檢測卵巢黏液性囊腺瘤的典型鈣黏蛋白及生殖腺類固醇接受體並與卵巢表面上皮作比較; Identification of the classical cadherin subtypes and the gonadal steroid receptors present in the ovarian mucinous cystadenoma and in comparison with the ovarian surface epithelium

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(1)中國醫藥大學醫學研究所碩士學位論文. 檢測卵巢黏液性囊腺瘤的典型鈣黏蛋白及生殖腺類固醇接受體並與卵巢表面上皮作比較. Identification of the classical cadherin subtypes and the gonadal steroid receptors present in the ovarian mucinous cystadenoma and in comparison with the ovarian surface epithelium. 指導教授：陳澤昭副教授研究生：何銘. 中華民國九十三年六月. 1.

(2) 中文摘要背景：卵巢黏液性囊腺瘤(ovarian mucinous cystadenoma)是第二常見的上皮性卵巢腫瘤，其主要來源為卵巢表面的上皮細胞(OSE)，它從單層的上皮細胞演變成巨大的囊腫，其真正機轉到目前為止還不清楚。鈣黏蛋白 (cadherin)是一種存在於細胞膜上的細胞沾黏分子 (cell adhesion molecule)，其功能為細胞與細胞間的接合，以及在胚胎發育中主導不同組織及器官的形成，同時它與細胞的分化 (differentiation)及腫瘤病變(tumorigenesis)也有密切的關係。至於生殖腺類固醇接受體(gonadal steroid receptor)是一種細胞核接受體，生殖腺荷爾蒙的作用是透過接受體而達成，過去的研究發現生殖腺類固醇接受體在的表現可能與卵巢癌的發生有關。但到目前為止，尚無文獻專門探討黏液性囊腺瘤形成的機轉。基於這一點，我們嘗試從 cadherin 及 steroid receptor 的角度去探討 OSE 形成 mucinous cystadenoma 的可能機轉。方法：收集三例卵巢黏液性囊腺瘤的檢體，利用 degenerate reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)和 DNA 定序來找出所有存在於卵巢黏液性囊腺瘤的典型鈣黏蛋白。然後再利用半定量(semiquantitative)RT-PCR 來比較卵巢黏液性囊腺瘤與 OSE 之間鈣黏蛋白和生殖腺類固醇接受體 mRNA 的表現差異。 2.

(3) 結果：我們確認卵巢黏液性囊腺瘤中有六種鈣黏蛋白，分別是 Epithelial-cadherin (E-cad) 、 Placental-cadherin (P-cad) 、 Neural-cadherin (N-cad)、Retinal-cadherin (R-cad)、cadherin-6 (cad-6) 和 cadherin-11(cad-11)。比較這六種鈣黏蛋白在卵巢黏液性囊腺瘤與 OSE 的表現差異時，發現 E-cad 及 P-cad mRNA 的表現在卵巢黏液性囊腺瘤中較 OSE 明顯增多，N-cad、R-cad 及 cad-6 則明顯減少，cad-11 則無明顯差異；至於生殖腺類固醇接受體的表現，無論是 estrogen receptor-alpha (ER-a)、estrogen receptor-beta (ER-β)、progesterone receptor (PR)或 androgen receptor(AR) 在卵巢黏液性囊腺瘤中都明顯增多。結論：我們確認有六種鈣黏蛋白存在於卵巢黏液性囊腺瘤中，而 E-cad 和 P-cad 的強化(up-regulation)及 R-cad、N-cad 與 cad-6 的弱化 (down-regulation)應該與卵巢黏液性囊腺瘤的形成有關；至於ER-a、 ER-β、PR 及 AR 的強化可能與卵巢黏液性囊腺瘤的形成有關，這些接受體的強化表現也可能是卵巢黏液性囊腺瘤快速長大的因素。. 3.

(4) Abstract Ovarian mucinous cystadenoma is the second common primary epithelial ovarian tumor. It has been mentioned to originate from a single layer of the ovarian surface epithelium (OSE). Once the tumor formed, it may reach an enoromous size even filling the entire abdominal cavity in a short period of time. However, the pathogenesis of this tumor remains unknown. In order to gain a better insight into its pathogenesis, we have analyzed the expression of classical cadherins and gonadal steroid receptors in this tumor. By using degenerate reverse transcription cadherins. polymerase subtypes,. placental-cadherin. chain. reaction. (RT-PCR),. epithelial-cadherin. (P-cad),. neural-cadherin. six. (E-cad), (N-cad),. retinal-cadherin (R-cad), cadherin-6 (cad-6) and cadherin-11 (cad-11) were identified in ovarian mucinous cystadenoma. In addition, w e compared the messenger RNA (mRNA) levels of these cadherin subtypes in mucinous cystadenoma and OSE by using semiquantitative RT-PCR. We found that E-cad and P-cad were significantly increased, but N-cad, R-cad and cad-6 were. 4.

(5) significantly decreased in mucinous cystadenoma. The mRNA levels of cad-11 were similar between mucinous cystadenoma and OSE. Furthermore, we also demonstrated that the mRNA levels of sex steroid receptors including estrogen receptor-alpha (ER-α)、estrogen receptor-beta (ER-β)、progesterone receptor (PR) and androgen receptor(AR) were much higher in mucinous cystadenoma than in OSE by using semiquantitative RT-PCR.In conclusion, E-cad, P-cad, ER-α, ER-β,PR and AR were over-expressed, N-cad, R-cad and cad-6 were down-regulated in mucinous cystadenoma, We speculated that the development of ovarian mucinous cystadenoma is mediated at least in part by up-regulation of the E-cad, P-cad, ER-α, ER-β,PR a nd AR, and down-regulation of the N-cad, R-cad and cad-6. The fast growth characteristics of this tumor are mediated by the stimulation of the gonadal steroids through the over-expressed receptors.. 5.

(6) 誌謝自中國醫藥大學醫學系畢業後，即在母校的附設醫院從事婦產科的臨床工作。雖然現代的醫學非常進步，但臨床治療往往是發病之後的補救措施，乃為下策。因此一直希望有機會能夠由基礎醫學的研究來探討疾病形成的機轉，進而治療及預防疾病的發生，這便是我想要進入研究所進修的動機。匆匆的兩年過去了，這段日子以來要感謝的人實在太多。首先要謝謝我的指導教授陳澤昭博士，這兩二年來給予我的指導及照顧，使我不論在實驗的原理、資料的判讀及做學問應有的態度方面，都獲益良多。同時也要感謝我的臨床導師蔡鴻德教授在臨床研究的提攜及督導。還有要感謝黃鈺媚小姐在實驗過程中的鼎力協助，以及戴金道學長和張穎宜學姐提供的研究經驗，也要感謝洪耀欽主任、葉聯舜主任及李建忠主任在臨床工作上予以我的協助及體諒，和醫院提供及鼓勵臨床醫師進修的機會。最後要感謝我摯愛的妻子玉雲，以及女兒何欣、兒子何丰在這段日子的陪伴與鼓勵，使得論文能夠順利完成。. 6.

(7) 目錄頁數封面. ----------------------------------------------------------------------------1. 中文摘要. ----------------------------------------------------------------------2. 英文摘要. ----------------------------------------------------------------------4. 誌謝辭目錄. -------------------------------------------------------------------------6 ----------------------------------------------------------------------------7. 圖目錄. ------------------------------------------------------------------------9. 表目錄. -------------------------------------------------------------------------12. 符號與縮寫. -------------------------------------------------------------------13. 第一章. 前言. 第一節. 導論 -------------------------------------------------------------16. 第二節. 卵巢黏液性囊腺瘤. -----------------------------------------18. 第三節. 卵巢表面上皮細胞. ----------------------------------------21. 第四節. 鈣黏蛋白. 第五節. 生殖腺類固醇接受體. -------------------------------------39. 第六節. 研究假說與研究架構. -------------------------------------45. 第二章. ----------------------------------------------------26. 研究材料與研究方法. 第一節鑑定卵巢黏液性囊腺瘤的鈣黏蛋白種類 --------------46. 7.

(8) 第二節. 比較六種典型鈣黏蛋白在卵巢黏液性囊腺瘤與正常卵巢表面上皮中 mRNA 濃度的表現差異. 第三節. --------------------------------------------------60. 比較生殖腺類固醇接受器(雌激素接受體、雄激素接受體及黃體酮接受體)在卵巢黏液性囊腺瘤與正常卵巢表面上皮中、mRNA 濃度的表現差異. 第三章. --------------------------------------------66. 研究結果. 第一節卵巢黏液性囊腺瘤典型鈣黏蛋白的種類 --------------70 第二節. 比較六種典型鈣黏蛋白及生殖腺類固醇接受體的 mRNA 在卵巢黏液性囊腺瘤與正常卵巢表面上皮的表現 ---------------------------------80. 第四章. 討論. 第五章. 結論與建議. ----------------------------------------------------------95. 第一節. 結論. 第二節. 未來研究方向. ----------------------------------------------------------105 ----------------------------------------------106. 參考文獻. ---------------------------------------------------------------------107. 作者簡介. ---------------------------------------------------------------------144. 博項士論文電子檔案網上授權書 ---------------------------------------145. 8.

(9) 圖目錄 Figure 1. Gross picture of ovarian mucinous cystadenoma ----19 Figure 2. Microscopic picture of ovarian mucinous cystadenoma -----------------------------------------------------------------------20 Figure 3. Microscopic picture of ovarian surface epithelium -----------------------------------------------------------------------24 Figure 4. Hypothesis of epithelio-mesenchymal conversion of ovarian surface epithelium --------------------------------25 Figure 5. Cadherin structure ------------------------------------------29 Figure 6. Classical cadherin structure and conserved regions -----------------------------------------------------------------------30 Figure 7. Cadherin-catenin complex ---------------------------------31 Figure 8. Model of s teroid hormone action -----------------------40 Figure 9. Steroid receptor structure ------------------------------41 Figure 10. PCR-II vector -------------------------------------------------55 Figure 11. Apar plate for the selection of transformed bacteria -----------------------------------------------------------------------72 Figure 12. Ethidium bromide-stained gel of plasmid DNA and PCR products -------------------------------------------------------73 Figure 13. E -cadherin sequence ---------------------------------------74 Figure 14. N -cadherin sequence ---------------------------------------75. 9.

(10) Figure 15. P-cadherin sequence ----------------------------------------76 Figure 16. R-cadherin sequence ----------------------------------------77 Figure 17. Cadherin-6 sequence ----------------------------------------78 Figure 18. Cadherin-11 sequence --------------------------------------79 Figure 19. Validation of PCR cycles for GAPDH ----------------------81 Figure 20. Validation of PCR cycles for E-cadherin -----------81 Figure 21. Validation of PCR cycles for N -cadherin ------------82 Figure 22. Validation of PCR cycles for P -cadherin ------------82 Figure 23. Validation of PCR cycles for R-cadherin -----------83 Figure 24. Validation of PCR cycles for Cadherin-6 -----------83 Figure 25. Validation of PCR cycles for Cadherin-11 -----------84 Figure 26. Validation of PCR cycles for Estrogen receptor-α --------------------------------------------------------------------84 Figrure 27.Validation of PCR cycles for Estrogen receptor-β --------------------------------------------------------------------85 Figure 28. Validation of PCR cycles for Progesterone receptor --------------------------------------------------------------------85 Figure 29. Validation of PCR cycles for Androgen receptor ------------------------------------------------------------------- 86. 10.

