第七章 討論
7.5 總細菌 copies 與 cells 之相關性探討
以 qPCR 定量細菌時，其濃度的表示方式之一係以 DNA copies 之量來呈現 (Bach et al., 2002)，然若能轉換成以細菌數目來呈現職業場所勞工的暴露，將更 具意義。然不同細菌在所偵測之 DNA 片段上之 copy number 不全然相同，故進 一步回顧目前以 qPCR 定量總細菌之研究，以解析他人如何處理此議題。
Nadkarni 等人(2002)曾以 qPCR 作為定量臨床牙齒樣本中總細菌之方法。偵 測對象為細菌之 16S rDNA，透過使用forward primer (TCCTACGGGA
GGCAGCAGT)與 reverse primer (GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT)引子，
作者將不同 copy number 之三種菌種：E. coli (copy number=7)、Pseudomonas aeruginosa (copy number=4)及 S. aureus (copy number=9) 進行混合，並以 qPCR 與培養法分別分析之；其中，qPCR 方面，係以 E. coli經引子對放大(forward primer 及 reverse primer 片段之基因位置為331 及 797，其放大總長度為 466 bp)，再將 所得之 DNA 重量以 E. coli 細菌作為換算細菌數的基準(1 E. coli cell 之 DNA 重 量為 4.96 fg)。結果顯示，以 qPCR 所得之 DNA 重量若以 E.coli 作為依據轉換，
其換算所得之細菌數(1.3109 cells/mL)與培養法所得結果(1.4109 cells/mL)相似。
因此，作者認為 E.coli 可作為總細菌數換算之依據。
Rinsoz 等人(2008)在廢水處理廠進行空氣採樣，並以 qPCR 作為定量總細菌 濃度之方法，偵測對象為細菌之 16S rDNA，引子對係參考 Nadkarni 等人(2002) 之設計。此團隊在處理其數據時，亦參考 Nadkarni 等人(2002)之方法，以 E.coli 作為依據將DNA 重量換算細菌數。另外，Li 等人(2010)於地面上與距離地面 238 公尺之高塔上進行空氣中總細菌濃度監測，偵測對象亦是細菌之 16S rDNA，
而引子對也參考 Nadkarni 等人(2002)之設計。在處理數據時，係將 qPCR 定量之 結果換算成 DNA 濃度(copies/L)後直接除上 4.1，以得到以細菌數呈現的濃度值 (cells/L)，然 Li 等人(2010)並未詳述原因。另 Harms 等人於 2003 年，以 qPCR 定量廢水處理廠之總細菌，其引子對係使用 forward primer
(ATGGCTGTCGTCAGCT) 與 reverse primers (ACGGGCGGTGTGTAC)，而作者 係假設總細菌之平均 copy 數為 3.6，因此在數據處理時，將 qPCR 定量之結果換 算成 DNA 濃度(copies/L)後直接除上 3.6，以得到細菌數濃度值(cells/L)。另 Rothrock 等人於 2012 年定量土壤中總細菌，其引子對係參考 Harms 等人(2003)
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之設計，在細菌數換算時，亦參考 Harms 等人(2003)之方法。
本研究偵測對象亦為細菌之 16S rDNA，使用之引子對為DG74 forward primer (AGGAGGTGATCCAACCGCA)與 RW01 reverse primer
(AACTGGAGGAAGGTGGGGAT) (Greisen et al, 1994)，與上述研究（Nadkarni et al., 2002; Rinsoz et al., 2008; Li et al., 2010; Harms et al., 2003; Rothrock et al., 2012）
不同。考量不同引子對所夾取之 DNA 片段不同，其在細菌內之 DNA copies 數也 可能不同。加以不同細菌對此 DNA 片段所擁有的 copies 數也可能不同，故本研 究將不同環境(醫療院所、木材行、畜牧業及家禽業)採集之空氣細菌樣本，經過 培養以增加細菌濃度後，調整總細菌濃度為 1×105 ~1×108 cfu/mL，同步進行 qPCR 以及 Baclight/Microscope 計數。將所得數據建立DNA copies 數目與細菌數之檢 量線。如此，即可將環境樣本以 qPCR 所測得總細菌及活性細菌之 DNA copies，
經由帶入檢量線得到細菌數後，進一步校正採樣體積以得到採樣環境空氣中細菌 濃度 (cells/m3)。而亦整理其他使用檢量線方式換算細菌數之文獻(如表 24)，發 現有研究係以可培養細菌數(cfu)與 qPCR 所得之 copies 或 DNA 量建立檢量線如 表 24，但本研究認為當偵測對象為總細菌時，認為以培養細菌數與 qPCR 之 copies 或 DNA 量之方式建立檢量線，換算濃度時導致低估所偵測對象之濃度 (cfu/m3)，由於培養法無法偵測處於 VBNC 之細菌(詳見文獻回顧)，因此認為以 培養法及 qPCR 建立總細菌檢量線不妥。而與本研究同樣以顯微鏡鏡檢所得之細 菌數與 qPCR 分析之 copies 數建立檢量線之方式，已應用於定量原蟲上，例如 Bridle 等人於 2010 年以 qPCR 定量 Neoparamoeba perurans，檢量線建立之方式 係以配置不同濃度之 N. perurans 懸浮液，同時以顯微鏡計數及 qPCR 分析，將 所得之原蟲數目與 DNA copies 數建立檢量線，作為未知樣本換算原蟲數之依據
（表 24）；因此本研究認為以 qPCR 及 Baclight/Microscope 計數建立環境檢量線
之方式是可接受的，且應用於環境驗證的數據顯示（表 17），經此檢量線所得到
