選定最佳定量總細菌之引子：

如表 10 所示，目前用於定量總細菌之引子序列分為四組，其中三組曾以不 同細菌或真菌進行引子專一性測試。另考慮引子需僅具有細菌之專一性，故本研 究將此四組序列以 NCBI-BLAST 進行細菌、真菌及古細菌之專一性測試，其結 果整理如表 11。

Bach et al. (2002)的引子共測試了 24 種細菌與 5 種真菌(表 10)，發現其引子 可偵測到 24 種細菌，但不會偵測到 5 種真菌，顯示此組引子對於細菌具有專一 性；然本研究將此引子序列於 BLAST 進行專一性測試，結果顯示其引子會與真 菌 Rhizopus oryzae 及 Morchella esculenta 做結合(表 11)，進一步比對其 DNA 序 列，發現兩株真菌與相對應引子之鹼基對完全一致，顯示若將此組引子用於定量 細菌，可能同時會偵測到上述兩株真菌而影響定量細菌之正確性，故非屬最佳引 子對。另 BLAST 結果顯示，Bartosch et al. (2004)所設計的引子不會偵測到真菌 及古生細菌(表 11)，雖然如此，由於缺乏實驗室細菌專一性之評估(表 10)，故 此組引子亦不納入考慮。而 Nadkarni et al. (2002)雖然測試了 49 種細菌，且其結 果顯示此組引子可偵測到所測試的 49 種細菌，但 BLAST 結果顯示該引子會與 真菌 Hymenopellis incognita、Penicillium chrysogenum 及 Rhizopus oryzae 完全黏 合，因此亦未具細菌專一性。至於 Greisen et al. (1994)則曾針對 110 種細菌進行 實驗室引子測試，顯示對所測試之細菌具專一性(表 10)，雖然在 BLAST 之結果 顯示其會與 Methanococcoides burtonii 古細菌結合，但進一步比對其 DNA 序列，

發現此株古細菌與相對應引子之鹼基對，其引子對(forward and reverse primers) 都各有一個鹼基對與此株古細菌不一樣，因此此組引子恐無法與此株古細菌做有 效的黏合，進而於 qPCR 被放大偵測。

綜合上述結果，由於 Greisen et al. (1994)此組引子曾經過 110 種細菌的測試，

且對於所測試之細菌具有專一性，雖然 BLAST 結果顯示會與 Methanococcoides burtonii 古細菌結合，但進一步比對序列顯示此株古細菌與相對應引子之鹼基對，

都各有一個的鹼基對不一致可能無法有效於 qPCR 被放大偵測，而為能排除此引 子對夾取此株古生細菌之可能性，因此進一步以古生細菌(M. burtonii)作為關鍵

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字在 Web of Science 資料庫查詢 M. burtonii 可能存在之環境地點。結果顯示僅 有兩篇文獻曾在環境中偵測到 M. burtonii；曾在 1992 年被 Franzmann 等人在南 極洲之 1-2°C 之湖水(Ace Lake)水樣分離出(Franzmann et al., 1992)；也曾於 1999 年 Li 等人在日本之 6400 公尺深海沉積物中分離出此株古細菌(Li et al., 1999)；

此結果顯示 M. burtonii 生長於極端環境之可能性較高，然截至目前為止尚未在寒 冷之湖水或海洋以外之環境中發現此株古細菌，因此推測一般環境空氣中，此株 古細菌存在之機會不高。故本研究以 Greisen (1994)之引子為最佳之總細菌之偵 測引子對。

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表 10、定量總細菌之引子序列

*: Not avaiable（未進行專一性實驗測試）

Universal primers 實驗室專一性測試 菌種數量

引子專一性測 試結果

引子應用之環境/

臨床樣本

定性/定量 參考文獻

GGTAGTCYAYGCMSTAAACG 細菌：24 真菌：5

+

- Soil 定量 Bach et al., 2002 GACARCCATGCASCACCTG

TCCTACGGGAGGCAGCAGT

NA* NA Fecal 定量 Bartosch et al.,

2004 GGACTACCAGGGTATCTATCCTGTT

AGGAGGTGATCCAACCGCA

細菌：110 + Cerebrospinal Fluid 定性 Greisen et al., 1994 AACTGGAGGAAGGTGGGGAT

TCCTACGGGAGGCAGCAGT

細菌：49 + 臨床樣本-牙齒 定量 Nadkarni et al.,

2002 GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT

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表 11、定量總細菌之引子於 BLAST 測試結果

Fungi/Archaea Non-bacteria species detected Species detected by Number of non-bacteria

species 參考文獻

Fungi Rhizopus oryzae both primers 2 Bach et al., 2002

Morchella esculenta small subunit ribosomal RNA gene. Archaea Methanococcoides burtonii DSM 6242,

complete genome

此株古細菌與相對應引子之鹼 基對都各有一個鹼基對與此組

引子不同

1

Fungi Hymenopellis incognita 16S ribosomal RNA gene

both primers 3 Nadkarni et al., 2002

Penicillium chrysogenum Wisconsin 54-1255 complete genome

both primers

Rhizopus oryzae both primers

Archaea ND NA ND

*: Not detected

**: Not available

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