procedure)
↓將約 5μg 之 total RNA 加 RNAse and DNAse free water 至 23μl。
↓ 接 著 加 入 2μl 濃 度 為 0.5μg 的 random primer and 0.5μ oligo-dT primer 至總量 25.5μl，以 70℃加熱 5 分鐘
後，置於冰上 2 分鐘，接著短暫離心。
↓加入 8μl MMLV RT buffer，2μl MMLV RTase，2μl 0.1M DDT，
2μl dNTP， 0.5μl RNAsin，至總量 40μl 之後，於 37℃放 2 小時，再於 94℃加熱 5 分鐘，置於-70℃ 冰箱中保存。
(3) Degenerate-PCR (Polymerase chain reaction using degenerate primers )
A. 儀 器 (Machine)
1. PCR system 2400 ( Perkin Ellmer, USA)
2. Minigel Migration Throgh Mupid–( Cosmo Bio CO LTD, USA)
3. Rocker platform ( BE11PL
4. UV box TFX 20M (Vukber Lourmat, FRANCE ) 5. DS34d Polarioid Electroporesis hood (UK)
B. 試 劑 ( Reagent) 1. 10X PCR buffer 2. 2.5mMdNTP
3. MgCl2
4. 20μM cadherin degenerate forward primer 5. 20μM cadherin degenerate reverse primer 6. Taq polymerase
C. 步 驟 ( Procedure )
↓2-4μl cDNA 加入 dd water 至總 35μl。
↓接著加入 5μl 的 10XPCR buffer，5μl 的 2.5μl dNTP ，2μl 的 MgCl2 ， 1μl 的 20μM reverse primer ， 1μl 的 Taq polymerase 至總量 50μl。
↓接著進行 PCR，而 PCR 溫度的條件足 95?C hold 5 min，接著 95?C 1.5 min、45?C 2 min、72?C 3 min ，run 35 cycles ， 接著是 72?C 8 min。
↓將 PCR product 植入 PCR- II vector。
Forward : GAATTCACNGCNCCNCCNTAYAYGA Reverse: GAATTCTCNGCNARYTTYTTRAAR
R= either A or G, Y= either C or T, N= either A, C, G, or T
Table 1. Degenerate primers of classical cadherin
(4) Cloning
A.儀 器 (Machine)
1. Microcentrifuge tube 2. Thermocycler
3. Water bath
4. Oribital shaking incubator OS1502
B. 試 劑 (Reagent)
1. Luri-Bertain ( LB ) medium and agar 2. DMF ( Dimethylformamide )
3. X-Gal in DMF (40mg/ml 5-bromo-4chloro-3
indolyd-β-galactoside )
4. Ampicillin stock ( 50 mg/ml)
5. IPTG ( 100mM isopropyl-β-D-thiogalactoside 6. Ligation buffer
7. One shot competent cell Kit ( TOP 10F’ cells ) 8. TA cloning Kit ( Invitrogen, San Diego, CA )
C. 步 驟 ( Procedure )
1. Ligation (clone into PCR II Vector)
↓ 將 1 vial 的 PCR II vector(Fig.10)簡單離心。
↓ 將 先 前 RT-PCR 之 PCR products 加 上 1μl 之 10X ligation buffer 和 2 μl 的 PCR II vector II 。
↓加入 sterile water和 T4 DNA ligase 1μl至總量 10μl。
↓ 於置 14℃ water bath for overnight 。 2. Transformation
↓將先前已被 PCR product clone 的 PCR–II vector 簡 短離心之後，置於冰上。
↓ 加 入 2 μl TOPO cloning reaction 至 competent
↓接著於置於 42℃水槽 30 秒，之後置於冰上。
↓ 於室溫下加入 250μl SOC medium，在以 37℃ shaking incubator 以 225 rpm 平行搖晃 1 小時。