不同採樣地點的濃度，其總細菌濃度均大於活性細菌濃度，且後者亦大於可培養 細菌濃度，顯示以此建立檢量線的方式，可以適當的將 DNA copies 數目換算細 菌數，並進一步獲得空氣中暴露濃度值。
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表 24、qPCR vs 細菌數檢量線整理
對象 檢量線建立之方法 R2 公式 參考文獻
Total bacteria from air 顯微鏡鏡檢(Baclight)所得之細 菌數與 qPCR 所得之 copies 數 建立檢量線
0.96 0.97
Total bacteria:
Y (log cells/sample)= 1.03 X (log copies/sample)– 0.63 Viable bacteria:
Y (log cells/sample)= 1.09 X (log copies/sample)– 0.86
This study
Neoparamoeba perurans 顯微鏡鏡檢(cells)與 qPCR 所得 之 copies 數建立檢量線
0.999 Y (copy number)=2008X (cells) Bridle et al., 2010
Acanthamoeba 顯微鏡鏡檢(cells)
hemocytometer vs qPCR 所得 之 DNA quantity (fg) 建立檢量 線
0.99 Y (DNA log fg)= 1.177X (log cells/sample)–0.209 Chang and Wu, 2010
Hartmannella vermiformis Fluorescence microscope 所得之 細菌數(cells)與 qPCR 所得之 copies 數建立檢量線
0.99 Y (Ct)=-3.75X (log cells/sample)+28.4
Kuiper et al., 2006 Lactococcus garvieae 可培養細菌數(cfu/mL)與 qPCR
所得之 Ct 值建立檢量線
0.989 Y (Ct)= –4·3932X (log cfu/mL)+ 39·871 Jung et al., 2010 Trypanosoma brucei 可培養細菌數(cells/mL)與
qPCR 所得之 Ct 值建立檢量線
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7.5.1 TSB 可培養之細菌群探討
TSA 為最常應用於總細菌或單一細菌之培養基質 (Vieira and Nahas, 2005)。
而 TSB 與 TSA 之差別為 TSA 多了一項 Agar 成分，其餘成分皆相同(詳如 5.1 節)。
因此認為 TSA 可以培養之細菌菌種，同時也可以在 TSB 中被培養。然本研究在 建立 copies 數換算細菌數之環境檢量線時，考慮 Baclight 搭配顯微鏡下計數細菌 數時，有高偵測下限之限制，基此將四種不同環境(醫療院所、雞舍、豬舍及木 材行)採集之環境樣本以 TSB 大量培養細菌群，作為環境檢量線製作之菌液來源。
而經 TSB 大量培養之細菌群時，培養過程環境中優勢菌種可能會被優先放大，
導致與原先之環境中細菌種類不同，總細菌菌種進而在 qPCR 貢獻之 copies 數可 能不同，影響細菌數換算檢量線之正確性。為了解樣本經 TSB 培養之細菌群與 實際環境空氣之細菌群是否有差異，故整理四種環境地點之空氣中主要細菌菌種 (表 25)，同時亦統整 TSA 可培養之細菌菌種 (如表 26)，觀察四個環境地點之空 氣中主要細菌菌種是否可在 TSA 被培養。
表 26 顯示，TSA 可以培養大約有 25 種細菌菌屬分為：Alcaligenes spp.、
Arthrobacter spp. 、Aureobacterium spp. 、Bacillus spp 、Brevibacterium spp. 、 Cellulomonas spp. 、Curtobacterium spp. 、Enterobacter spp. 、Escherichia spp. 、 Exiguobacterium spp. 、Flavobacterium spp. 、Halomonas sp. 、Hydrogenophaga spp、Klebsiella spp. 、Kluyvera spp. 、Marinobacter sp. 、Methylobacterium sp. 、 Microbacterium spp. 、Micrococcus spp. 、Mycobacterium sp. 、Pantoea spp. 、 Phyllobacterium spp. 、Pseudomonas spp. 、Serratia spp. 及 Staphylococcus spp.。
四種環境地點的主要細菌菌種(表 25)為 Bacillus spp 、Micrococcus spp 、 Staphylococcus spp 、Pseudomonas sp 、Pantoea agglomerans 、Corynebacterium sp.及 Enterococcus spp.，除了 Rahnella 菌種目前尚未發現可以在 TSA 上生長，
其餘的主要細菌皆可以生長在 TSA 上，認為 TSA 可培養之菌種，在 TSB 亦可被 培養；因此空氣樣本以 TSB 培養之細菌菌種與原先之環境中細菌種類差異可能 不大，且本研究之 TSB 加入葡萄糖的成分(如 5.1 節)，理當可培養較多細菌菌種。
雖然些許細菌(如 L. pneumophila)無法在 TSA 上生長，但多數菌種(目前整理 132 種細菌)係可以被 TSA 培養出來(表 26)，因此認為以 TSB 培養細菌群做為檢量 線建立之菌液來源，其菌群的變化影響細菌數換算檢量線之正確性應該不大。
93 Bacillus sp. Matkovic et al., 2007 Pseudomonas
Staphylococcus Streptococcus
農田 P. agglomerans Skórska et al., 2005 Aureobacterium testaceum Góra et al., 2009 Bacillus spp.
