第二章 文獻整理
第四節 活性試驗
三、 體外抑制酪胺酸酶實驗
本實驗方法係參考 N.Baurin 等人在 2002 篩選植物抑制酪胺酸 酶的實驗方法【39】。酪胺酸（L-tyrosin）因酪胺酸酶（Tyrosinase）
的反應催化下，可反應轉變為Dopa 以及 Dopaquinone 的深色物 質，藉由測定反應後產物在波長450 nm 的吸光值，可換算出該濃 度下樣品對酪胺酸酶的抑制作用。
1、試劑的配製：
（1）酪胺酸緩衝溶液（L-Tyrosine buffer solution）：
a. 精秤酪胺酸（L-Tyrosine）0.5 g。
b. 加入磷酸緩衝溶液定容至 100 mL。
c. 均勻混合後，靜置 30 分鐘以上，貯存於 4℃冰箱備用。
d. 實驗時，取上清液使用。
（2）酪胺酸酶溶液（Tyrosinase solution）：
a. 將酪胺酸酶（Tyrosinase 50000unit，SIGMA），溶於緩衝 液中，配置成 7 unit /μL。
b. 分裝於 1.5 毫升離心管中，每管 200μL，貯存於－20℃冰 箱備用。
c. 使用時置於碎冰上，以維持其活性。
2、實驗方法：
（1）以純水稀釋配置待測樣品，濃度分別為 10 mg/mL、1 mg/mL、
0.1 mg/mL，並分別取 100 μL 至 1.5 mL 的離心管。
（2）再加入酪胺酸緩衝溶液 900 μL 及酪氨酸酶溶液 70 unit。
（3）負對照組為 1000 μL 酪胺酸緩衝溶液加酪胺酸酶溶液 70 unit。
（4）正對照組為 1000 μL 酪胺酸酶緩衝溶液。
（5）扣色組為 900 μL 酪胺酸酶緩衝溶液加 100 μL 待測樣品溶液。
（6）利用震盪機充分混合所有離心管內溶液。
（7）置於 37℃烘箱中反應 1 小時。
（8）以 ELISA reader 測定 96-well 空盤吸光值。
（9）反應完成後，各取 100 μL 於 96-well 盤中。
（10）利用 ELISA reader，測定波長 450 nm 吸光值。
（11）以上實驗均作三重複。
3、酪胺酸酶抑制率公式：
Tyrosinase inhibition（％）＝
【（Control 450 nm OD－Sample 450 nm OD）÷Control 450 nm OD】×100％
Control 450 nm OD：負對照組吸光值－正對照組。
Sample 450 nm OD：反應後樣品吸光值扣除樣品扣色組吸光值。
四、 以超微弱冷光技術（BJL）評估抑制過氧化氫活性【45】【46】【47】 當過氧化氫與探針（Luminol，3-aminophtalhydrazide
）與 H2O2作用後產生之超微弱冷光，以BJL 超微弱冷光儀偵測。
當超微弱冷光之計數達平衡時（約10-15 分鐘），加入欲測試樣品，若 該樣品有清除過氧化氫能力，則冷光計數會急速下降。可藉由不同計量 產生冷光值的變化來計算IC50值，藉以評估測試樣品的過氧化氫清除能 力。【45】【46】【47】
試劑：
試劑 I：Luminol（3-aminophtalhydrazide）
試劑 II：PBS 緩衝液。
試劑 III：過氧化氫。均冷藏 4℃保存。
1、操作步驟：
a. 以 C14校正工具校正儀器。
b. 取 0.5 mL 試劑 I 放入石英測量杯內。
c. 取 0.5 mL 試劑 II 放入石英測量杯內。
d. 取 0.5 mL 試劑 III 放入石英測量杯內。
e. 搖晃測量杯數次，使測量杯內混合均勻。
f. 將石英測量杯放入機器測定冷光值。
g. 待冷光達平衡後將 10 μL 樣品加入測定冷光值的變化。
h. 等待冷光值再達平衡後，再加入另一劑量樣品，觀察冷光值 再度下降。
2、數據計算：
將冷光變化值除以原始冷光值，即可求得抑制率：
Inhibition（％）＝【（Ainitial－A1）÷Ainnitial】×100％
Ainitial：未加入樣品前機器所讀取之自由基微冷光數值。
A1：加入樣品後機器所讀取之自由基微冷光數值。
五、 以 DNA 電泳評估自由基引發 DNA 損傷之防護作用
H2O2 經光解作用後形成羥基自由基，利用所生成的羥基自由 基攻擊質體DNA【48】，藉此模擬自由基對DNA 的傷害，評估抗氧 化物的參與對於DNA 的保護效果。
pUC119 為環狀雙股螺旋狀的質體 DNA，原始狀態呈 supercoil form (S-form)，受到自由基傷害造成單股斷裂成為 open-circular form(C-form)，若再更進一步受到破壞，兩股斷裂即形成 linear form(L-form)。其能簡易提供 S-form 至 L-form 的型態轉變，便於 評估抗氧化物保護 DNA 的程度，因而選用 pUC119 進行實驗。
由於少量自由基即能造成 pUC119 的斷裂，故另外選用 λ-Hind Ⅲ Marker DNA 一同比較，因需要較強烈的自由基攻擊 Marker DNA 才能被完全打斷。
1、試劑的配置與材料準備：
a. Marker DNA（λ-Hin d III digest）以 PBS 以 1：3 稀釋。
b. pUC 119 DNA 以 PBS 以 1：4 稀釋。
c. H2O2稀釋成0.3％ 。
d. 秤取 Agarose 0.96 g，以 TAE buffer 120 mL 配製成 8 mg/mL 後加熱 至完全溶解，待稍微冷卻後注入膠模製膠。
2、實驗步驟：
a. 取 2 μL DNA 至小離心管中 b. 加入 5 μL H2O2
c. 加入 3 μL sample 溶液後離心 1000 rpm、1min
d. 以事先暖機之 UV 燈管照射 70％功率（Marker 12 分半；PUC 40 秒）
