第六章 結果
6.7 qPCR 搭配 EMA/PMA 於定量活性細菌之適用性與其最佳條件
6.7.3 總結
兩種核酸染劑結果顯示，EMA 會進入部分活性細菌內並與 DNA 結合，干 擾活性細菌之 DNA 於 qPCR 監測與定量(圖 26 A)。然而對於受熱的樣本(圖 26 B)，無 EMA 處理者所得 DNA 量為 5.36 log copies/μL，較有 EMA 處理者(3.74 log copies/μL)為高，顯示 EMA 確實可以抑制死菌被 qPCR 放大。然 EMA 處理雖然 能抑制非活性細菌被 qPCR 偵測與定量，但同樣也會進入活性細菌內而影響活菌 於 qPCR 監測與定量。進一步觀察不同 PMA 濃度間反應，顯示 1.5 μg/mL 之 PMA 即可有效抑制受熱組細菌於 qPCR 放大(圖 26 D)，且在此濃度下，不會對活性細 菌造成 qPCR 定量濃度之明顯干擾(圖 26 C)。因此本研究認為以 1.5 μg/mL PMA 為結合 qPCR 定量空氣中活性細菌之最佳條件。
圖 26、qPCR 搭配 EMA/PMA 於定量活性細菌
EMA 活菌 EMA 死菌
PMA 活菌
PMA 死菌
(A) (B)
(C) (D)
√
√
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6.8 qPCR 搭配 EMA/PMA 定量活性細菌之上下限值與線性關係
偵測上、下限的標準定義為在線性關係良好之範圍內可偵測之最高與最低之 細菌數量，同時需滿足未受熱組與 90℃受熱 20 分鐘之細菌兩者間之 DNA 量可 因核酸染劑的處理而有明顯區別。
本實驗首先備置未受熱細菌之濃度調至約 1×1010 cfu/mL，進行 10 倍序列稀 釋，作為控制組(viable cells only)；同時亦準備 1×108 cfu/mL 之受熱細菌濃度，
並將其加入序列稀釋的各未受熱組細菌中成為具有混合菌群之實驗組(mixture cells)，並控制每個樣本中之受熱細菌濃度均維持在 1×108 cfu/mL，但未受熱細菌 濃度介於 1×101 ~ 1×1010 cfu/mL，用以觀察是否會因為加入高濃度之受熱細菌而 影響不同濃度活性細菌之定量，並從中界定符合線性關係的活性細菌濃度範圍。
此外亦分析未添加受熱細菌之控制組，以確認不含受熱細菌時的活性細菌其定量 線性範圍。將上述樣本分別以1.5 μg/mL 之 PMA 處理，並皆進行 DNA 萃取與 qPCR 分析。
結果如圖 27 顯示，對於活菌濃度104 cfu/mL 時，不含死菌的對照組與添加 死菌的實驗組在活菌的測定數值上相當，將對照組與添加死菌之實驗組之濃度範 圍為 1×104 ~ 1×1010 cfu/mL 時所得數據進行 Wilcoxon 統計檢定，結果顯示兩組 之 DNA 濃度並未有統計上顯著差異(p=0.75)，顯示 PMA 確實可抑制死菌的 DNA 在 PCR 中不被放大。而依據定量活性細菌之線性關係結果，其對照組(R2=0.9945) 與添加死菌之實驗組 (R² = 0.9846) 最佳線性範圍皆介於 1×104 ~ 1×1010
cfu/mL。
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圖 27、以 1.5 μg/mL PMA 處理 1×101 ~ 1×1010 cfu/mL 未受熱組細菌(viable cells only)與含 1×108 cfu/mL 受熱細菌混合組 (mixture cells)之 qPCR 結果(n=6)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
log coopies/mL
log cfu/mL viable only
mixture
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6.9 環境檢量線建立
由於每種細菌之 copy number 不同，無法直接將樣本中之 copies 數換算為細 菌數，為了解決此困擾，本研究於醫療院所、木材行、畜牧業及家禽業等環境採 集空氣樣本後，於實驗室內使用 qPCR 及 Baclight 兩種方法建立轉換 copies 與 cells 之檢量線，因此得到四條環境檢量線。而為了瞭解四條檢量線是否可以合併，因 此將四個地點所得到總與活性細菌之 gene copies 或 cell counts 以 Kruskal-Wallis test 進行統計檢定進行，結果顯示四個地點之 gene copies 或 cell counts 之間均無 顯著差異(P>0.70)，因此將四個環境之檢量線合併以建立可以適用於以
PMA-qPCR 與 qPCR 定量總細菌之環境檢量線。
結果如圖 28 及圖 29 所示，在總細菌之檢量線公式為 Y (log cells/sample) = 1.034 X (log copies/sample) - 0.6278 (R² = 0.9592)；活性細菌之檢量線為 Y (log cells/sample)= 1.085 X (log copies/sample) - 0.8616 (R² = 0.9665)。高 R2值顯示可利 用檢量線校正 PMA-qPCR 與 qPCR 所得之 gene copies 至細菌數。
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BacLight, log cells/sample
qPCR, log copies/sample hospital
Baclight, log cells/sample
qPCR, log copies/sample hospital
swine house sawmill poultry
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