(11) Figure 30. Comparison of E-, N-, P-cadherin mRNA in ovarian mucinous. cystadenoma. and. ovarian. surface. epithelium ----------------------------------------------------88 Figure 31. Comparison of R -cadherin, cadherin-6, cadherins-11 mRNA in ovarian mucinous cystadenoma and ovarian surface epithelium -------------------------------------------90 Figure 32. Comparison of Estrogen receptor-α, Estrogen receptor-β, progesterone receptor mRNA in ovarian mucinous cystadenoma and ovarian surface epithelium -----------------------------------------------------92 Figure 33. Comparison of Androgen receptor mRNA in ovarian mucinous cystadenoma and ovarian surface epithelium -----------------------------------------------------94. 11.

(12) 表目錄 Table 1. Degenerate primers of classical cadherins -------------52 Table 2. Specific primers of cadherins for RT-PCR -------------65 Table 3. Primers for steroid receptors ----------------------------69 Table 4. Analysis of cadherin cDNA clones generated from ovarian mucinous cystadenoma -----------------------------71. 12.

(13) 符號與縮寫 AR. Androgen receptor. bp. Base pair. Ca. Calcium. Cad. Cadherin. CAR. Cell adhesion recognition. DBD. DNA binding domain. DDT. Dithiotheatol. DNA. Deoxyribonucleic acid. Dscs. Desmocollin. Dsgs. Desmoglein. EC. Extracellular. E-cad. Epithelial-cadherin. ER-∝. Estrogen receptor alpha. ER-β. Estrogen receptor beta. Fig. Figure. GAPDH. Glyceraldehyde-3-phosphate- dehydrogenase. HAV. Histidine Alanine Valine. IPTG. Isopropyl-β-D-thiogalactoside. 13.

(14) kb. Killobase. LBD. Ligand binding domain. M. Marker. mg. Milligram. MgCl2. Maginum chloride. Min. Minute. ml. Milliliter. mM. Millimolar. M-MLV. Moloney murine leukemia virus. MMPS. Matrix metalloproteinase. mRNA. Messenger Ribonucleic acid. NaCl. Sodium chloride. N-cad. Neural cadherin. NTP. Nucloside triphosphate. NTD. N-terminal domain. OSE. Ovarian surface epithelium. PBS. Phosphate-buffered saline. P-cad. Placental cadherin. Pcdh. Protocadherin. 14.

(15) PR. Progesterone receptor. R-cad. Retinal cadherin. RT-PCR. Reverse transcription-polymerase chain reaction. T-cad Tris-HCL. Truncated cadherin Tris(hydroxymethyl)-. aminomethane. -. hydrochloricacid Tyr. Tyrosine. UV. Ultra-violet. VE-cad. Vascular-Endothelial cadherin. UV. Ultra-violet. μl. Microliter. 15.

(16) 第一章前言第一節. 導論(Introduction). 卵巢腫瘤按其 ? 織發生可分為三大類： ? 上皮性腫瘤 (epithelial tumor) ，如漿液腫瘤 (serous tumor)、黏液性腫瘤 (mucinous tumor)、子? ? 膜樣瘤(endometroid tumor)等，這些腫瘤的性質可分為良性 (benign) 、邊緣性 (borderline) 及惡性 (malignant)；? 性腺間質腫瘤(sex cord-stromal tumor)，如顆粒 ? 胞瘤 (granulose-cell tumor)、泡膜? 胞瘤 (thecoma)及纖? 瘤 (fibroma) 等； ? 生殖 ? 胞腫瘤 (germ-cell tumor) ，如畸胎瘤 (teratoma)、卵巢胚胎瘤(dysgeminoma)、? 胚瘤(endodermal sinus tumor)及胚胎性癌(embryonal carcinoma)等[Scully RE et al.1998; Chen VW et al.2003]。卵巢上皮性腫瘤是最常見的卵巢腫瘤，來源於卵巢表面的上皮細胞(ovarian surface epithelium; OSE)[Dubeau L.1999]，其中漿液性囊腺瘤為最常見的，其次為黏液性囊腺瘤。黏液性囊腺瘤主要來源也是 OSE，其生長速度很快，且體積可以長得很大，但 OSE 如何演變成黏液性囊腺瘤，至今還不清楚。回顧過去的文獻，有報告指出 OSE 化生成卵巢癌時，可能與鈣黏蛋白 (cadherin)[van der Linden PJ et al.1994; van der Linden PJ et al. 1995; Sundfeldt K et al.1997; Davies BR et al.1998; Wong 16.

(17) AST et al.1999] 或荷爾蒙調控制 [MacCalman CD et al.1994; MacCalman CD et al.1995; Shiohara S et al.1997]有關係。但到目前為止，尚無作者專門探討 OSE 與黏液性囊腺瘤之間的關係。. 17.

(18) 第二節卵巢黏液性囊腺瘤黏液性腫瘤相當常見，? 占所有卵巢腫瘤的15%，其中? 85% 為良性（黏液性囊腺瘤），邊緣性惡性者? 占6~10%，浸潤性癌（黏液性囊腺癌）? 為5~10%。黏液性囊腺瘤最常見於30~50歲[Scully RE et al.1998; Lee KR & Scully RE.2000]。多為單側，? 5~10%為雙側。腫瘤體積通常較大，大多數直徑為15~30ｃｍ，平均重量2000~4000 ｇ。腫瘤表面光滑，囊壁薄，透明或半透明。切面多為多房，囊? 液體為清澈或黃色、黏稠如膠凍(Fig.1) [Zaloudek C.1994; Russell P. 1994; Cotran RS et al.1994; Scully RE et al.1998]。這種腫瘤的 ? 容物為黏蛋白 (mucin) ，包括乙 ? 胺基葡萄糖（acetylglucosamine）及其他? 蛋白的碳水化合物的復合物，由於此種腫瘤囊腔? 容物以含有豐富的白蛋白與糖蛋白（屬黏多醣類;mucopolysaccharide）為特徵，故通稱為黏液性囊腺瘤[Nomrua K. 1995]。腫瘤壁為圓柱狀上皮，細胞漿內含有豐富的黏蛋白(Fig. 2)。覆盍腫瘤壁的腺體和囊腔的上皮與子? ? 膜或腸黏膜類似[Cotran RS.1994; Zaloudek C.1994]。目前多認為黏液性腫瘤起源於OSE的化生，但某些證據顯示黏液性腫瘤可含有其他苗勒氏型上皮如輸卵管型、子? ? 膜樣上皮 [Radisavljevic S.1976]。. 18.

(19) 卵巢黏液性囊腺瘤的臨床症狀主要是因腫瘤生長太快及太大所造成的壓迫症候群，治療以手術切除為主[Cotran RS.1994]。某些學者認為，本病發生似有遺傳? 向，如遺傳病中Peutz-Jeghers? 合徵候群是以皮膚黏膜色素沉著、胃腸道息肉為特徵，? 14%患者伴卵巢黏液性囊腺腫瘤，或為粒層? 胞瘤[Hizawa K et al.1993; Lee KR & Scully RE.2000]。也有部分學者發現卵巢黏液性腫瘤的病變可能與基因的轉變有關[Takeshima Y et al.2001]。. Fig.1 良性卵巢黏液性囊腺瘤腫瘤表面光滑、囊壁薄，呈透明或半透明。裡面常為多房，囊? 液體為清澈或黃色、黏稠如膠凍。. 19.

(20) Fig.2. 良性卵巢黏液性囊腺瘤腫瘤的病理組織，是呈柱狀上皮細胞，其核仁排列於基底部，細胞漿內可看到含有黏液的液泡。. 20.

(21) 第三節卵巢表面上皮細胞 (ovarian surface epithelium; OSE) 胚胎起源在妊娠十週至五個月左右，OSE 起源於胚胎生殖塉(gonadal ridge)的 Celomic 上皮細胞。結構 OSE 是一層簡單的上皮覆蓋在卵巢的表面上，它由一層鱗狀至長方形(squamous to cuboidal)的表皮細胞所組成(Fig. 3) [Nicosia SV et al.1991; Nicosia SV et al.1997]。OSE 擁有一般上皮細胞所擁有的 Keratin types 7、8、18、及 19，它與其它卵巢外間皮細胞 (extraovarian mesothelium ) 例如輸卵管表皮細胞、子宮內膜表皮細胞及子宮內頸上皮細胞等最大不同處是它沒有 CA-125 表現 [Jacobs I & Bast Jr RC.1989]，但卻擁有黏液素抗原(mucin antigen ) MUC1 、 17β-hydroxysteroid. dehydrogenase ，及纖毛. (cilia)[Blaustein A & Lee H.1979; Siemens CH & Auersperg N.1988; Auersperg N et al.1994; Nicosia SV et al.1997; Zhang S et al. 1998]。 OSE 細胞與細胞間的接合是透過簡單的胞橋小體(simple desmosomes)、incomplete tight junctions [Siemens CH & Auersperg N.1988; Nicosia SV et al.1997]、多種 integrins[Kruk PA et al.. 21.

(22) 1994;Cruet S et al.1999]及鈣粘蛋白[Sundfeldt K et al.1997; Davies BR et al.1998]的相互作用而達成。OSE 與卵巢基質(ovarian stroma) 之間被基底膜 (basement membrane) 及白膜 (tunica albuginea)所分隔[Gillet WR et al.1991]。因為 OSE 與基底膜的接觸很稀薄，所以 OSE 很容易從卵巢表面脫落，這也是 OSE 與其它表皮細胞不同之處。隨著年齡的增加及不斷的排卵，人類卵巢表面會變得不規則 (irregular contour) 及有很多由 OSE 所組成的裂逢 (OSE-lined clefts)及上皮包涵囊腫(inclusion cyst)，這些地方便是日後發生化生(metaplasia)及腫瘤變性(neoplastic progression) 的所在地[Deligisch L et al.1995; Scully RE.1995]。功能 OSE 主要負責卵巢與腹腔的物質交換，對於週期性的卵泡破裂及修補也扮演重要的角色[Nicosia SV et al.1988; Nicosia SV et al.1991]。OSE 含有溶脢體包涵體 (lysosome-like inclusions )及分解酵素脢(proteolytic enzymes)，這些物質在卵泡的破裂扮演重要的角色[Bjersing L & Cajander S.1975]。電子顯微鏡發現 OSE 細胞會在排卵前發生衰退及脫落，這種凋零現象(apoptosis)可能是被前列腺素 (prostaglandins)[Ackerman RC & Murdoch WJ.1993; Murdoch WJ.1995]及 Fas antigen[Quirk SM et al.1997; Baldwin RL. 22.

