第二章 文獻整理
第三節 美白簡介
擁有美麗白皙的肌膚，幾乎是所有女性所嚮往的，今日的社會因環境 汙染、精神壓力、陽光照射及人本身體質變化，所引起的膚色晦暗問題，
遂大量需求美白保養化粧品以預防或改善皮膚的色澤【34】。 一、 膚色的決定因素
皮膚的顏色，主要是由表皮內黑色素（Melanin）、真皮內之胡蘿蔔 素（Carotene）及真皮微血管中之血液所造成。各種人種所含之黑色素 細胞數量大致相等，而皮膚顏色有差別，主要是與黑色素細胞活躍程 度及其製造的黑色素數量及分布情形不同有關【35】。
二、 黑色素的形成機轉
黑色素細胞位於皮膚基底層細胞之間，佔表皮約 4~10％，由胚胎 時期神經脊（neural cret）內的細胞轉移而來。其細胞呈圓形，為多突 起的細胞，呈長條狀不規則的突起，會深入表皮及其他細胞之間。黑色 素細胞可合成黑色素顆粒，分泌黑色素，使人體呈現不同膚色。合成黑 色素顆粒可分為四個時期【36】：
1. 在粗糙內質網上的核醣體中合成前酪胺酸酶，支後進入內質 網腔。
2. 內質網以出芽小泡方式，將前酪胺酸酶轉運到高基氏體進行濃縮，
並包成卵圓形前黑色素小體。
3. 當前酪胺酸酶被活化為酪胺酸酶時，前黑色素小體內即出現黑色素 微粒，該小體則稱為黑色素小體，並被轉運到細胞突起的基部。
4. 隨著黑色素小體內酪胺酸酶催化酪胺酸使黑色素越多時，黑色素小 體輪廓逐漸消失，並移向細胞突起內，固突起內是均質狀的黑色素 顆粒，而細胞體內不含黑色素顆粒而成透明狀。
圖2-6 黑色素行成後，由黑色素小體送至角質細胞示意圖【37】。
三、 黑色素的種類
由於酪胺酸酶會催化酪胺酸行程 3,4-二羫基苯丙酸（DOPA），DOPA 再與洛氨酸酶進行氧化行成 DOPA quinone，而生成的 Dopa chrome 其 代謝物為 Eumalanins，另外，生成的 5-S-cysteinyldopa 其代謝物則為 Pheomalanins。在哺乳動物中，黑色素即可分為真黑色素（Eumelanins）
與褐黑色素（Pheomelanins）此兩種基本形式：
為一種外觀為黑色或棕黑色的含氮元素，廣泛存在於動物體內 如上皮細胞、體毛、羽毛、視網膜、神經等處，通常泛指真黑色素 為黑色素。
（二） 褐黑色素（Pheomelanins）：
為一種外觀為黃色或紅棕色的含硫元素，大多存在於人類的紅 色頭髮以及鳥類的紅、黃等顏色之羽毛處。而Pheomelanin 與 Eumelanin 依不同比例混合，則會呈現不同深淺之黑色樣貌。
由以上黑色素的體內生合成機轉以及因素，我們可得知阻斷黑色素 的生成，可以透過酪胺酸酶的抑制如Arbutin、抑制酪胺酸酶的醣化
（glycosylation）如 glucosamin、抑制黑色素小體將黑色素送到角質細胞 如Niacinamide【38】、螯合同離子、還原黑色素如維生素C 等作用方式。
不過目前最常見的方式為抑制酪胺酸酶。
圖2-7 真黑色素與褐黑色素在體內合成路徑圖【37】。
四、膚色的類型與測量
皮膚顏色乃因性別、年齡、季節、部位以及個人差異等因素而 有所不同。通常老年人色素含量較年輕人多，男性較女性多【39】。照 射紫外線會造成皮膚色素沉著而使皮膚老化、暗沉、膚色變深，一些 研究發現白人的黑色素細胞對於紫外線所造成的DNA 受損較其他人 種敏感【3】。此外，長期曝曬於陽光下的皮膚，與未曝曬前的皮膚相比 較，其黑色素細胞中DOPA 被活化的數目有明顯的增加【40】。
曝曬於陽光會造成曬傷或曬黑等情況，是因為每個人在曝曬於 陽光下對於紫外線產生的感受性不同所造成，感受性越高的人，越容 易被紫外線曬傷。而皮膚的類型與皮膚對紫外線的感受性有關係，以 往文獻中，皮膚主要分成六大類【41】【42】：Type I~VI，膚色最淡的為 Type I，最容易曬傷，而膚色最深的是 Type VI，耐曬程度最高。而皮膚類 型的分類依據為ITA。，ITA。是 1990 年 Chardon 等人使用 CIE（國際 照明委員會）的L＊a＊b＊表色系，來確立皮膚顏色類型與ITA。表色值 對應關係，經由ITA。判定皮膚的類型。而ITA。的計算公式為：
