解決 NTC 之 Ct 值限制

由於使用universal primer偵測總細菌時，即面臨到NTC會出現Ct值之狀況，

因此Corless等人於2000年嘗試以化學或物理之方法解決試劑背景值之限制，將 polymerase以不同強度之UV照射、不同濃度之DNase I (100, 30, 25, 20, 10, and 5 U/L)及不同限制內切酶(AvaI, HaeIII, HinfI, Sau3AI, and SmaI)進行實驗，而每組實 驗皆有控制組(positive control: N. meningitides 或E. coli.之DNA)與NTC (negative

100

control)做對照。其結果顯示，未照射UV之控制組與NTC之Ct分別為23.71及27.21，

當照射UV 強度為4 J/cm²時，NTC之Ct值>45，但控制組之Ct值則為35.45，顯示 以UV處理雖然可以改善NTC之Ct，同時亦會犧牲控制組偵測之正確性；而以 DNase I處理時，係將polymerase加入DNase I後，以37°C 10分鐘，使DNase I與 polymerase之free DNA作用，接著以5分鐘95°C破壞DNase I之活性。DNase I之結 果顯示，未處理之控制組與NTC之Ct分別為23.5及28.93，DNase I濃度須高至30 U/L時，方可使NTC之Ct值>45，但同時控制組之Ct值亦>45；而五種限制酶之測 試結果顯示，雖然控制組之Ct值(17.26)與有限制酶處理之Ct值(16.77~16.12)無差 異，但沒有限制酶處理之NTC值為28.61，有限制酶處理之Ct值介於27.8~29.2，

顯示限制酶的處理並無法使NTC之Ct值改善。因此以UV或DNase I處理下，雖然 可改善NTC之Ct值，但同時polymerase之活性可能亦受到物理或化學性之破壞，

使qPCR敏感度變差；而Bispo等人於2011年做類似實驗亦發現此結果，將兩種不 同之試劑(SYBR Green supermix及TaqMan Universal PCR Master Mix)以DNase I 處理，並將加入DNase I之樣本以37°C 30分鐘，使DNase I與polymerase之free DNA 作用，接著以95°C 50分鐘破壞DNase I之活性。結果顯示，兩種試劑以DNase I 處理後，S. epidermidis之DNA標準品(10 ng/μL~1 fg/μL)，其放大效率SYBR Green supermix及TaqMan Universal PCR Master Mix分別為1.8及1.7，作者亦認為

polymerase之活性可能受到DNase I處理之過程中被破壞，使qPCR放大效率變差。

因此截至目前為止尚未有一個可以改善NTC之Ct值且同時不會影響標準品定量 之正確性的解決方法。

7.6.3 總結

綜合上述，使用universal primer作為定量時，NTC之Ct值應為qPCR試劑所貢 獻(表 29)。而一般認為以probe於定量上較具專一性，在NTC之結果可能較使用 SYBR Green佳，因此進一步比較不同研究使用之qPCR試劑(表 27)，觀察是否 probe較SYBR Green為佳，例如Li等人(2010)與An等人(2006)使用之引子皆參考 Nadkarni之設計(2002)，但探針Li等人係使用probe ((6-FAM)-5-CGTATTAC CGCGGCTGCTGGCAC-3-(TAMRA))；An等人係使用SYBR Green。於NTC之Ct 值分別為28.5 (Li et al., 2010)及30.2±0.36 (An et al., 2006)，顯示如果未來將SYBR Green換成probe未必能改善NTC之問題。而文獻指出(詳如7.6.1節)，不同廠商合

101

成之試劑或primer其含free DNA程度亦不同(Zehr et al., 2003; Goto et al., 2005)。推 論qPCR試劑的純度可能會影響NTC之Ct值。因此進一步比較以universal primer 定量總細菌之相關研究所使用之qPCR試劑廠牌(如表 27)，試劑廠牌使用Bio-Rad 其NTC之Ct值介於29.53~31.3；而使用Applied Biosystems其NTC之Ct值介於33~38。

試劑之廠牌似乎會影響其NTC之Ct值，且以上述兩者廠牌比較，顯示Applied Biosystems之free DNA汙染率比Bio-Rad低一些；因此本研究認為未來供應商是否 發展更純之試劑供研究使用，應為改善NTC之關鍵；而未來也許可以先針對不同 廠商合成之引子或試劑對進行測試，使用free DNA汙染率較低之試劑，或許可以 改善目前NTC之問題。

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表 27、以 universal primer 定量總細菌之 NTC Ct 值

地點/對象 引子 探針 試劑 NTC 之 Ct

值 參考文獻

Mixed bacteria from air AGGAGGTGATCCAACCGCA AACTGGAGGAAGGTGGGGAT (Greisen et al. 1994)

SYBR Green SYBR Green supermix (Bio-Rad)

31.3 This study

Mixed bacteria from fish fillets AGGAGGTGATCCAACCGCA AACTGGAGGAAGGTGGGGAT (Greisen et al. 1994)

SYBR Green SYBT Green supermix (Bio-Rad)

29.53±1.53 Lee &

Levin, 2009 重金屬回收技術(bioleaching)利

用 universal primer 夾取 Leptospirillum ferrooxidans

Acidianus brierleyi

來設計上述六種細菌或古生細 菌之引子

GTAGTCCMSGCYSTAAACGATG AGCTGRCGACRRCCATGCA

SYBR Green Sybr Green PCR Master Mix

(Applied Biosystems)

32 Liu et al., 2005

以 universal primers screening 臨床檢體樣本之總細菌，將 qPCR 之結果定序鑑定細菌菌 種

TTGGAGAGTTTGATCMTGGCTC GTATTACCGCGGCTGCTG

(Edwards et al., 1989)

SYBR Green SYBR master mix (TaKaRa)

33 Kommedal et al., 2011

103

TaqMan Universal PCR Master Mix (Nadkarni et al., 2002)

(6-FAM)-5-CGTATTACCGCGGCTG CTGGCAC-3-(TAMRA)

(Nadkarni et al., 2002)

TaqMan universal PCR master mix

TaqMan Universal PCR Master Mix (Nadkarni et al., 2002)

(6-FAM)-5-CGTATTACCGCGGCTG CTGGCAC-3-(TAMRA)

(Nadkarni et al., 2002)

- 28.5 Li et al., (Nadkarni et al., 2002)

SYBR Green SYBR Green supermix (Bio-Rad)

30.2±0.36 An et al., 2006

104

Hill & Goldspink, 2003

qPCR reagent 試劑廠牌 Source of

primer  Invitrogen, Japan

 TaKaRa, BIO

 AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA),

 Taq DNA Polymerase (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)

 Primer

 Invitrogen, Japan

 TaKaRa, BIO

 PROLIGO, Japan

Delftia tsuruhatensis, Klebsiella variicola, K. pneumoniae,

 Promega (Taq DNA polymerase)

 Takara (ExTaq™; Madison, WI, USA)

 BD Biosciences Clontech (TITANIUM™

Taq; Palo Alto, CA, USA),

 Ambion (SuperTaq™),

 GeneChoice (Taq Complete; Frederick, MD, USA).

105

圖 30、NTC 之 Melting curve

106