(23) et al.1999]誘導所至。透過上皮細胞及細胞外基質(extracellular matrix)的合成[Auersperg N et al.1994; Kruk PA et al.1994]，再加上細胞的收縮[Kruk PA & Auersperg N.1992]，OSE 可以修補排卵後卵巢表面的裂逢。除此外，老年性的卵巢萎縮及卵巢表面的 OSE-lined 裂逢及包涵體的形成，也是 OSE 的功能[Bjersing L & Cajander S.1975; Auersperg N et al.1994; Kruk PA et al.1994]。. OSE 的贅瘤病變 (Neoplastic progression) 卵巢上皮細胞癌(epithelial ovarian carcinomas )佔卵巢癌的 90%，其來源為 OSE。在正常的情況下，OSE 在排卵後修補的過程中，其表皮細胞在特定的物質如 epidermal growth factor ( EGF ) 、 transformation growth factor-β(TGF-β)等刺激下，會變換成基質(epithelial- mesenchymal conversion )[Trelstad RL et al. 1982; Berchuck A et al.1992; Davila RM & Crouch EC.1993; Toda S et al.1997]。當這個變換過程失敗時，這些 OSE 很可能會在卵巢上形成表皮細胞包涵體囊腫，在特定的物質如發炎反應 (inflammatory reaction)[Ness RB & Cottreau C.1999]、荷爾蒙 [Osterholzer H et al.1985; Nicosia SV & Nicosia RF.1988; Nicosia SV et al.1991]、及組織介素 ( IL-1 & IL- 6 )[Ziltener. 23.

(24) HJ et al.1993]等刺激下，這些 OSE 細胞可能會變成擁有密勒管表皮細胞特性(Mullerian-dust derived epithelium)的細胞，進一步發生化生，形成良性或惡性腫瘤(Fig.4)。. OSE 細胞的培養 (culture) 由於 OSE 是一單層細胞且生長力不強，以至分離及培養十分困難，使得從 OSE 細胞演變成卵巢腫瘤的發生機轉不明。1980 年代 Hamilton 等人[Hamilton TC et al.1980]發展出一套培養 OSE 的方法及系統，經過 Kruk 及 Auersperg 等人不斷改良[Kruk PA et al.1990; Auersperg N & Maines-Bandiera SL.2000]，目前對於 OSE 的培養已經很成熟，可用來研究它與卵巢腫瘤的關係。. Fig.3 顯微鏡下培養的卵巢表面上皮細胞. 24.

(25) Fig.4 表皮-間葉互變假說(Hypothesis of epithelio-mesenchymal conversion)：排卵時OSE細胞從卵巢表面上皮被推擠到基質形間葉細胞。如果這種互變機轉失敗，OSE細胞會形成表皮包涵囊腫，而這些地方便是日後容易發生贅瘤病變的所在地。 [From Endocrine Reviews 2001;22:255-288]. 25.

(26) 第四節鈣黏蛋白( Cadherins ) 概論鈣黏蛋白是一種穿膜醣蛋白(transmembrane glycoprotein)。在鈣離子存在的環境下(calcium dependent)，鈣黏蛋白以同質細胞親合的方式 (homophilic manner) ，使細胞與細胞黏附在一起 [Takeichi M.1991; Takeichi M.1995; Suzuki ST.1996; Petruzeli L et al.1999]。它在細胞形態的發生(cell morphogenesis)、細胞移動(cell motility)、組織重組(tissue remodeling)及傷口癒合 (wound healing)的過程中扮演重要的角色。如果鈣黏蛋白的表現失去原有的功能，會引起細胞的移動與增殖失控，進而導致腫瘤的形成及細胞生理功能的失調[Hirano S et al.1992; Ivanov DB et al. 2001]。一般來說，不同的鈣黏蛋白仍然擁有類似的初級結構(primary structure) 。其主要結構裡有三個部分：氮端的細胞外部份 (N-terminal extracellular domain)、細胞穿膜部份(transmembrane domain)、及碳端細胞質部份(C-terminal cytoplasmic domain)。鈣黏蛋白其胺基酸的保留性大約為 43~58%，最高保留性區域為碳端細胞質內部份，次高保留性區域為靠近氮端的細胞外部份。在氮端的細胞外部份有 3 到 5 組的約 110 個左右氨基酸的重覆序列，而鈣離子則. 26.

(27) 附著於這些重覆序列之間；膜細胞部份有 70 個氨基，而這個區域也是 cadherin 發揮功能最主要的部份[Blaschuk OW et al.1990; Nose A et al.1990; Ozawa M et al.1990]。不同的鈣黏蛋白其胺基酸重覆序列亦不同，同時也表現不同的特性及生理功能。我們可依主結構上的差異將鈣黏蛋白分成不同的類別，基本上可分成四大類：(一)典型鈣黏蛋白(classical cadherin)：其中包括 type 1 及 type 2 [Takeichi M.1991; Takeichi M.1995; Suzuki ST.1996; Petruzeli L et al.1999,] (二) Desmosomal cadherin (三) Protocadherins (四) Cadherin-related proteins：其中也包括了 truncated cadherin and unclassified family members [Ivanov DB et al.2001]。. 功能與分類 (一 ) 典型鈣黏蛋白典型鈣黏蛋白的結構如 Fig.5 及 Fig.6。主要由含有五個位於 N-terminal. 的. extracellular. domains(EC1–EC5) ，一組. transmembrane (TM)，及二組 cytoplasmic domains(CP-1 及 CP-2) 所構成。每一個 EC sub-domain 有一百一十個氨基酸，其中 EC 1 在同質接合辨識(homophilic recognition)的過程中扮演最重要的角. 27.

(28) 色，同時在EC1 的 C-terminal region 中有由三個氨基酸 His-Ala-Val (HAV)所組成的 cell adhesion recognition(CAR)sequence，藉由 CAR 相同的鈣黏蛋白彼此之間可以結合成拉? 狀(zipper–like)的構造 [Blaschuk OW et al.1990; Nose A et al.1990; Patel DJ & Gumbiner BM.1995; Shapiro L.1995]。位於細胞質部份的 cytoplasmic domain 是結合細胞骨骼的主要部分，cytoplasmic domain 中有一 serine rich region，這個區域先與 β-catenin 或 γ-catenin 及 p120cas 這些蛋白結合，之後再與 α-catenin 結合，進而與 actin microfilaments 形成一完整的細胞骨架，也就是 cadherin-catenin complex (Fig.7)[ Knudsen KA & Wheelock MJ.1992; Reynolds AB et al.1992; Kemler R.1993]。. 28.

(29) Tyrosine kinase receptor. P-Tyr. Cell adhesion recognition sequence HAV(typeI). Catenins γ. Ca a b N-terminal. EC!. EC2. Cell binding. Ca a b. Ca a EC3. α. β. b EC4. Microfilaments. EC5. TM. CP1. CP2. C-terminal. Catenin binding. Fig. 5 鈣黏蛋白的結構：主要由含有五個位於 N-terminal 的 extracellular domains (EC1–EC5)，一組 transmembrane (TM)，及二組 cytoplasmic domains(CP-1 及 CP-2)所構成。. 29.

(30) Fig.6 典型鈣黏蛋白的第二個細胞質 domain 含有相同的安基酸序列，而這些序列便是用來設計製造 degenerate primers。. 30.

(31) Fig.7 Cadherin-catenin complex：位於細胞質部份的 cytoplasmic domain 是結合細胞骨骼的主要部分，cytoplasmic domain 中有一 serine rich region ，這個區域先與 β-catenin 或 γ-catenin 及 p120cas 這些蛋白結合，之後再與 α-catenin 結合，進而與 actin microfilaments 形成一完整的細胞骨架，也就是 cadherin-catenin complex。. 31.

(32) Type 1 典型鈣黏蛋白包括 (N-cad). ，. Epithelial-cadherin(E-cad) ， Neural-cadherin Vascular-Endothelilal-cadherin(VE-cad). 及. Retinal-cadherin(R-cad)。Type 1 典型鈣黏蛋白其生物功能主要是促進細胞接合(homophililc cell adhesion)，在胚胎發育(embryonic development)中主導組織器官形成，並和細胞的移動、組織分化有關 [Takeichi M.1991; Takeichi M.1995; Gumbiner BM.1996]。在胚胎發育時，不同的鈣黏蛋白在適當的時間及地點的表現 (spatiotemporal expression)受到高度調控，引導不同組織的形成。例如：在鼠胚的研究中，morula stage 時 E-cad 有關鍵性的角色，在 blastomere stage 時，如果降低 E-cad 和 P-cad 則胚胎發育會被損壞。還有許多的研究顯示不同鈣黏蛋白引導不同組織發育，例如：N-cad 引導神經板的形成，在 mesemchymal cell 增加時，N-cad 也會增加[Hyfil F et al.1981; Takeichi M,1988; Kadokawa Y et al. 1989; Ivanov DB et al.2001]。這些現象，都顯示著鈣黏蛋白在組織器官形成中重要的地位。鈣黏蛋白在維持細胞的極性有重要的地位 [McNeill H et al.1990; Drubin DG & Nelson WJ.1996]，例如：表皮細胞的 E-cad 功能不良(dysfunction)時，會使細胞失去表皮細胞的表現型(phyenotype)及 enhancement of motility 和 removal of. 32.

(33) contact suppression of growth，最後造成細胞增生失去控制及造成腫瘤的侵犯性[Birchmeier W & Behrens J.1994; Blaschuk OW et al.1994] 。有許多研究指出鈣黏蛋白與腫瘤發生有密切的關係，例如：E-cad 降低與肺癌、食道癌、直腸癌、膀胱癌、前列腺癌、皮膚癌、乳癌、子宮頸癌有關，N-cad 與神經外胚層及中胚層腫瘤有關，例如：乳癌、星狀細胞瘤，而 P-cad 則與肺癌、黑色素瘤及乳癌有關 [Van AJ et al.1993; Bringuier PP et al.1993; Risinger JI et al.1994; Bohm M et al.1994; Kadowaki T et al.1994; Pizarro A et al.1994; Takayama T et al.1994; Yasui W et al.1995; Shinoura N et al. 1995; Dorkin TJ et al.1997; Nieman MT et al.1999; Soler AP et al.1999; Zarka TA et al.2003] 。. Type2 典型鈣黏蛋白包括人類 cadherin-5、-6、-8、-9、-11、-12、-14 [Tanihara H et al.1994]及其他動物鈣粘蛋白如 rodent[Koremastsu K & Redies C.1997] 、 chicken[Nakagawa S & Takeichi M.1995] 及 Xenopus [Espeseth A et al.1995]。Type2 典型鈣黏蛋白與 Type1 典型鈣黏蛋白的結構類似，只是在靠近 N 端的細胞外部分不含有 HAV 的 sequence。Type 2 典型鈣黏蛋白其生物功能與 type 1 典型鈣黏蛋白. 33.