ITA。＝{Arc Tangent[(L＊－ 50) ÷ b ＊]} × 180 ÷ π
皮膚類型
（Susceptibility to skin cancer）
膚色類型（Skin colour categories） ITA。 values
很白 ＞55。
第三章 材料與方法
第一節 儀器設備
1.精密天秤：XT 120A（Precisa）
2.旋轉式減壓濃縮機：VC-7600（Panchum）
3.ELISA reader：Thermo multiskan EX 4.恆溫水浴槽： MT-4896（Panchum）
5.桌上型離心機：Z233 M-2（HERMLE）
6.CO2細胞培養箱：MCO-15AC（SANYO）
7.顯微鏡：Axiovert 40C（ZEISS）
8.桌上型震盪機：Vortex gene2（Scientific Industries）
9.紫外線/可見光分光光譜儀：Spectrophopometer U-2001（Hitachi）
10.無菌無塵操作台：4BH-24（海天）
11.冷凍乾燥機：HD45-12P（KINGMECH）
12.超音波震盪機：DC400H（DELTA）
13.電泳槽：mupid-2plus （ADVANCE）
14.紫外線燈箱：TCP-20M（VILBER LOURMAT）
15.UVB 劑量偵測器：UVB detector PMA2100（SOLOR LIGHT co.）
16.BJL 超微弱冷光分析儀
17.雷射粒徑分布儀：MASTERSIZER 2000（MALVERN）
第二節 藥品與試劑
1. DPPH‧自由基：
1,1-disphenyl-2-picryl-hydrazyl（東京化成株式會社）
2. ABTS+自由基：2,2’-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonnium salt 98％（SIGMA）
3. 過氧化氫：Hydrogen peroxide solution 30％（Riedel- de haen）
4. 酪氨酸酶：Tyrosinase mushroom T3824-50KU（SIGMA）
5. PBS 緩衝溶液： Dulbcco’s Phosphate Buffered Saline（biosera）
6. DMEM 培養基：Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose 1X（GIBCO）
7. DMSO：Dimethyl sulfoxide 99.5％（Riedel- de haen）
8. L-ascorbic acid：L-(+) ascorbic acid 98+％（Lancaster）
9. Trolox：6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl chroman-2-carboxylic acid
（SIGMA）
10. TAE buffer：UltraPure TAE buffer（invitrogen）
11. 乙醇：優質酒精（台灣省菸酒公賣局）
12. 乙酸乙酯：ethyl acetate 99.9％（Mallinckrodt CHEMECAL）
13. 洋菜膠：Agarose S（NIPPON GEN CO.LTD）
15. Marker DNA：λ-Hind III DNA（Takara）
16. pUC DNA：pUC 119 DNA（Takara）
17. 過氧化酶：PEROXIDASE（SIGMA）
18. MTT 染劑：Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide＞97.5％
（SIGMA）
19. B-16 melanoma cell CCRC60030 （食品工業發展研究所）
20. Luminol：3-aminophtalhydrazide（SIGMA）
21. Jojoba oil （君凰生醫科技）
22. Castor oil（君凰生醫科技）