↓取 50μl 及 200μl 之 solution 分別塗於含有 X-Gal 及 50μg/ml Ampicillin 之 LB agar plates 上。
↓等乾之後，將 plate 巔倒於 37℃ 的 incubator 18 小 時，之後置於 4℃ 冰箱。
3. Bacterial growth
↓挑出至少 30 白色菌落，分別將他們放到 30 管 2c.c. LB medium (內含 50μg/ml ampicillin)，在 400rpm 搖，
overnight 之後做 plasmid DNA 分析。
Fig.10 PCR-II Vector
(5) Plasmid DNA extraction and DNA sequence
A.儀 器 ( Machine )
Microcentrifuge
B.試 劑 ( Reagent )
1. Gene-spin Miniprep Purification Kit (Beckman CEQ2000.AB1377,LICORIR², Pharmcia A.L.F) (solution I,Solution II, Wash Solution )
2.Restriction enzyme 10X buffer H (900mM Trisk-HCL, 500mM NaCl, 100mM MgCl2 )
3.EcoRI Enzyme sotorage buffer ( 10mM Tris-HCL, 400mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1ml Triton X-100, 1 mM DTT, 0.15%
Triton X-100, 0.5mg/ml BSA, 50% glycerol
C.步 驟 (Procedure) 1. Plasmid DNA extraction
↓ 取 1ml 的 bacterial media，以 13000rpm 離心 30-60 秒之 後，取 pellet。
↓ 接著加入 200μl Solution，Vortex 5-6 次使細胞溶解。
↓ 之後加入 200μl Solution，Vortex 5-6 次。
↓ 加入 200μl Solution，Vortex 5-6 次。
↓ 13000rpm 離心 5 分鐘。
↓ 將 spin column 放入 collection tube，接著將上清液小 心放入 spin column。
↓ 離心 30 秒之後，將 spin column 移出 collection tube。
↓ 將過濾液丟棄，加入 500μl 的 washing solution。
↓ 離心 60 秒之後，丟棄過濾液，再度離心 3 分鐘,去除殘餘 的 ethanol。
↓ spin column 放入新的 1.5ml eppendorff 中，加入 65°C 的 50μl H2O。
↓ 離心 1 分鐘，以分離出 DNA，
(如果重覆最後兩個步驟就可多得 10-15%的 DNA)
2.DNA 定 序
↓ 上面的 products 加入 10μl sequence reaction solution，
10μl H20，60μl 100% 的 Isopropanel，之後 vertex briefly
↓ 室溫下靜置 25 分鐘。
↓ 用最大速度離心 30 分鐘之後，去除上清液。
↓ 以 75% isopropanol 250μl rinse，vertex briefly。
↓ 離心 5 分鐘，接著同樣去除上清液。
↓ air dry，stock at -20?C，接著將 samples loading 到 gel。
↓ 接著以 automated DNA sequencer 來分析 DNA sequence。
↓ 再利用 BLAST computer program 與 Genebank/EMBL 的資 料庫與我們得到的 DNA sequences 做比對，以確認我們得 到的典型 Cadherin subtypes。
第二節 比較典型鈣黏蛋白在卵巢黏液性囊腺瘤 與正常卵巢表面上皮細胞中 mRNA 濃 度的表現差異
Part A.材 料 (Materials)
實驗的檢體取自本院(中國醫藥大學附設醫院)接受卵巢黏液性
囊腺瘤切除手術的病人(3 位)，組織檢體取自囊腫中隔壁，以液態氮 急速冷凍保存。正常卵巢表面上皮細胞則取自 3 例 45 歲以上無卵巢 癌家族史，因良性子宮肌瘤(Myoma)或子宮腺肌症瘤(Adenomyosis) 施行子宮切除合併單側或雙側預防性卵巢切除手術之正常卵巢表 皮，以無菌刷子將卵巢表面的上皮細胞刷下來，直接抖入培養基中再 到入培養皿，然後移入細胞培養箱培養。在第一部分的實驗中,我們 已知在卵巢黏液性囊腺瘤中有哪一些典型鈣黏蛋白存在，以相同的檢 體，接著我們要比較這些典型鈣黏蛋白在正常卵巢表面上皮細胞及黏 液性囊腺瘤的 mRNA 濃度的表現差異。
Part B. 方 法 (Methods) (1) 培 養 OSE 細 胞
↓ 組織取自因良性子宮肌瘤施行子宮切除合併單側或雙側預
防性卵巢切除手術之正常卵巢表皮。
↓ 以無菌刷子將卵巢表面的上皮細胞刷下來，直接抖入培養基
中[培養基: medium199 - MCDB105 (1:1) (Sigma, St.
