PMA-qPCR 定量活性細菌濃度之線性關係

本研究證實，將空氣樣本以 1.5 μg/mL 之 PMA 處置並於暗室內反應 5 分鐘，

再以 500 瓦特光暴露 20 分鐘，是定量空氣中細菌之最佳核酸染劑實驗條件。基 此，本研究進一步評估此方法在含有高濃度之死菌下，不同濃度之活性細菌於 PMA-qPCR 分析所得 DNA 濃度與初始活菌濃度之線性關係。結果顯示，其線性 關係介於 1×10⁴ ~ 1×10¹⁰ cfu/mL (R²=0.9945)。亦整理相關研究之結果，如表 23。

Cawthorn 及 Witthuhn 於2008年研究則係以100 μg/mL之PMA結合傳統 PCR測試E. sakazakii，以評估PMA是否可在含有高濃度死菌之樣本中區分不同初 始濃度之活性細菌，因此備製濃度為1.010⁷ cfu/mL之活性細菌，而將1.010⁷ cfu/mL活性細菌依不同比例0%、25%、50%、75%及100%，分別加入濃度為1.010⁷ cfu/mL之受熱細菌，以傳統PCR觀察混合樣本之反應。結果顯示，在混合死活兩 類細菌的樣本中，相對於僅有活性細菌之樣本而言，其含有不同活菌比例(0%、

25%、50%、75%及100%)之混合細菌樣本於傳統PCR偵測結果，其DNA量相對 百分比分別為0%、24%、51%、73%及97%，而未添加死菌所得之DNA量則分別 為0%、25%、50%、75%及100%。比較兩類樣本之結果，顯示在不同濃度之活 性E. sakazakii加入高濃度之死菌，其活性細菌DNA量與未添加死菌所得之DNA 量並無太大差異，因此認為即使於混合樣本中，PMA仍具有分辨活性細菌之能 力(Cawthorn & Witthuhn, 2008)。

EMA結合qPCR時也有相似的結果報告於過往的文獻中。Wang等人(2010)曾 針對Salmonella進行不同活性菌濃度之線性關係實驗，將10⁶ cfu/mL之死菌分別加 入10¹~10⁹ cfu/mL之活性Salmonella中，並以10 μg/mL EMA進行樣本處理與qPCR 分析。結果顯示，其所測得之活性細菌DNA量與可培養活性細菌濃度(cfu/mL) 間，

在濃度為10²-10⁹ cfu/mL內呈現良好的線性關係(R²=0.9792) (Wang & Mustapha, 2010)。另Pilar等人(2009)針對L. pneumophila以濃度為2.5 μg/mL之EMA搭配qPCR 進行測試，同樣以混合活性與死菌之實驗觀察EMA是否可在高濃度死菌中定量 活性細菌，該作者將1.010⁸ cfu/mL之受熱細菌，加入濃度分別為1.010⁸、1.010⁷、 1.010⁶、及1.010⁵ cfu/mL之活性細菌中，並以qPCR加以定量。結果顯示，其所 得之DNA量與可培養活性細菌濃度(cfu/mL)間，在在濃度範圍為1.010⁵~1.010⁸ cfu/mL時呈現良好之線性 (Pilar et al., 2009)。

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Lee 與 Levin (2009)以鱈魚為對象，以 EMA 與 PMA 結合 qPCR 進行不同活 性菌濃度之線性關係實驗。將不同濃度（3.210⁵、1.010⁶、3.216⁶、1.010⁷、 3.210⁷及 1.010⁸ cfu/mL）之活性細菌，分別加入濃度為 1.010⁸ cfu/mL 之死菌，

並以 1 μg/mL 之 EMA 或 3 μg/mL 之 PMA 處理。結果顯示，兩種核酸染劑在上 述活性細菌濃度範圍(3.210⁵、1.010⁶、3.216⁶、1.010⁷、3.210⁷及 1.010⁸ cfu/mL) 中，皆呈現良好之線性，其最佳線性範圍為 3.210⁵~1.010⁸ cfu/mL。