(34) 類似，和細胞接合及組織形成 (morphogenesis) 及腫瘤的形成 (tumorigenesis)有關。例如以往的報告顯示，cadherin-6 與人類及鼠類(rodent)腎臟的發育有關[Xiang YY et al.1994]，與腎臟癌的形成有關[Shimyama Y et al.1995]。Cadherin-11 則與鼠類(rodent) 骨頭的形成[Okazaki M et al.1994]及中樞神經的發育有關[Kimura Y et al.1995]，而且 cadherin-11 可能與 trophoblast cell 及胎盤的形成有關[MacCalman CD et al.1996]。另外 cadherin-11 也與子? 內膜基質細胞的分化有關[MacCalman CD et al.1996; Chen GT et al. 1999]。. Desmosomal Cadherin 包括 desmocollin(Dscs 1、2、3)及 desmoglein(Dsgs 1、2、3 )，它和典型鈣黏蛋白最主要的差別在 cytoplasmic domain 的部分， desmosome 不是與 catenin 接合，而是與 plakoglobin、desmoplakin 及 plakophillins 結合[Shapiro L.1995]。Desmosome 可以對抗外界機械性的壓力，保持細胞的完整性，它位於皮膚等組織，如果受到傷害便有可能產生病變，例如天? 瘡[Schwarz MA.1990]。. 34.

(35) Protocadherins 包括 Pcdh-1、-2、-3、-8、-9，其結構與典型鈣黏蛋白類似，但細胞外的 cadherin-repeats sequence 超過五組，且 cytoplasmic domain 不與 catenins 相接合，Protocadherins 可存在於非脊椎動物(invertebrates)中，與胚胎腦部及中樞神經的發育有關[Sago H et al.1995]。. Cadherin-related proteins 包括了 T-cad (cadherin-13)、H-cad 及 L-cad，此群 cadherin 缺少細胞外的部分，至於 truncated cadherin 的功能，至目前為止並不十分確定，可能和一些癌症有關，例如：皮膚癌[Takeuchi T et al.2002]與卵巢癌[Kawakami M et al.1999]。. 鈣黏蛋白與 OSE及卵巢腫瘤的關係人類生殖道上皮組織中，正常卵巢表面上皮細胞比較特別，它不表現 E-cad，細胞與細胞的接合主要由 N-cad 維持[Peralta SA et al.1995; Gulati R & Peluso JJ.1997; Wong AST et al.1999]，而 N-cad 是中胚層組織接合的主要物質。其他如輸卵管上皮、子宮內膜上皮及子宮內頸上皮細胞則表現很強的 E-cad，顯然接合主要由. 35.

(36) E-cad 負責[van der Linden PJ et al.1995]。E-cad 只表現在 OSE 的柱狀化細胞 (columnar-shape eputhelium)及 inclusion cyst 處，這些地方容易發生組織化生 (metaplasia) [Sundfeldt K et al.1997; Maines-Bandiera SL & Auersperg N.1997; Davies BR et al.1998; Wong AST et al.1999]。Wong 等人也指出 N-cad 出現在正常及化生(metaplastic)的 OSE 上，而 P-cad 卻兩者都沒有表現，至於 E-cad 的出現即暗示這些上皮細胞會有組織化生及腫瘤轉化的傾向[Wong AST et al 1999]。Marrs 及 Ong 等人也發現，E-cad 不但是密勒管上皮(Mullerian epithelium)組織轉化的標記，也會誘導密勒管上皮的化生[Marrs JA & Nelson WJ.1996; Ong A et al.2000]。又有研究顯示 P-cad 會存在於密勒管上皮的組織及卵巢癌的細胞中，卻不存在於正常的 OSE，因此當 OSE 出現 P-cad 的表現時，可能暗示這些細胞有病變的傾向[van der Linden PJ et al. 1994; van der Linden PJ et al.1995; Wong AST et al.1999]。大部分的文獻都顯示 E-cad 在良性或惡性卵巢上皮性腫瘤 (epithelial ovarian tumors)的表現都比正常的 OSE 強[Sundfeldt K et al.1997; Davies BR et al.1998; Wong AST et al.1999]，但是分化愈差、分期愈後的卵巢癌，其 E-cad 的表現反而愈弱[Davies BR et al.1998; Fujioka T et al, 2001; Patel IS et al.2003]。Fujioka. 36.

(37) 等人也發現 E-cad 的表現，在卵巢癌腹腔轉移 (peritoneal metastasis)的病灶中比原發性病灶弱，而 beta-catenin 卻相反 [Fujioka T et al.2001]。Darai 等人指出，E-cad 在良性上皮性卵巢腫瘤的表現較強，在邊緣性及惡性腫瘤中表現較弱，甚至部分沒有被偵察到[Darai E et al. 1997]。仔細分析以前的文獻可以發現其中研究結果的差異在於有些研究沒有把卵巢癌的分化等級分開研究所致。歸納文獻可以說：正常 OSE 不表現 E-cad，當分化成良性上皮性卵巢腫瘤則表現很強的 E-cad，一旦又變成邊緣性腫瘤或分化良好 (well-differentiated)的惡性上皮性卵巢腫瘤則 E-cad 表現又變弱，如果變成分化不良 (poor-differentiated)的惡性上皮性卵巢腫瘤則不會表現 E-cad。因此，研究卵巢癌必須把分化良好和分化不良的檢體分開研究。至於 N-cad 表現，在良性及邊緣性腫瘤大部分為陽性，在惡性腫瘤中卻沒有被偵測到[Darai E et al. 1997]。對於鈣黏蛋白與卵巢黏液性腫瘤的研究，到目前為止文獻上極少出現，只有 Peralta 等人發現漿液性腫瘤及子宮內膜樣腫瘤同時有 E-cad 及 N-cad 的表現；而黏液性腫瘤只有很強的 E-cad 表現，卻沒有 N-cad 表現[Peralta SA et al.1997]。. 37.

(38) 鈣黏蛋白與生殖腺類固醇 (gonadal steroids)的關係回顧過往的文獻，我們可以發現生殖腺類固醇是調節鈣黏蛋白表現的重要因子。MacCalman等人證實雌脂二醇(17 β-estradiol) 及黃體酮 (progesterone)可增加發育中的老鼠子宮 E-cad訊息 RNA (messenger RNA)的濃度[MacCalman CD et al.1996]，對於發育中老鼠的卵巢，只有在雌脂二醇的刺激下，E-cad及N-cad的訊息RNA表現才會增加 [MacCalman CD et al.1994; MaCalman CD & Blaschuk OW.1994; MacCalman CD et al.1995]；對於老鼠Sertoli cells中 N-cad訊息RNA的表現,他們也證實雌激素(estrogen)可加強卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone)的作用[MacCalman CD et al. 1997]。Chen等人在1998及1999年的論文中指出，黃體酮可以調控人類子宮內膜基質細胞cad-11的表現，在雌脂二醇的共同作用下，黃體酮對子宮內膜基質細胞的刺激作用有加成的效果[Chen GT et al. 1998; Chen GT et al.1999]。除此外，Chen等人也證實抗類固醇物質例如antiprogestin RU486及antiestrogen ICI 182，780等藥物，會降低人類子宮內膜基質細胞cad-11的表現[Chen GT et al. 1999]。. 38.

(39) 第五節生殖腺類固醇接受體 (gonadal steroid receptor) 類固醇接受體的結構及作用模式雌激素接受體 (estrogen receptor; ER) 、雄激素接受體 (androgen receptor; AR)及黃體酮接受體(progesterone receptor; PR)都)，他們之間的差異是在於 ER-a 的 Leu338 被 Met384 取代變成 ER-β[Gustafsson JA.1999]。類固醇荷爾蒙先滲透過漿膜(plasma membrane)進入細胞漿(cytoplasm)，與類固醇接受體結合屬於類固醇接受體 (steroid receptor) ，是一種細胞核接受體 (nuclear receptor)[Mangelsdorf DJ et al.1995]，雌激素接受體又分成 estrogen receptor alpha(ER-a)及 estrogen receptor beta(ER-β 後，使類固醇接受體從 non-DNA-binding 變成 DNA-binding 的形態 (receptor transformation)，再滲透入細胞核，啟動特定基因，促進特定蛋色質合成，造成特定生理反應(Fig.8)。類固醇接受體的結構最主要由五部分所組成 (Fig.9)。第一部分為可變性的 N 端 ( variable N-terminal)；第二部分為高度保存的 DNA-binding domain；第三部分為可變性的鉸鏈部分(variable hinge region)；第四部分為高度保存的配體結合部份(ligand-binding domain)；第五部分為可變性的 C 端(variable C-terminal)。不同的接受體會與. 39.

(40) 不同的配體結合，然後透過 DNA-binding domain 結合到特定基因上，再啟動訊息 RNA 的轉錄，進而促使蛋白質的合成[Mangelsdorf DJ et al.1995; Nancy L & Weigel.1996]。. Fig. 8 類固醇荷爾蒙先滲透過漿膜 (plasma membrane) 進入細胞漿 (cytoplasm)，與類固醇接受體結合後，使類固醇接受體從 non-DNA-binding 變成 DNA-binding 的形態 (receptor transformation)，再滲透入細胞核，啟動特定基因，促進特定蛋色質合成，造成特定生理反應。. 40.

(41) Fig.9 類固醇接受體的結構：最主要由五部分所組成，第一部分為可變性的N端(variable N-terminal)；第二部分為高度保存的 DNA-binding domain ；第三部分為可變性的鉸鏈部分 (variable hinge region)；第四部分為高度保存的配體結合部份 (ligand-binding domain)；第五部分為可變性的C端 (variable C-terminal)。. 41.

(42) 生殖腺類固醇與 OSE及上皮性卵巢腫瘤的關係人類 OSE 是一個對類固醇荷爾蒙有反應的組織(an steroid responsive tissue)[Bai W et al.2000; Edmondson RJ et al. 2002]，OSE 細胞的增生(proliferation)、凋零(apotosis)及化生 (metaplasia)與生殖腺腺荷爾蒙有密切的關係。流行病學的資料顯示，內生性及外生性生殖腺荷爾蒙對卵巢腫瘤及卵巢癌的發生扮演重要角色[Roa BR & Slotman BS.1991; Clinton GM & Hua W.1997]，而這些荷爾蒙的作用是透過類固醇接受體而達成 (receptor mediated steroid hormones responsiveness) [Karlan BY et al.1995]。例如停經前服用含雌激素的避孕藥會低卵巢癌發生的機會, 而停經後採用單雌激素荷爾蒙療法卻會增加卵巢癌發生機會[Joly DJ et al.1974; Casagrande JT et al.1979; McGowan L et al. 1979]。Edmondson 等人發現人類 OSE 在雄激素的刺激下，細胞會明顯的增生(proliferation)，而細胞凋零的現象卻減少，因此推論雄激素在 OSE 轉變成腫瘤或癌症的過程中扮演重要的角色[Edmondson RJ et al.2002]。Bai 等人的文章中指出，OSE 在雌激素的刺激下，會發生細胞增生，與上皮性卵巢癌發生有密切閱關係[Bai W. et. al.2000]。Hamilton 及 Ho 等人也分別指出雌激素可能會造成 OSE 的 neoplastic transformation，而黃體酮卻會誘發 OSE 及上皮性卵巢. 42.