23. Xanthan Gun（君凰生醫科技）
24. Hrdroxy ethyl cellulose solution（君凰生醫科技）
25. 1,3 BG（君凰生醫科技）
第三節 植物萃取與粗分
2006 年 9 月透過誠麗實業股份有限公司（台灣，台北）向加拿大訂購 新鮮冷凍蔓越莓、覆盆子、藍莓各 5 公斤，經冷凍運送至實驗室冷凍保存。
將新鮮上述三種植物之果實清洗瀝乾秤重後，取 2.7 公斤蔓越莓以果汁 機絞碎加入 2 公升浸泡三天後過濾減壓濃縮萃取，重複三次；另取蔓越莓、
覆盆子、藍莓 2 公斤，分別浸於 2 公升 95％乙醇三天後過濾濃縮萃取，重 複三次。之後所得之粗萃取物以冷凍乾燥將溶劑去除後秤重，所得產物為 蔓越莓水粗萃 270.614g、蔓越莓乙醇粗萃 258.72g、覆盆子乙醇粗萃
265.273g、藍莓乙醇粗萃 272.504g，再將上述所粗萃物以分液漏斗用乙酸乙 酯（EA）與水液-液分層萃取，再將以酸乙酯層濃縮，重複至乙酸乙酯層透 明無色為止，萃取物以代號命名之（表3-1）。萃取分離流程如圖所示：圖 3-1 為蔓越莓水萃流程；圖 3-2 為蔓越莓乙醇萃流程；圖 3-3 為藍莓萃取流 程：圖 3-4 為覆盆子萃取流程。
文獻指出，覆盆子一般溶劑浸泡萃取與超音波震盪萃取後，經 HPLC 分析發現，所萃取的成分與含量並無差異【26】；而藍莓經90℃蒸 1 分鐘之後，
所萃得的總花青素與總酚類皆有提高【27】，但又有文獻指出藍莓的成份容易 受熱而分解【18】，所以本篇研究採用一般溶劑浸泡萃取，並不做加熱。
表3-1 萃取物名稱與代號對照表
EA Layer（19.122g） H2O Layer（251.492）
water
filtration、concentrated
Partitioned：H2O/EA
圖3-2 蔓越莓乙醇萃取與分離流程圖
新鮮覆盆子2 公斤
extracts
Residue（265.273g）
EA Layer（21.993g） H2O Layer（243.38g）
95％ enthanol
filtration、concentrated
Partitioned：H2O/EA 新鮮蔓越莓2 公斤
extracts
Residue（258.72g）
EA Layer（22.77g） H2O Layer（235.95g）
95％ enthanol
filtration、concentrated
Partitioned：H2O/EA
圖3-4 藍莓乙醇萃取與分離流程圖 新鮮藍莓2 公斤
extracts
Residue（272.504g）
EA Layer（23.794g） H2O Layer（248.71g）
95％ enthanol
filtration、concentrated
Partitioned：H2O/EA
第四節 活性試驗
一、清除 DPPH‧自由基能力測定【43】本實驗係參考 K.H. wang.等人 2006 年篩選中草藥抗氧化實驗的 方法【43】。DPPH．自由基（1,1-disphenyl-2-picryl-hydrazyl）是一個 穩定的自由基，其甲醇或乙醇溶液在波長517 nm 有最大吸光值。藉 由加入樣品溶液後測量其517 nm 吸光值變化，及可換算出該濃度下 之自由基抑制率。
實驗流程：
Scavenging of Radical,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH‧）assay：
1. 試劑的配置（solution preparation）
a. 精秤 DPPH‧粉末 25 mg。
b. 溶於 1000 mL 的 95％乙醇溶液中（呈紫色），避光冷藏於 4℃
保存。
2. 實驗方法
a. 將 sample 以乙醇配製成 100、50、10、5、1、0.5 mg/mL 之 乙醇溶液，取 10 μL 放入 1.5mL 的小離心管中。
b. 加入 240 μL 之 95％乙醇與 750 μL 之 DPPH 溶液，充份混合 振盪後，於室溫下靜置30 分鐘。
d. 製作扣色組，將 DPPH 溶液以乙醇取代，加入樣品，以扣除 樣品干擾色。