綜合上述各研究顯示，其所測試之活性細菌濃度範圍有異，但多介於 110⁵~110⁸ cfu/mL（Wang & Mustapha, 2010; Pilar et al., 2009; Lee & Levin, 2009）；而添加死菌之濃度亦不盡相同，分別為 110⁶ (Wang & Mustapha, 2010)、

110⁷(Cawthorn & Witthuhn, 2008) 與 110⁸ (Pilar et al., 2009; Lee & Levin, 2009) cfu/mL。本研究活菌測試範圍皆比上述文獻廣，介於 110¹~110¹⁰ cfu/mL，而添 加死菌之濃度亦最高（110⁸ cfu/mL），在研究設計上更為嚴謹。從本研究結果 顯示，當活菌濃度10⁴ cfu/mL 時，不含死菌的樣本與混合活菌與死菌的樣本在 活菌的測量數值相當（p=0.75），顯示其不受死菌的干擾，可正確定量活性細菌 的濃度，其最佳線性範圍介於 1×10⁴ ~ 1×10¹⁰ cfu/mL (R²=0.9945)。進一步與其他 相關文獻做比較（Lee & Levin, 2009; Pilar et al., 2009; Wang & Mustapha, 2010），

本研究之偵測上限為最高(1×10¹⁰ cfu/mL)；偵測下限濃度亦低於 Pilar (2009)針對 L. pneumophila 測試活性細菌之線性結果 (1.010⁵ cfu/mL)及 Lee 與 Levin (2009) 在鱈魚上偵測活性總細菌之結果（3.210⁵ cfu/mL）。進一步與 Lee 及 Levin (2009) 之總細菌的研究比較，本研究之良好線性範圍(1×10⁴ ~ 1×10¹⁰ cfu/mL)相較於 Lee 與 Levin 研究(3.210⁵~1.010⁸ cfu/mL)為廣，偵測下限也比 Lee 與 Levin 研究為 低，故同樣以總細菌為測試對象，本研究所建立的活性細菌線性範圍較 Lee 與 Levin (2009)為佳。另外，本研究之偵測下限值比 Wang & Mustapha (2010)之研究 (2 log cfu/mL)高，相較於 Wang 等人(2010)以單一類細菌(Salmonella)為對象，本 研究較高的偵測下限結果，可能係因本研究偵測對象為總細菌，受 qPCR 試劑中 含有細菌 DNA 之干擾，故當測試之活性細菌濃度低於 10⁴ cfu/mL 時，其 DNA 濃度與未添加任何細菌之結果趨近相似，故無法精確分辨濃度低於 10⁴ cfu/mL 之 樣本，使得下限濃度受到限制所致。有關試劑干擾之探討論述於 7.6 節中。

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表 23、EMA/PMA-qPCR 定量活性細菌濃度之線性關係 對象 viable cells conc.

(cfu/mL)

dead cells conc.

(cfu/mL)

核酸染劑/

濃度

最佳線性範圍

(cfu/mL) R² 參考文獻 Total bacteria from air 110¹ to 110¹⁰ 110⁸ 1.5 μg/mL PMA 110⁴ ~110¹⁰ 0.9945 This study Total bacteria from fish 3.210⁵、1.010⁶、3.216⁶、

1.010⁷、3.210⁷及 1.010⁸

110⁸ 3 μg/mL PMA 1 μg/mL EMA

3.210⁵~110⁸ - Lee & Levin, 2009

E. sakazakii 0、2.510⁶、5.010⁶、7.510⁶及 1.010⁷

110⁷ 100 μg/mL PMA - - Cawthorn &

Witthuhn, 2008 Salmonella 110¹ to 110⁹ 110⁶ 10 μg/mL EMA 110²~110⁹ 0.9792 Wang &

Mustapha, 2010 L. pneumophila 110⁵, 110⁶, 110⁷, 110⁸ 110⁸ 2.5 μg/mL EMA 110⁵~110⁸ - Pilar et al.,

2009

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