(43) 癌細胞的凋零[Hamilton TC.1999; Ho SM.2003]。除此之外，目前有些研究也發現卵巢癌病人血液中的雌激素，黃體酮及雄激素濃度與腫瘤體質的大小成正比[Mahlck CG et al.1986; Mahlck CG et al.1988; Mahkck CG et al.1990]。. 生殖腺類固醇接受體與 OSE 及上皮性卵巢腫瘤的關係 Lau等人的研究發現人類OSE細胞同時擁有雌激素接受體、雄激素接受體及黃體酮接受體[Lau KM et al.1999]。Scambia等人回顧很多文獻後發現原發性卵巢癌病人的卵巢上皮細胞，其雌激素接受體陽性為53%，黃體酮接受體陽性為47%，而雄激素接受體陽性為>80% [Scambia G et al.1998]。目前大部分的研究顯示，雌激素接受體及雄激素接受體在卵巢癌表面上皮細胞的表現比正常的OSE高；至於黃體酮接受體的表現，卵巢癌比正常 OSE 偏低，但無統計意義 [Bergqvist A et al.1981; Vierikko P et al.1983; Willcocks D et al.1983; Lantta.1984; Toppila M et al.1986; Anderl P et al.1988; Edmondson RJ et al.2002]。大部分的研究發現雌激素接受體及黃體酮接受體的表現與卵巢癌的分化程度，疾病的分期沒有顯著的關係 [Kauppila A et al.1983; Gronroos M et al.1984; Iversen OE et al.1986; Anderl P et al.1988; Bizzi A et al.1988; Masood S et. 43.

(44) al.1989; Rose P et al.1990; Slotman BJ et al.1990]；對於疾病的預後，大部分的文獻顯示與雌激素接受體的表現沒有太大的關 [Masood S et al.1989; Harding M et al.1990; Rose P et al.1990; Sevelda P et al.1990; Slotman BJ et al.1990; Scambia G et al. 1995]，但黃體酮接受體的表現越強，疾病的預後可能會越好[Iversen OE et al.1986; Harding M et al.1990, Sevelda P et al.1990; Slotman BJ et al.1990; Kommoss F et al.1992]。Iversen及Bizzi 等人分別指出當雌激素接受體及黃體酮接受體同時存在時，卵巢癌的預後遠比兩者同時缺失好[Iversen OE et al.1986; Bizzi A et al. 1988]。除此外，部分作者發現類固醇接受體的表現可能與卵巢腫瘤的組織構造有關，例如子宮內膜類及漿液細胞卵巢腫瘤會有較強的雌激素接受體或黃體酮接受體的表現[Quinn MA et al.1982; Ford LC et al.1983; Kauppila A et al.1983; Sutton GP et al.1986; Toppila M et al.1986; Rose P et al.1990]，而這些接受體在卵巢黏液細胞惡性腫瘤的表現卻不明顯[Gronroos M et al.1984; Scambia G et al.1995;. Toppila M et al.1986]。. 總括而言，生殖腺類固醇荷爾蒙及其接受體在卵巢腫瘤的致病機轉中扮演重要的角色。但在臨床上，要利用這些研究結果去評估疾病的預後及治療效果還不太成熟，尚需更多的實驗作印證。. 44.

(45) 第六節研究假說與研究架構研究假說: 卵巢黏液性囊腺瘤雖然是一種良性腫瘤，但其生長速度很快，且體積可以長得很大。一般認為卵巢黏液性囊腺瘤的主要來源為 OSE，如何從單層的上皮細胞快速演變成巨大的囊瘤，其機轉到目前為止還不清楚，回顧過往的文獻，我們可以發現 OSE 化生成卵巢腫瘤或卵巢癌時，可能與生殖腺荷爾蒙調的控制、特定的生殖腺類固醇接受體及鈣黏蛋白的表現有關係。但到目前為止，極少文獻探討 OSE 與黏液性囊腺瘤之間的關係，基於這個原因，本研究選擇鈣黏蛋白及生殖腺類固醇接受體作為研究目標，希望找出卵巢黏液性囊腺瘤細胞中典型鈣黏蛋白及生殖腺類固醇接受體的種類，再比較卵巢黏液性囊腺瘤與 OSE 間典型鈣黏蛋白及生殖腺類固醇接受體的表現差異，以便瞭解卵巢黏液性囊腺瘤形成的機轉。研究架構 : 本研究分為三個階段，第一階段是利用 degenerate reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)的方法找出卵巢黏液性囊腺瘤細胞中典型鈣黏蛋白的種類。第二階段以 semi-quantitative RT-PCR 的方法比較卵巢黏液性囊腺瘤與 OSE 間各種典型鈣黏蛋白的表現差異。第三階段再以 semi-quantitative RT-PCR 的方法比較卵巢黏液性囊腺瘤與 OSE 間各種生殖腺類固醇接受體的表現差異。. 45.

(46) 第二章研究材料與研究方法. 第一節鑑定人類卵巢黏液性囊腺瘤的典型鈣黏蛋白 (Identification of classical cadherin. subtypes. expressed. in. ovarian mucinous cystadenoma). Part A. 材料 (Materials) 實驗的檢體取自本院(中國醫藥大學附設醫院)接受卵巢黏液性囊腺瘤切除手術的病人(3 位)，組織檢體取自囊腫中隔壁，以液態氮急速冷凍保存。. Part B. 方法 (Methods). (1) RNA 的萃取 (RNA extraction) A. 儀器 (Machine) 1.Source capture system ( Germfree Laboraties) 2.Centrifuges 5810R ( Germany ) 3.Microcentrifuge ( Uover Laboratories, USA). 46.

(47) 4.Sectrafuge 16M ( National LAbnet, USA) 5.TM firestek B206(Firstek Scientific ) 6.Minigel Migration Trough Mupid-2(Cosmo Bio Co LTD, USA) 7.Rocker platform ( Bellco Biotechnology, USA) 8.UV box TFX20M ( Vukber Lourmat, France) 9.DS34 Polaroid Electrophrosis hood ( UK). B 試劑 (Reagents) 1.Trizol. Reagent. (. Life. technologies,. Inc.,. Gainthersburg, MD) 2.1X TBE Buffer 3.2% Agarose 4.Chloroform 5.Isopropanal 6.Ethyl alcohol 7.Diethyl Pyrocarbonate 8.Ethidium bromide ( 10mg/ml). 47.

(48) C 步驟 (Procedure) ↓首先將取得的組織(剪碎)與 1ml 的 Trizol reagent 混合之後，接著磨碎。 ↓在 4℃下，以 8000rmp 離心 1 分鐘後，取出我們所需的上清液。 ↓加入 0.2ml chloroform 均勻混合，在室溫靜置下 5 分鐘後，接著在 4℃下，以 12000rpm 離心 15 分鐘，取出上清液(含 RNA)。 ↓加 0.5ml cold isopropanol 於上清液中均勻的混合，接著於室溫下靜置 10 分鐘後。 ↓在 4 ℃下，以 13000rpm 離心 8 分鐘之後，留下沈澱物。 ↓加 1ml 之 100% alcohol 於沈澱物中，均勻混合。 ↓接著以 4℃、13000rpm 離心 5 分鐘，去除上清液，室溫靜置 5 分鐘(避免沈澱物過度乾燥)。 ↓加入 40μl RNAse and DNAse free 之 sterile water，接著以 58℃加熱 10 分鐘使沈澱物溶解。 ↓將所得的 RNA product run diagnostic gel，確認我們的 RNA。 ↓置於負 80℃的冰箱中保存。. 48.

(49) (2) 反轉錄 (Reverse transcription) A. 儀器 ( Machine) 1. TM firestek HB-100 ( Fiestek Scientific ) 2. TM firestek B206 ( Firestk Scientific ). B. 試劑 (Reagent) 1 Random primer ( Promegma, Madison, WI, USA ) 2. Oligo- dT primer ( Promegma) 3. M-MLVRTase ( Moloney murine leukemia virus ) ( Promegma) 4. 0.1 M DDT( Dithiotheatol) 5. dNTP ( Protech ) 6. RNAsin ( Invitrogen) 7. MMLV RT buffer. 49.

(50) C.步驟 (Procedure) ↓將約 5μg 之 total RNA 加 RNAse and DNAse free water 至 23μl。 ↓ 接著加入 2μl 濃度為 0.5μg 的 random primer and 0.5μ oligo-dT primer 至總量 25.5μl，以 70℃加熱 5 分鐘後，置於冰上 2 分鐘，接著短暫離心。 ↓加入 8μl MMLV RT buffer，2μl MMLV RTase，2μl 0.1M DDT， 2μl dNTP， 0.5μl RNAsin，至總量 40μl 之後，於 37℃放 2 小時，再於 94℃加熱 5 分鐘，置於-70℃ 冰箱中保存。. (3) Degenerate-PCR (Polymerase chain reaction using degenerate primers ) A.儀器 (Machine) 1. PCR system 2400 ( Perkin Ellmer, USA) 2. Minigel Migration Throgh Mupid–( Cosmo Bio CO LTD, USA) 3. Rocker platform ( BE11PL 4. UV box TFX 20M (Vukber Lourmat, FRANCE ) 5. DS34d Polarioid Electroporesis hood (UK). 50.

(51) B. 試劑 ( Reagent) 1. 10X PCR buffer 2. 2.5mMdNTP 3. MgCl2 4. 20μM cadherin degenerate forward primer 5. 20μM cadherin degenerate reverse primer 6. Taq polymerase. C. 步驟 ( Procedure ) ↓2-4μl cDNA. 加入 dd water 至總 35μl。. ↓接著加入 5μl 的 10XPCR buffer，5μl 的 2.5μl dNTP ，2μl 的 MgCl2 ， 1μl 的 20μM reverse primer ， 1μl 的 Taq polymerase 至總量 50μl。 ↓接著進行 PCR，而 PCR 溫度的條件足 95?C hold 5 min，接著 95?C 1.5 min、45?C 2 min、72?C 3 min ，run 35 cycles ，接著是 72?C 8 min。 ↓將 PCR product 植入 PCR- II vector。. 51.

