第六章 結果
6.2 real-time qPCR 條件測試：
由於Greisen et al. (1994)係於傳統PCR上測試並開發總細菌之偵測引子，後續 Lee and Levin (2007)則將此引子應用於qPCR，然其所使用的PCR儀器為DNA Engine Opticon® 2 system (MJ Research Corp., Waltham, MA, USA)，與本研究所 使用之儀器Roche LightCycler®480不同。考量qPCR最佳升溫條件、反應試劑與引 子濃度以及最適之DNA template量，可能因使用之儀器廠牌不同而有所不同，故 以選定的引子對(Greisen et al., 1994)搭配不同升溫條件進行測試，並依據其在 Roche LightCycler®480之放大效率及放大曲線，作為定量活性細菌之最佳升溫條 件。
本研究係將 0.5 ng/μL 至 0.5 fg/μL 之 E. coli 標準品作為測試 qPCR 條件之 DNA template。測試條件包括兩組反應試劑引子濃度(5 及 10 μM)與兩組 DNA template 體積(2 及 5 μL) (表 12)，以及三組 qPCR 升溫條件(測試 A：Annealing 溫 度 60°C、Annealing 與 Elongation 升溫速度分別為 2.2°C/s 與 4.4°C/s、測試 B：
Annealing 溫度 60°C、Annealing 與 Elongation 升溫速度分別為 1.1°C/s 與 2.2°C/s 及測試 C：Annealing 溫度 62°C、Annealing 與 Elongation 升溫速度分別為 2.2°C/s 與 4.4°C/s) (詳如表 13)，而其 qPCR 放大效率結果詳如表 14。
本測試主要目的係找出最佳 qPCR 條件，由於測試 I 及測試 II 係找出適當 qPCR 條件，進行比較多次的實驗，因此測試 I 及測試 II 之實驗樣本數與測試 III 到測試 VII 之樣本數不同。
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表 12、反應試劑引子濃度與 DNA template 體積
*: Not applicable
表 13、qPCR 升溫條件測試
Reverse primer
(10 μM) 0.6 0.6 NA NA
Forward primer
(5 μM) NA NA 0.6 0.6
Reverse primer
(5 μM) NA NA 0.6 0.6
DNA template 2 5 2 5
dd water 6.8 3.8 6.8 3.8
Total volume 20 20 20 20
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表 14、qPCR 放大效率測試結果
條件 測試內容
I II III IV V VI VII
Primer concentration 5 μM 10 μM 5 μM 10 μM 10 μM 5 μM 10 μM
DNA volume 2 μL 2 μL 2 μL 2 μL 5 μL 5 μL 5 μL
Annealing temperature
at 60°C ˇ ˇ ˇ ˇ ˇ
Annealing temperature
at 62°C ˇ ˇ
升溫速度 (°C/s) Annealing : 2.2 Elongation : 4.4
ˇ ˇ ˇ ˇ ˇ
升溫速度 (°C/s) Annealing : 1.1 Elongation : 2.2
ˇ ˇ
PCR 放大效率 1.799~1.8 1.842~2.057 1.752 1.768 1.897 1.887 2.103
樣本數 2 4 1 1 1 1 1
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表 14 顯示，當引子濃度為 5 μM 且 DNA 體積為 2 μL，並以 Annealing 溫度 為 60°C 且 Annealing 與 Elongation 升溫速度分別為 2.2 與 4.4 °C/s 進行測試，其 放大效率介於 1.799~1.8 (測試 I，表 14)；將引子濃度增加至 10 μM 而維持 DNA 體積(2 μL)與升溫條件不變(Annealing 為 60°C 且 Annealing 與 Elongation 升溫速 度分別為 2.2 與 4.4°C/s)時，其放大效率介於 1.842~2.057 (測試 II，表 14)，較引 子濃度為 5 μM 時為佳。而在相同 DNA 體積(2 μL)與升溫條件下，若將 Annealing 溫度提升至 62°C，在引子濃度為 5 與 10 μM 時其放大效率各為 1.752 及 1.768 (測 試 III 與 IV，表 14)，顯示放大效率並未因為升高 Annealing 溫度而提升。
此外，表 14 進一步顯示，若將 DNA 體積從 2 μL 提高至 5 μL，在引子濃 度 10 μM、Annealing 溫度為 60°C 且 Annealing 與 Elongation 升溫速度分別為 2.2 與 4.4 °C/s 下進行測試，顯示其放大效率為 1.897 (測試 V，表 14)；若降低 Annealing 與 Elongation 升溫速度至 1.1 及 2.2 °C/s，在相同 DNA 體積(5 μL)與 Annealing 溫度(60°C)下，對於引子濃度為 5 μM 與 10 μM 之 PCR 之放大效率各 為 1.887 及 2.103 (測試 VI 與 VII，表 14)，顯示在引子濃度(10 μM)、DNA 體積 (5 μL)與 Annealing 溫度(60°C)時，降低升溫速度似有較佳的放大效率。由於不同 組別實驗皆呈現良好 PCR 放大曲線圖及檢量線，因此僅以引子濃度為 10 uM、
DNA 體積為 5 μL、Annealing 溫度為 60°C 而 Annealing 與 Elongation 升溫速度分 別為 1.1 及 2.2 °C/s 之放大曲線圖及檢量線顯示之(圖 16 及圖 17)。
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圖 16、於 10 μM 引子與 5 μL DNA 體積下並以 60°C 為 Annealing 溫度且 Annealing 與 Elongation 升溫速度分別為 1.1 與 2.2 °C/s 時之放大曲線圖
圖 17、於 10 μM 引子與 5 μL DNA 體積下並以 60°C 為 Annealing 溫度且 Annealing 與 Elongation 升溫速度分別為 1.1 與 2.2 °C/s 時之檢量線 (R2=0.9994)
綜合上述 PCR 放大效率、放大曲線圖及檢量線之結果，顯示在引子濃度為 10 μM、DNA 體積為 5 μL 且設定 Annealing 溫度為 60°C 而 Annealing 與 Elongation 升溫速度分別為 1.1 及 2.2 °C/s 時有最高之放大效率(表 14)與良好的放大曲線圖 (圖 16)及檢量線(R2=0.9994、圖 17)，因此以此作為定量活性細菌之最佳 qPCR 條件。
0.5 fg/μL 5 fg/μL
50 fg/μL 0.5
pg/μL 5
pg/μL 50 pg/μL
0.5 ng/μL
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6.4 DNA 萃取回收率
為了評估 DNA 萃取試劑對於總細菌之 DNA 萃取效率，本研究使用培養第 二代之 E. coli (ATCC 25922) 以 QIAamp DNA mini Kit 進行 DNA 萃取及 qPCR 定量，另也以 Baclight 搭配顯微鏡計數當作計算回收率之標準值。結果顯示(圖 20)，以 Baclight 所得到的 E. coli 濃度為 5.37 108 cells/mL (±7.21 107)；而 qPCR 所得之 E. coli 濃度為 5.30 108 cells/ mL (±5.23 107)。因此以本實驗使用之萃取 試劑(QIAamp DNA mini Kit)所得之 DNA 萃取試劑萃取平均回收率為 100.78%
(SD = 23.73%)。
圖 20、DNA 萃取效率
1 10 100 1,000 10,000 100,000 1,000,000 10,000,000 100,000,000 1,000,000,000
Baclight/
Microscope
qPCR
Cell concentration, cells/mL
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