e. 將反應完成後之溶液各取 200 μL 至 96-well 盤中，以 ELISA reader 測定波長 540 nm 之吸光值
f. 以公式換算該濃度下對於 DPPH‧自由基之抑制率 3. 清除 DPPH 自由基能力計算
Scavenging activity％＝
【（control 540 nm OD－sample 540 nm OD）÷control 540 nm OD】×100 Control 540 nm OD：不加樣品的空白組，在波長 540nm 的吸光值。
Sample 540 nm OD：樣品扣除干擾色，在波長 540nm 的吸光值。
二、 清除 ABTS＋．陽離子自由基實驗【44】
本實驗係參考 Osman 等人 2006 年的發表【44】。其原理是ABTS 與 H2O2，在 Peroxidase 的催化下，產生 ABTS+‧自由基，在波長 734 nm 有最大吸光值。因此藉由加入樣品，測定 734 nm 吸光值的 變化，評估其抗氧化能力。
圖3-5 ABTS 與 ABTS+．自由基結構圖。【44】
Scavenging of Radical Cation
2,2’-azinobis-(3-ethybenzothiazolin-6-sulfonic acid)(ABTS‧＋) assay：
1. 試劑配製：
秤取 ABTS 5.4 mg 加去離子水 10 mL
（2） H2O2（濃度 500 μM）：
a. 取 30％ H2O2 60 μL＋去離子水 9.94 mL（此時為 50 mM）。
b. 再由 50 mM H2O2中取100 μL＋去離子水 9.9 mL （即得 500 μM）
（3） Peroxidase（44 unit/mL）：
依照藥品包裝的 unit 決定取用量，以去離子水稀釋成 44 unit/mL。
2. 測定方法：
a. 取 1.5 mL 去離子水加入試管內。
b. 分別加入 ABTS 溶液 250 μL（扣色組不加，以等量去離子水補 足）。
c. 再加入 250 μL H2O2與 250 μL Peroxidase。
d. 利用震盪機將試管中液體混何均勻。
e. 避光靜置一小時。
f. 反應完成後，取出試管，分別再加入已配置好的待測樣品溶液 250 μL。
g. 利用震盪機將試管中液體混合，使其反應 10 分鐘。
h. 製作扣色組，ABTS、H2O2、Peroxidase 以水取代，加入樣品溶液，
以扣除樣品干擾色。
i. 取 1 mL 置於石英樣品槽中。
j. 利用紫外光/可見光分光光度計測定波長 734 nm 的吸光值。
k. 每次處理重複三次
3. 清除 ABTS+．陽離子自由基能力之計算 Scavenging effect ％＝
【（control 734 nm OD－sample734 nm OD）÷control734 nm OD】×100
Control734 nm OD：不加樣品的空白組，在波長 734 nm 的吸光值。
Sample734 nm OD：樣品扣除干擾色後，在波長 734 nm 的吸光值。
三、 體外抑制酪胺酸酶實驗【39】
本實驗方法係參考 N.Baurin 等人在 2002 篩選植物抑制酪胺酸 酶的實驗方法【39】。酪胺酸（L-tyrosin）因酪胺酸酶（Tyrosinase）
的反應催化下，可反應轉變為Dopa 以及 Dopaquinone 的深色物 質，藉由測定反應後產物在波長450 nm 的吸光值，可換算出該濃 度下樣品對酪胺酸酶的抑制作用。
1、試劑的配製：
（1）酪胺酸緩衝溶液（L-Tyrosine buffer solution）：
a. 精秤酪胺酸（L-Tyrosine）0.5 g。
b. 加入磷酸緩衝溶液定容至 100 mL。
c. 均勻混合後，靜置 30 分鐘以上，貯存於 4℃冰箱備用。
d. 實驗時，取上清液使用。
（2）酪胺酸酶溶液（Tyrosinase solution）：
a. 將酪胺酸酶（Tyrosinase 50000unit，SIGMA），溶於緩衝
a. 將酪胺酸酶（Tyrosinase 50000unit，SIGMA），溶於緩衝