(52) Forward : GAATTCACNGCNCCNCCNTAYAYGA Reverse:. GAATTCTCNGCNARYTTYTTRAAR. R= either A or G,. Y= either C or T,. N= either A, C, G, or T. Table 1. Degenerate primers of classical cadherin. (4). Cloning. A.儀器 (Machine) 1. Microcentrifuge tube 2. Thermocycler 3. Water bath 4. Oribital shaking incubator OS1502. B. 試劑 (Reagent) 1. Luri-Bertain ( LB ) medium and agar 2. DMF ( Dimethylformamide ) 3. X-Gal in DMF (40mg/ml 5-bromo-4chloro-3. 52.

(53) indolyd-β-galactoside ) 4. Ampicillin stock ( 50 mg/ml) 5. IPTG ( 100mM isopropyl-β-D-thiogalactoside 6. Ligation buffer 7. One shot competent cell Kit ( TOP 10F’ cells ) 8. TA cloning Kit ( Invitrogen, San Diego, CA ). C. 步驟 ( Procedure ) 1. Ligation (clone into PCR II Vector) ↓ 將 1 vial 的 PCR II vector(Fig.10)簡單離心。 ↓ 將先前 RT-PCR 之 PCR products 加上 1μl 之 10X ligation buffer 和 2 μl 的 PCR II vector II 。 ↓加入 sterile water和 T4 DNA ligase 1μl至總量 10μl。 ↓ 於置 14℃ water bath for overnight 。 2. Transformation ↓將先前已被 PCR product clone 的 PCR–II vector 簡短離心之後，置於冰上。 ↓ 加入 2 μl TOPO cloning reaction 至 competent cells，將它們輕輕的混合之後，置於冰上 30 分鐘。 53.

(54) ↓接著於置於 42℃水槽 30 秒，之後置於冰上。 ↓ 於室溫下加入 250μl SOC medium，在以 37℃ shaking incubator 以 225 rpm 平行搖晃 1 小時。 ↓取 50μl 及 200μl 之 solution 分別塗於含有 X-Gal 及 50μg/ml Ampicillin 之 LB agar plates 上。 ↓等乾之後，將 plate 巔倒於 37℃ 的 incubator 18 小時，之後置於 4℃ 冰箱。. 3. Bacterial growth ↓挑出至少 30 白色菌落，分別將他們放到 30 管 2c.c. LB medium (內含 50μ g/ml ampicillin)，在 400rpm 搖， overnight 之後做 plasmid DNA 分析。. 54.

(55) Fig.10. PCR-II Vector. 55.

(56) (5) Plasmid DNA extraction and DNA sequence. A.儀器 ( Machine ) Microcentrifuge. B.試劑 ( Reagent ) 1. Gene-spin Miniprep Purification Kit (Beckman CEQ2000.AB1377,LICORIR², Pharmcia A.L.F) (solution I,Solution II, Wash Solution ) 2.Restriction enzyme 10X buffer H (900mM Trisk-HCL, 500mM NaCl, 100mM MgCl2 ) 3.EcoRI Enzyme sotorage buffer ( 10mM Tris-HCL, 400mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1ml Triton X-100, 1 mM DTT, 0.15% Triton X-100, 0.5mg/ml BSA, 50% glycerol. 56.

(57) C.步驟 (Procedure) 1. Plasmid DNA extraction ↓ 取 1ml 的 bacterial media，以 13000rpm 離心 30-60 秒之後，取 pellet。 ↓ 接著加入 200μl Solution，Vortex 5-6 次使細胞溶解。 ↓ 之後加入 200μl Solution，Vortex 5-6 次。 ↓ 加入 200μl Solution，Vortex 5-6 次。 ↓ 13000rpm 離心 5 分鐘。 ↓ 將 spin column 放入 collection tube，接著將上清液小心放入 spin column。 ↓ 離心 30 秒之後，將 spin column 移出 collection tube。 ↓ 將過濾液丟棄，加入 500μl 的 washing solution。 ↓ 離心 60 秒之後，丟棄過濾液，再度離心 3 分鐘,去除殘餘的 ethanol。 ↓ spin column 放入新的 1.5ml eppendorff 中，加入 65°C 的 50μl H2O。 ↓ 離心 1 分鐘，以分離出 DNA， (如果重覆最後兩個步驟就可多得 10-15%的 DNA). 57.

(58) 2.DNA 定序 ↓ 取 5μ l 的 plasmid DNA，加 0.5μ l 的 EcoRI restriction enzyme 和 1μl 的 buffer。 ↓ 接著加 3.5μ l 的 acetylated BSA ( sterile dd water )，使總量為 10μl。 ↓ 於 37?C 下放置 1 小時。 ↓ 將所得的產物以電泳分析是否有約 170bp 的典型鈣黏蛋白，如果有的話，接下去做 sequencing。 ↓ 首先 prepare reaction solution。 ↓ 加入 4μ l big dye，1ul plasmid DNA，2μ l M-13 primer 以入 3μl 的 DW，總共 10μl。 ↓ 然後將 Gene Amp 上的 cycle 設定，分別是 96?C 1 分 30 秒，以及 96?C 10 秒，50?C 5 秒，60 ?C 4 分共 25cycles，4?C 7 分鐘。 ↓ 上面的 products 加入 10μ l sequence reaction solution， 10μ l H20，60μl 100% 的 Isopropanel，之後 vertex briefly ↓ 室溫下靜置 25 分鐘。 ↓ 用最大速度離心 30 分鐘之後，去除上清液。 ↓ 以 75% isopropanol 250μl rinse，vertex briefly。. 58.

(59) ↓ 離心 5 分鐘，接著同樣去除上清液。 ↓ air dry，stock at -20?C，接著將 samples loading 到 gel。 ↓ 接著以 automated DNA sequencer 來分析 DNA sequence。 ↓ 再利用 BLAST computer program 與 Genebank/EMBL 的資料庫與我們得到的 DNA sequences 做比對，以確認我們得到的典型 Cadherin subtypes。. 59.

(60) 第二節比較典型鈣黏蛋白在卵巢黏液性囊腺瘤與正常卵巢表面上皮細胞中 mRNA 濃度的表現差異. Part A.材料 (Materials) 實驗的檢體取自本院(中國醫藥大學附設醫院)接受卵巢黏液性囊腺瘤切除手術的病人(3 位)，組織檢體取自囊腫中隔壁，以液態氮急速冷凍保存。正常卵巢表面上皮細胞則取自 3 例 45 歲以上無卵巢癌家族史，因良性子宮肌瘤(Myoma)或子宮腺肌症瘤(Adenomyosis) 施行子宮切除合併單側或雙側預防性卵巢切除手術之正常卵巢表皮，以無菌刷子將卵巢表面的上皮細胞刷下來，直接抖入培養基中再到入培養皿，然後移入細胞培養箱培養。在第一部分的實驗中,我們已知在卵巢黏液性囊腺瘤中有哪一些典型鈣黏蛋白存在，以相同的檢體，接著我們要比較這些典型鈣黏蛋白在正常卵巢表面上皮細胞及黏液性囊腺瘤的 mRNA 濃度的表現差異。. 60.

(61) Part B. 方法 (Methods) (1). 培養 OSE 細胞 ↓ 組織取自因良性子宮肌瘤施行子宮切除合併單側或雙側預防性卵巢切除手術之正常卵巢表皮。 ↓ 以無菌刷子將卵巢表面的上皮細胞刷下來，直接抖入培養基中[培養基: medium199 - MCDB105 (1:1) (Sigma, St. Louis,MO)加 15% FBS、100μg/ml 的 penicillin streptomycin 及 2.5μg/ml Fungizone]。 ↓ 再到入培養皿，然後移入細胞培養箱培養，直到細胞產生匯合現象(confluence)。 ↓ 接著以 0.06% trypsin(1:250)及 0.01% EDTA 將細胞分離。 ↓ 再以 1:3 的比例分盤繼續培養大約 48 小時後，作 mRNA 萃取。. 61.

(62) (2) RNA 的萃取及定量 (儀器和試劑與第一節 part B 相同 ). 步驟 (Procedure) ↓ 取 2μl RNA，加入 3μl dd water 及 5μl RNA denatute buffer。 ↓ 在 58℃下加熱 15 分鐘。 ↓ 接著放置在冰上 2 分鐘。 ↓ 短暫離心之後，加入 2μl 的 RNA loading buffer。 ↓ 跑膠。 ↓ 將膠放在 EBTBA 內染色 30 分鐘。 ↓ 接著取出膠，在 UV box 照相，評估 RNA 的相對含量。. (3). RT (儀器、試劑和步驟與第一節 part B 相同). 62.

(63) (4). PCR 儀器、試劑和步驟與一節 partB 相同，其中要特別注意的是，因為要比較 mRNA 的量，所以要求出每個鈣黏蛋白適當的 cycle 數。步驟 (Procedure) ↓ 首先以 PCR 的方式得到的 GAPDH ( house keeping gene )， run 不同的 cycle 數，會得到一直線，取其中間值為我們要的 cycle 數，GAPDH 是 22(Fig.19)。 ↓ 同樣的方法算出各種典型鈣黏蛋白適當的 cycle ( Fig.20– Fig.25)。 ↓ 算出卵巢黏液性囊腺瘤及卵巢表皮上面所需的 mRNA 量。 ↓ 接著以六種典型鈣黏蛋白的 primer(Table 2)製造 cadherin products。 ↓ 將所得的 cadherin products 以電泳分析及評估 DNA 的量。. 63.

(64) ** DNA 產物之定量 ** ↓ 加入 2μl DNA loading buffer。 ↓ 跑膠。 ↓ 將膠放在 EBTBA 內染色 30 分鐘。 ↓ 接著取出膠，在 UV box 照相，評估 DNA 的相對含量。 ↓ 定量是藉由 Hewlett Packer Digital scanner 將 cadherin products 相片掃描至電腦之後，以 UN-SCAN-IT Gel Version 5.1 system ( Silk Scientific, Orm, Utah ) 來分析，求得 cadherin/GAPDH mRNA 的比值。. 64.

(65) Gene. primer. sequence. E-cad. Forward 5’-CACCTTCAGCCAACCTGTTT -3’. size 361bp. Reverse 5’-CACCTTCAGCCAACCTGTTT -3’ P-cad. Forward 5’-GACCAACGAGGCCCCTTTTGTGCTG-3’ 357bp Reverse 5’-GTGGTGGGAGGGCTTCCATTGTCCA-3’. N-cad. Forward 5’-GTGCCATTAGCCAAGGGAATTCAGC-3’ 373bp Reverse 5’GCGTTCCTGTTCCAC6TCATAGGAGG-3’. R-cad. Forward 5’-TCCAGATGTCCTTCCAGTCC-3’. 291bp. Reverse 5’-GTAGAGGGACTCACGGTCCA-3’ Cad-6. Forward 5’-TTCTTGCTGCTCTTTTGGGT-3’. 275bp. Reverse 5’-CCTGCTCCATCTCCTGAAAG-3’ Cad-11 Forward 5’-ACCAGATGTCTGTGTCAGA-3’. 742bp. Reverse 5’-GTCATCCTTGTCATCTGCA-3’. Table 2. Primers for RT-PCR. 65.