木材行 Acinetobacter calcoaceticus Dutkiewicz et al., 2001 Corynebacterium sp.
P. agglomerans Rahnella sp.
Streptomyces albus
Bacillus sp. Oppliger et al., 2005 Pseudomonadacea
Coliforms Gioffre et al., 2012 Enterococcus spp.
Staphylococcus spp.
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表 26、TSA 可培養之細菌菌種
菌種 參考文獻
Pseudomonas fluorescens Straka and Stokes, 1959
Pseudomonas geniculata
Pseudomonas ovalis
Acinetobacter baumannii Clavibacter michiganensis Ochrobactrum anthropi McInroy and Kloepper, 1995 Agrobacterium radiobacter Comamonas testosteroni Pantoea spp.
Alcaligenes spp. Curtobacterium spp. Phyllobacterium spp.
Arthrobacter spp. Enterobacter asburiae Pseudomonas chlororaphis Aureobacterium spp. Enterobacter cloacae Pseudomonas fluor, spp.
Bacillus megaterium Enterobacter spp. Pseudomonas nofluor, spp Bacillus pumilus Erwinia carotovora Pseudomonas putida
Bacillus spp. Escherichia spp. Pseudomonas saccharophila Bacillus subtilis Flavimonas oryzihabitans Rhizobium japonicum Bacillus thuringiensis Flavobacterium spp. Serratia spp.
Burkholderia cepacia Hydrogenophaga spp Sphingomonas paucimobilis Burkholderia gladioli Klebsiella spp. Staphylococcus spp.
Burkholderia pickettii Kluyvera spp. Stenotrophomonas maltophilia Burkholderia solanacearum Methylobacterium spp. Variovorax paradoxus
Cellulomonas spp. Microbacterium spp. Xanthomonas campestris
Citrobacter koseri Micrococcus spp. Yersinia frederiksenii
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表 26、TSA 可培養之細菌菌種(續)
菌種 參考文獻
S. aureus Cohen et al., 1998
Bacillus Diphtheroides
Pseudomas aeruiginosa Sarcinia Lutea
S. marcescens
Bacillus pumulis Halverson et al., 2000
Pseudomonas chlororaphis
Streptomyces griseus
Acinetobacter Spanggaard et al., 2000
Enterobactericeae Moraxella
Pseudomonas spp.
Vibrionaceae
Arthrobacter globiformis Rhodococcus opacus McCaig et al., 2001 Bacillus insolitus Staphylococcus arlettae
Bacillus macroides Staphylococcus arlettae Cellulomonas turbata Streptomyces griseus Janthinobacterium lividum Streptomyces griseus Methylobacterium sp. Streptomyces lavendulae Mycobacterium sp. Xanthomonas sacchari Pseudomonas pictorum. Zoogloea ramigera
Rhodococcus erythropolis
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表 26、TSA 可培養之細菌菌種(續)
菌種 參考文獻
Brevundimonas diminuta Choi et al., 2003
Abiotrophia defectiva Aeromonas bestiarum Aeromonas hydrophila Anguillicola crassus Edwardsiella tarda Plesiomonas shigelloides
Pseudomonas/Alcaligenes,
Bacillus cereus Staphylococcus xylosus Tsai and Liu, 2009 Bacillus firmus
Acinetobacter Pseudomonas Awad et al., 2010
Alcaligenes Salmonella
Bacillus Sarcina
Citrobacter Staphylococcus Diplococcus Streptococcus Enterobacter
E. coli
Flavobacterium Klebsiella
Kocuria
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表 26、TSA 可培養之細菌菌種(續)
菌種 參考文獻
Aeromonas hydrophila Neisseria mucosa Liu et al., 2010 Bacillus circulans Pseudomonas aeruginosa
Bacillus endophyticus Pseudomonas spp.
Bacillus pumilus. Staphylococcus capitis Bacillus spp. Staphylococcus lentus Endophytic bacteria Staphylococcus xylosus Exiguobacterium spp.
Micrococcus spp Mycobacerium spp.
Jeotgalicoccus aerolatus Martin et al., 2011
Jeotgalicoccus coquinae
Acidovorax Pantoea Yashiro et al., 2011
Aeromicrobium Pseudomonas Aurantimonas Sphingomonas Curtobacterium Terracoccus Friedmanniella Xylophilus Frigoribacterium
Frondihabitans Labedella Massilia
Methylobacterium
L. monocytogenes Su and D’Souza, 2012
S. Typhimurium
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