Louis,MO)加 15% FBS、100μg/ml 的 penicillin streptomycin 及 2.5μg/ml Fungizone]。
↓ 再到入培養皿，然後移入細胞培養箱培養，直到細胞產生
匯合現象(confluence)。
↓ 接著以 0.06% trypsin(1:250)及 0.01% EDTA 將細胞分離。
↓ 再以 1:3 的比例分盤繼續培養大約 48 小時後，作 mRNA 萃 取。
(2) RNA 的 萃 取 及 定 量
(儀器和試劑與第一節 part B 相同 )
步 驟 (Procedure)
↓ 取 2μl RNA，加入 3μl dd water 及 5μl RNA denatute buffer。
↓ 在 58℃下加熱 15 分鐘。
↓ 接著放置在冰上 2 分鐘。
↓ 短暫離心之後，加入 2μl 的 RNA loading buffer。
↓ 跑膠。
↓ 將膠放在 EBTBA 內染色 30 分鐘。
↓ 接著取出膠，在 UV box 照相，評估 RNA 的相對含量。
(3) RT
(儀器、試劑和步驟與第一節 part B 相同)
(4) PCR
儀器、試劑和步驟與一節 partB 相同，其中要特別注意的是，
因為要比較 mRNA 的量，所以要求出每個鈣黏蛋白適當的 cycle 數。
步 驟 (Procedure)
↓ 首先以 PCR 的方式得到的 GAPDH ( house keeping gene )，
run 不同的 cycle 數，會得到一直線，取其中間值為我們要 的 cycle 數，GAPDH 是 22(Fig.19)。
↓ 同樣的方法算出各種典型鈣黏蛋白適當的 cycle ( Fig.20–
Fig.25)。
↓ 算出卵巢黏液性囊腺瘤及卵巢表皮上面所需的 mRNA 量。
↓ 接著以六種典型鈣黏蛋白的 primer(Table 2)製造 cadherin products。
↓ 將所得的 cadherin products 以電泳分析及評估 DNA 的量。
** DNA 產 物 之 定 量 **
↓ 加入 2μl DNA loading buffer。
↓ 跑膠。
↓ 將膠放在 EBTBA 內染色 30 分鐘。
↓ 接著取出膠，在 UV box 照相，評估 DNA 的相對含量。
↓ 定量是藉由 Hewlett Packer Digital scanner 將 cadherin products 相 片 掃 描 至 電 腦 之 後 ， 以 UN-SCAN-IT Gel Version 5.1 system ( Silk Scientific, Orm, Utah ) 來 分析，求得 cadherin/GAPDH mRNA 的比值。
Gene primer sequence size
Cad-11 Forward Reverse
5’-ACCAGATGTCTGTGTCAGA-3’
5’-GTCATCCTTGTCATCTGCA-3’
742bp
Table 2. Primers for RT-PCR
第三節 比較生殖腺類固醇接受 體 (雌 激 素 接 體、雄激素接受體及黃體酮接受體)在 卵巢黏液性囊腺瘤與正常卵巢表面上 皮中 mRNA 濃度的表現差異
Part A. 材 料
實驗的檢體取自本院(中國醫藥大學附設醫院)接受卵巢黏液性 囊腺瘤切除手術的病人(3 位)，組織檢體取自囊腫中隔壁，以液態氮 急速冷凍保存。正常卵巢表面上皮細胞則取自 3 例 45 歲以上因良性 子宮肌瘤(Myoma)或子宮腺肌症瘤(Adenomyosis)施行子宮切除合併 單側或雙側預防性卵巢切除手術之正常卵巢表皮，以無菌刷子將卵巢 表面的上皮細胞刷下來，直接抖入培養基中再到入培養皿，然後移入 細胞培養箱培養。
Part B. 方 法
(1) RNA 的 萃 取 及 定 量
(儀器和試劑與第二節 Part B 相同)
步 驟 (Procedure)
↓ 取 2μl RNA，加入 3μl dd water 及 5μl RNA denatute
buffer。
↓ 在 58℃下加熱 15 分鐘。
↓ 接著放置在冰上 2 分鐘。
↓ 短暫離心之後，加入 2μl 的 RNA loading buffer。
↓ 跑膠。
↓ 將膠放在 EBTBA 內染色 30 分鐘。
↓ 接著取出膠，在 UV box 照相，評估 RNA 的相對含量。
(2) RT
(儀器、試劑和步驟與第二節 Part B 相同)
(3) PCR
儀器、試劑和步驟與二節 Part B 相同，其中要特別注意的是，
因為要比較 mRNA 的量，所以要求出每個生殖腺類固醇接受體適 當的 cycle 數。
步 驟 ( Procedure )
↓ 首先以 PCR 的方式得到的 GAPDH ( house keeping gene ) ，run 不同的 cycle 數，會得到一直線，取其中間值為我們要的 cycle 數，GAPDH 是 22。
↓ 同樣的方法算出各種生殖腺類固醇接受體適當的 cycle (Fig.
26–Fig.29)。
↓ 算出卵巢黏液性囊腺瘤及卵巢表皮上面所需的 mRNA 量。
↓ 接著以生殖腺類固醇接受體的 primers(Table 3)製造 sex steroid receptor products。
↓ 將所得的 products 以電泳分析及評估 DNA 的量。
** DNA 產 物 之 定 量 **
↓ 加入 2μl DNA loading buffer。
↓ 跑膠。
↓ 將膠放在 EBTBA 內染色 30 分鐘。
↓ 接著取出膠，在 UV box 照相，評估 DNA 的相對含量。
↓ 定量是藉由 Hewlett Packer Digital scanner 將 steroid receptors products 相片掃描至電腦之後，以 UN-SCAN-IT Gel Version 5.1 system ( Silk Scientific, Orm, Utah )
來分析，求得 steroid receptors/GAPDH mRNA 的比值。
Androgen Forward Reverse
5’-GCATGGTGAGCAGAGTCCCTATC-3’
5’-TCCCAGAGTCATCCCTGCTTCAT-3’
365bp
Progesterone Forward Reverse
5’-GCAATGGAAGGGCAGCACAAC-3’
5’-CTGGGTTTGACTTCGTAGCCC-3’
741bp
Table 3. Primers for Steroid receptors