(66) 第三節比較生殖腺類固醇接受體 (雌激素接體、雄激素接受體及黃體酮接受體)在卵巢黏液性囊腺瘤與正常卵巢表面上皮中 mRNA 濃度的表現差異 Part A. 材料實驗的檢體取自本院(中國醫藥大學附設醫院)接受卵巢黏液性囊腺瘤切除手術的病人(3 位)，組織檢體取自囊腫中隔壁，以液態氮急速冷凍保存。正常卵巢表面上皮細胞則取自 3 例 45 歲以上因良性子宮肌瘤(Myoma)或子宮腺肌症瘤(Adenomyosis)施行子宮切除合併單側或雙側預防性卵巢切除手術之正常卵巢表皮，以無菌刷子將卵巢表面的上皮細胞刷下來，直接抖入培養基中再到入培養皿，然後移入細胞培養箱培養。. Part B. 方法 (1) RNA 的萃取及定量 (儀器和試劑與第二節 Part B 相同). 步驟 (Procedure) ↓ 取 2μl RNA，加入 3μl dd water 及 5μl RNA denatute. 66.

(67) buffer。 ↓ 在 58℃下加熱 15 分鐘。 ↓ 接著放置在冰上 2 分鐘。 ↓ 短暫離心之後，加入 2μl 的 RNA loading buffer。 ↓ 跑膠。 ↓ 將膠放在 EBTBA 內染色 30 分鐘。 ↓ 接著取出膠，在 UV box 照相，評估 RNA 的相對含量。. (2). RT (儀器、試劑和步驟與第二節 Part B 相同). (3) PCR 儀器、試劑和步驟與二節 Part B 相同，其中要特別注意的是，因為要比較 mRNA 的量，所以要求出每個生殖腺類固醇接受體適當的 cycle 數。. 步驟 ( Procedure ). 67.

(68) ↓ 首先以 PCR 的方式得到的 GAPDH ( house keeping gene ) ，run 不同的 cycle 數，會得到一直線，取其中間值為我們要的 cycle 數，GAPDH 是 22。 ↓ 同樣的方法算出各種生殖腺類固醇接受體適當的 cycle (Fig. 26–Fig.29)。 ↓ 算出卵巢黏液性囊腺瘤及卵巢表皮上面所需的 mRNA 量。 ↓ 接著以生殖腺類固醇接受體的 primers(Table 3)製造 sex steroid receptor products。 ↓ 將所得的 products 以電泳分析及評估 DNA 的量。. ** DNA 產物之定量 ** ↓ 加入 2μl DNA loading buffer。 ↓ 跑膠。 ↓ 將膠放在 EBTBA 內染色 30 分鐘。 ↓ 接著取出膠，在 UV box 照相，評估 DNA 的相對含量。 ↓ 定量是藉由 Hewlett Packer Digital scanner 將 steroid receptors products 相片掃描至電腦之後，以 UN-SCAN-IT Gel Version 5.1 system ( Silk Scientific, Orm, Utah ). 68.

(69) 來分析，求得 steroid receptors/GAPDH mRNA 的比值。. Gene. Primer. Sequence. ER-α. Forward 5’-TGCCAAGGAGACTCGCTA-3’. Size 263bp. Reverse 5’-TCAACATTCTCCCTCCTC-3’ ER-β. Forward 5’-TTCCCAGCAATGTCACTAACT-3’ 256bp Reverse 5’-CTCTTTGAACCTGGACCAGTA-3’. Androgen. Forward 5’-GCATGGTGAGCAGAGTCCCTATC-3’ 365bp Reverse 5’-TCCCAGAGTCATCCCTGCTTCAT-3’. Progesterone Forward 5’-GCAATGGAAGGGCAGCACAAC-3’ 741bp Reverse 5’-CTGGGTTTGACTTCGTAGCCC-3’. Table 3. Primers for Steroid receptors. 69.

(70) 第三章研究結果. 第一節卵巢黏液性囊腺瘤典型鈣黏蛋白的種類我們將含有 cadherin product 的 PCR-II vector clone 到 E coli 中，接著挑選出 30 個轉植成功形成白色的菌落(Fig.11)，而各種 classical cadherin colonies 的數目如 table 4，萃取出 plasmid DNA 後，接著以 Eco RI restriction enzyme 將 plasmid 切斷，之後再跑電泳以確定為正確的 clone，如果在 gel 上出現一條 base pair 約 3.9 Kb 的 band 是 plasmid 的 DNA，另一條約 180 base pairs 的 band 是 cadherin 的 DNA (Fig.12)才是正確的 clone。接著再定序這些正確的 DNA，結果發現在卵巢黏液性囊腺瘤中有六種典型鈣黏蛋白，分別是：E-cad、N-cad、P-cad、R-cad、Cad-6、Cad-11(Fig.13 ~ Fig.18)。. 70.

(71) Table 4. Analysis of cadherin cDNA clones generated from ovarian mucinous cystadenoma. Cadherin subtype. No of clones. Clones analyzed (%). E-cad. 6. 20. N-cad. 3. 10. P-cad. 6. 20. R-cad. 2. 7. Cad-6. 2. 7. Cad-11. 11. 36. 71.

(72) Fig.11 Agar plate for transformed bacterial selection。如果有被含 cadherin products 所 clone 的 PCR-II vector 轉植成功的細胞是白色的菌落，反之則無形成菌落，但是若被不含 cadherin products 所 clone 的 PCR-II vector 所轉植成功的話，則會形成藍色的菌落。. 72.

(73) Fig.12. A. representative. photomicrograph. of. ethidium. bromide-stained gels containing plasmid DNA( 3.9 kb of PCR -II vector) and PCR products (about180bp) generated. by. using. degenerate. primers,. which. extracted from transformed cell and digested by using the restriction enzyme EcoRI.. ← 3.9 kb plasmid. ← 180 bp PCR. products. 73.

(74) Fig.13. E-cadherin sequence. 74.

(75) Fig.14. N-cadherin sequence. 75.

(76) Fig.15. P-cadherin sequence. 76.

(77) Fig.16. R-cadherin sequence. 77.

(78) Fig.17. Cadherin-6 sequence. 78.

(79) Fig.18. Cadherin-11 sequence. 79.

(80) 第二節比較六種典型鈣黏蛋白及生殖腺類固醇接受體的 mRNA 在卵巢黏液性囊腺瘤與正常卵巢表面上皮細胞的表現 (Comparison of six classical cadherin subtypes. and. recetpors. in. gonadal ovarian. steroid mucinous. cystadenoma and OSE ) 因為要比較 mRNA 的量，所以先要求出每一個典型鈣黏蛋白及生殖腺類固醇接受體適當的 PCR cycle 數，GAPDH 為 22 cycles，其餘 cadherins 和 steroid receptors 為 30 cycles，結果如 Fig. 19 至 Fig.29。六種典型鈣黏蛋白及生殖腺類固醇接受體的 mRNA 經過電腦的比較及以 Wilcoxon signed ranks test 作檢定後，發現 E-cad 及 P-cad 在卵巢黏液性囊腺瘤的表現比正常卵巢表面上皮細胞明顯增加，但 N-cad、 R-cad 及 Cad-6 卻明顯減少，至於 Cad-11 的表現兩者都沒差異(Fig.30 及 Fig. 31)；所有生殖腺類固醇接受體(ER-α、 ER-β、AR & PR)的表現，卵巢黏液性囊腺瘤都此 OSE 多 (Fig.32 及 Fig.33)。. 80.

(81) Fig.19. GAPDH 的半定量(semiquantitative) RT-PCR 理想 cycl 數。由圖中的線性增加發現，當 cycle 數為 22 時，為理想的定量 cycle 數。. GAPDH. Relative optical density. 7 6 5 4 3 2 1 0 20. 22. 24. Number of cycles. E-cad 的半定量 (semiquantitative) RT-PCR 理想 cycle 數。由圖中的線性增加發現，當 cycle 數為 30 時，為理想的定量 cycle 數。. E-cadherin. 6. Relative optical density. Fig.20. 5 4 3 2 1 0 28. 30. 32. Number of cycles. 81.

(82) Fig.21 N-cad 的半定量( semiquantitative ) RT-PCR 理想 cycle 數。由圖中的線性增加發現，當 cycle 數為 30 時，為理想的定量 cycle 數。. N-cadherin. Relative optical density. 6 5 4 3 2 1 0 28. 30. 32. Number of cycles. Fig.22 P-cad 的半定量( semiquantitative ) RT-PCR 理想 cycle 數。由圖中的線性增加發現，當 cycle 數為 30 時，為理想的定量 cycle 數。. P-cadherin. 7. Relative optical density. 6 5 4 3 2 1 0 28. 30. 32. Number of cycles. 82.

(83) Fig.23 R-cad 的半定量( semiquantitative ) RT-PCR 理想 cycle 數。由圖中的線性增加發現，當 cycle 數為 30 時，為理想的定量 cycle 數。. R-cadherin. Relative optical density. 6 5 4 3 2 1 0 28. 30. 32. Number of cycles. Fig.24 Cad-6 的半定量( semiquantitative ) RT-PCR 理想 cycle 數。由圖中的線性增加發現，當 cycle 數為 30 時，為理想的定量 cycle 數。. Cadherin-6. Relative optical density. 6 5 4 3 2 1 0 28. 30. 32. Number of cycles 83.

(84) Fig.25 Cad-11 的半定量( semiquantitative ) RT-PCR 理想 cycle 數。由圖中的線性增加發現，當 cycle 數為 30 時，為理想的定量 cycle 數。. Cadherin-11. Relative optical density. 6 5 4 3 2 1 0 28. 30. 32. Number of cycles. Estrogen. receptor-alpha. (ER-α) 的半定量. (semiquantitative) RT-PCR 理想 cycle 數。由圖中的線性增加發現，當 cycle 數為 30 時，為理想的定量 cycle 數。. ER-alpha. 6. Relative optical density. Fig.26. 5 4 3 2 1 0 28. 30. 32. Number of cycles. 84.

(85) Fig.27. Estrogen. receptor-beta. (ER-β) 的. 半. 定. 量. ( semiquantitative ) RT-PCR 理想 cycle 數。由圖中的線性增加發現，當 cycle 數為 30 時，為理想的定量 cycle 數。. ER-beta. Relative optical density. 6 5 4 3 2 1 0 28. 30. 32. number of cycles. Fig. 28 Progesterone receptor 的半定量( semiquantitative ) RT-PCR 理想 cycle 數。由圖中的線性增加發現，當 cycle 數為 30 時，為理想的定量 cycle 數。. Relative optical density. 6. Progesterone receptor. 5 4 3 2 1 0 28. 30. 32. Number of cycles. 85.

(86) Androgen receptor(AR)的半定量 ( semiquantitative ) RT-PCR 理想 cycle 數。由圖中的線性增加發現，當 cycle 數為 30 時，為理想的定量 cycle 數。. Androgen receptor. 6. Relative optical density. Fig.29. 5 4 3 2 1 0 28. 30. 32. Number of cycles. 86.

(87) Fig.30 比較 E-cad、N-cad 及 P-cad mRNA 在卵巢黏液性囊腺瘤及正常卵巢表面上皮細胞的表現。圖中 a 表示 negative control， b 為正常卵巢表皮上皮細胞，c 為卵巢黏液性囊腺瘤。DNA marker(M) 在 gel 的最左邊。 Photographs of ethidium bromide-stained gel 上都有顯示用 specific primers ( E-cad、N-cad 及 P-cad)所生成的 PCR products。而 E-cad、 N-cad 及 P-cad 分別位在 361、373 及 357 base pairs 的位置上，而 GAPDH 則位於 359 base pairs 的地方。每一個 cadherin subtype 的 absorbance value，都會以相對應的 GAPDH 作標準化 (normalized) ，算出他們的比值後，以 Wilcoxon signed ranks test 作檢定，最後所得到的結果以 Bar chart 的方法呈現(* 代表 p < 0.05)。結果發現 E-cad 及 P-cad 的 mRNA 在卵巢黏液性囊腺瘤的表現比正常卵巢表面上皮細胞明顯多，而 N-cad 則明顯減少。. 87.

(88) Fig.30 比較 E-cad、N-cad 及 P-cad mRNA 在卵巢黏液性囊腺瘤及正常卵巢表面上皮細胞的表現。. M. E-cad a b c. N-cad a b c. P-cad a b c. cadherins. GAPDH. Relative ratio of cadherin/GAPDH. E-cadherin. N-cadherin. 1.2. P-cadherin. *. *. *. 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 a. b. c. a. b. c. a. b. c. 88.

(89) Fig.31. 比較 R-cad、Cad-6 及 Cad-11 mRNA 在卵巢黏液性囊腺瘤及正常卵巢表面上皮細胞的表現。圖中 a 表示 negative control，b 為正常卵巢表皮上皮細胞，c 為卵巢黏液性囊腺瘤。 DNA marker(M) 在 gel 的最左邊。 Photographs of ethidium bromide-stained gel 上都有顯示用 specific primers ( R-cad、Cad-6 及 Cad-11)所生成的 PCR products。而 R-cad、Cad-6 及 Cad-11 分別位在 291、275 及 742 base pairs 的位置上，而 GAPDH 則位於 359 base pairs 的地方。每一個 cadherin subtype 的 absorbance value，都會以相對應的 GAPDH 作標準化(normalized)，算出他們的比值，以 Wilcoxon signed ranks test 作檢定，最後所得到的結果以 Bar chart 的方法呈現( * 代表 p < 0.05)。結果發現 R-cad 及 Cad-6 的 mRNA 在卵巢黏液性囊腺瘤的表現比正常卵巢表面上皮細胞明顯減弱，而 cad-11 則無明顯差異。. 89.

(90) Fig.31 比較 R-cad、Cad-6 及 Cad-11 mRNA 在卵巢黏液性囊腺瘤及正常卵巢表面上皮細胞的表現。. M. R-cad a b c. Cad-6 a b c. Cad-11 a b c. Cadherins. GAPDH. Relative ratio of cadherin/GAPDH. R-cadherin. Cadherin-6. Cadherin-11. 1.2. *. 1.0. * 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 a. b. c. a. b. c. a. b. c. 90.

(91) Fig.32. 比較 ER-α、ER-β 及 PR mRNA 在卵巢黏液性囊腺瘤及正常卵巢表面上皮細胞的表現。圖中 a 表示 negative control， b 為正常卵巢表面上皮細胞，c 為卵巢黏液性囊腺瘤。DNA marker(M)在 gel 的最左邊。Photographs of ethidium bromide-stained gel 上都有顯示用 specific primers (ER-α、ER-β 及 PR )所生成的 PCR products。而 ER-α、 ER-β 及 PR 分別位在 263、259 及 741 base pairs 的位置上，而 GAPDH 則位於 359 base pairs 的地方。每一個 steroid receptors 的 absorbance value，都會以相對應的 GAPDH 作標準化(normalized)，算出他們的比值後，以 Wilcoxon signed ranks test 作檢定，最後所得到的結果以 Bar chart 的方法呈現(* 代表 p < 0.05)。結果發現 ER-α、ER-β 及 PR 的 mRNA 在卵巢黏液性囊腺瘤的表現比正常卵巢表面上皮細胞明顯增多。. 91.

(92) Fig.32. 比較 ER-α、ER-β 及 PR mRNA 在卵巢黏液性囊腺瘤及正常卵巢表面上皮細胞的表現。. M. ER-a a. b. ER-β c. a. b. c. PR a. b. c. Steroid receptors. Relative ratio of steroid receptor/GAPDH. GAPDH. ER-alpha 1.2. ER-beta *. *. PR *. 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 a. b. c. a. b. c. a. b. c. 92.

(93) Fig.33. 比較 AR mRNA 在卵巢黏液性囊腺瘤及正常卵巢表面上皮細胞的表現。圖中 a 表示 negative control，b 為正常卵巢表皮上皮細胞，c 為卵巢黏液性囊腺瘤。DNA marker(M)在 gel 的最左邊。Photographs of ethidium bromide-stained gel 上都有顯示用 specific primer (PR )所生成的 PCR product。而 AR 位在 365 base pairs 的位置上，而 GAPDH 則位於 359 base pairs 的地方。AR 的 absorbance value，會以相對應的 GAPDH 作標準化(normalized)，算出其比值，以 Wilcoxon signed ranks test 作檢定，最後所得到的結果以 Bar chart 的方法呈現( * 代表 p < 0.05)。結果發現 AR 的 mRNA 在卵巢黏液性囊腺瘤的表現比正常卵巢表面上皮細胞明顯增多。. 93.

(94) Fig.33. 比較 AR mRNA 在卵巢黏液性囊腺瘤及正常卵巢表面上皮細胞的表現。 M. AR a. b. c. androgen receptor. Relative ratio of steroid receptor/GAPDH. GAPDH. AR 1.2. * 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 a. b. c. 94.

(95) 第四章討論本研究以 RT-PCR 和基因定序在卵巢良性黏液性囊腺瘤的檢體中確認有六種鈣黏蛋白存在，也就是 E-cad、N-cad、P-cad、R-cad、 Cad-6 及 Cad-11。Patel 等人的報告也同樣指出這六種鈣黏蛋白存在於正常卵巢表面上皮細胞和卵巢癌組織中[Patel IS et al.2003]。由於鈣黏蛋白主導組織、器官的形態學表現，因此我們推斷這六種鈣黏蛋白的消長導致 OSE 化生(metaplasia)或異生(dysplasia)成不同的卵巢上皮腫瘤。. E-cad 表現在一般正常的上皮細胞[Marrs JA & Nelson WJ. 1996]，但在正常卵巢表面上皮細胞的表現卻比較特別。有文獻指出以免疫細胞染色檢測卵巢表面上皮細胞時，沒有發現 E-cad 蛋白質的表現[Wong AST et al.1999; Auerseprg N et al.2001]，但是有文獻以較敏感的 RT-PCR 方法，可以檢測出少量的 E-cad mRNA [Patel IS et al.2003] 。本研究利用 RT-PCR 的確檢測出少量的 E-cad mRNA 存在正常 OSE，以這麼少量的 mRNA 可能無法轉譯(translation)成蛋白質表現或是少到無法用免疫細胞染色來偵測。又有文獻指出有 E-cad 表現在卵巢柱狀化 (columnar shape)上皮細胞 [Auersperg N & Maines-Bandiera SL.1994; Sundfeldt K et al.1997; Davies BR et 95.

(96) al.1998]。因此我們確信 OSE 是的確存在少量的 E-cad mRNA。. 本研究顯示卵巢良性黏液性囊腺瘤的 E-cad mRNA 與 OSE 比較，有明顯的增加(Fig.30)。表示 OSE 化生成黏液性囊腺瘤時，E-cad 基因被強化(upregulation)。有文獻指出 E-cad 不但是密勒管上皮 (Mullerian epithelium)組織轉化的標記，同時也會誘導 OSE 細胞產生密勒管上皮的化生[Marrs JA & Nelson WJ.1996; Auersperg N et al.1999; Ong A et al.2000]，根據他們的結論，再加上我們的研究結果， E-cad 在卵巢黏液性囊腺瘤中的表現比正常卵巢表面上皮細胞強很多，因此我們可以推論正常卵巢表面上皮細胞發生密勒管上皮的化生，可能是卵巢黏液性囊腺瘤形成的機轉之一。. 過去很多文獻指出 E-cad 消失或弱化(down-regulation)現象存在於不同的惡性腫瘤，包括乳癌[Moll R et al.1993; Rasbridge SA et al.1993; Takayama T et al.1994]、胃癌[Mayer B et al.1993; Yasui W et al.1995]、肺癌[Bringuier PP et al.1993; Bohm M et al.1994,]等；對於卵巢癌的研究，大部分的文獻都認為分化愈差、分期愈後的卵巢癌，其 E-cad 的表現愈弱[Davies BR et al.1998; Fujioka T et al, 2001; Patel IS et al.2003]，因此 E-cad 被視. 96.

(97) 為癌症抑制積基因。本研究顯示黏液性囊腺瘤的 E-cad 基因反而被強化，可能與它的良性特質有關。. N-cad 屬於 typeI 典型鈣黏蛋白，是中胚層細胞與細胞間接合的主要物質[Peralta SA et al.1995; Gulati R & Peluso JJ.1997; Wong AST et al.1999]，它會形成不穩定的 junction[Hazan RB et al. 2000]，因此可促進細胞的移動。最近的文獻顯示 N-cad 的過度表現，會增加乳癌的侵犯力 [Nieman MT et al.1999; Hazan RB et al.2000]。文獻指出 N-cad 是 OSE 主要的鈣黏蛋白之一[Peralta SA et al.1995; Gulati R & Peluso JJ.1997; Wong AST et al.1999]。本研究顯示黏液性囊腺瘤的 N-cad mRNA 量與 OSE 比較，的確有顯著的減少(Fig. 30)。Peralta 的報告也指出黏液性腫瘤有很強的 E-cad 表現，卻沒有 N-cad 蛋白質表現[Peralta SA et al.1997]。我們的研究顯示 N-cad mRNA 在黏液性囊腺瘤只是減少並沒有完全消失。其間的差異可能是我們使用較敏感的 RT-PCR 而他們是用免疫細胞染色法。. 有研究指出 N-cad 的不同表現可以主導不同腫瘤的形成，例如 N-cad 的強化表現與腎上腺惡性 pheochromocytoma 有關，而其弱化. 97.