e. 加入 loading dye 3 μL 後離心（1000 rpm 1min）
f. 將所有離心管內液體注射至膠片孔洞中進行跑膠約 65 分鐘。
g. 以 ethidium bromide 染色膠片 30 分鐘後以 UV 燈箱拍照。
h. 將所拍得之照片，利用 Kodak 1D 軟體分析其每條 band 的亮 度，並計算出其自由基清除率及 SC50。
六、 B-16 黑色素瘤細胞之抑制實驗【49】
本實驗係參考 Ching-Yuan Wu 等人 2006 年的發表，藉由 B-16 melanoma cell 加入樣品於培養基的培養，於 72 小時候以波長 450nm 測定其培養基的吸光值以估算黑色素的量【45】。
1、 細胞來源：財團法人食品工業發展研究所 （B-16 細胞 CCRC60030）
2、B-16 黑色素瘤細胞之培養方法：
a. 將 B-16 細胞，以 DMEM medium（內含 10％ Fetal Bovine Serum、1％ PEN-Strep-Amphosol、1％ Non- Essential Amono Acids Solution）培養於培養瓶中。
b. 置於 37℃、5％ CO2 的培養箱中培養。
3、測試方法：
a. 將 B-16 cells 以 Trypsin 均勻懸浮在 DMEM medium 中，再分 別移種在6-well 盤中
b. 置於 37℃、5％ CO2的培養箱中培養一天使其細胞貼附。
c. 將 sample 以無菌 PBS 配置成不同濃度後，以 0.45 μm 的濾膜 過濾。
d. 將樣品溶液加至細胞的 well 盤中，使其 medium 中含樣品濃度 分別為1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL，並製作控制組。
e. 置於 37℃、5％CO2的培養箱中培養三天，並每天拍照紀錄。
f. 從細胞的 well 盤中取 medium 上清液 100 μL 至 96-well 盤中。
g. 用 ELISA reader 測定波長 450 nm 的吸光值。
4、計算公式：
Inhibition（％）＝
【（Control 450 nm OD－Sample 450 nm OD）÷Control 450 nm OD】×100 Control 450 nm OD：不加樣品之空白組，在波長 450 nm 的吸光值。
Sample 450 nm OD：樣品扣除干擾色後，在波長 450 nm 的吸光值。
七、 細胞存活率實驗（MTT assay）【42】
利用 MTT reagent 中 tetrazolium 在活細胞中會被粒腺體的脫氫酵 素（dehydrogenase）還原，而產生紫色 formazan 產物的特性，其在 550 nm 有最大吸收，利用比色法來測定細胞存活率。
當存活細胞越多，產生的 formazan 也越多，在 550 nm 的吸光值 也越大，與已知細胞數的標準線（standard curve）比較，可計算出細 胞存活率。
圖3-6 MTT與NADH的反應機制。MTT可與粒腺體中的NADH作用，將 tetrazolium轉為紫色不溶於水的MTT formazan，結晶於細胞的粒線 體中。
1、 試劑配置：
a. MTT solution：
精秤25 mg MTT 粉末，溶於 100 mL PBS 中。
2、 測定方法：
a. 將 B-16 cells 以 Trypsin 均勻懸浮於 DMEM medium 中，移種至
6-well 盤中。
b. 置於 37℃、5％ CO2的培養箱中培養一天。
c. 以 PBS 配置不同濃度的待測樣品，以 0.45 μm 濾膜過濾。
d. 將已過濾之樣品加入細胞的 well 盤中。
e. 置於 37℃、5％ CO2的培養箱中培養三天。
f. 將細胞的 medium 抽乾，並以 PBS 清洗。
g. 每 well 中加入 MTT solution 1000 μL，於 37℃、5％ CO2的培養箱 中反應一小時。
h. 將 well 中的 MTT solution 抽乾。
i. 於每 well 中加入 DMSO 500μL。
j. 將 DMSO 溶下的紫色溶液，取 100 μL 至 96-well 盤中測定波長 570 nm 的吸光值。
3、 細胞存活率計算：
Cell viability（％）＝
Sample 570 nm OD÷Control 570 nm OD × 100％
Control 570 nm OD：不加樣品之空白組，在波長 570 nm 的吸光值。
Sample 570 nm OD：有加樣品在波長 570 nm 的吸光值。
八、 配方調製
Hydrogenated Castor oil 1％
Squlane 4％
Jojoba oil 4％
Castor oil 4％
Water phase：
Water 45％
Xanthan Gun solution（0.3％） 16.5％
Hrdroxy ethyl cellulose solution（0.3％） 16.5％
1,3 BG 3％
九、 人體有效性評估
依照全臉膚質診斷儀於每週相同時間、固定角度、光源下拍攝 照片，經軟體分析臉部固定範圍，可辨別出五項數值：斑點（Spots）、 紫外線斑（UV spots）、皮膚粗糙程度（Texture）、皺紋（Wrinkles）、
痤瘡桿菌代謝物（Porphylins）、毛孔（Pore），藉由雙盲實驗給予受 試者含有不同萃取物以及安慰劑、對照組的乳液塗抹一個月，並於 每週回測，最後評估膚質改善程度。Spots 是可見光下儀器可辦別的 斑點，包括色澤、大小皆可定量；UV Spots 是在 UVB 光下可見的 斑點，主要位於皮膚深層，將來會慢慢浮現於皮表的斑；Texture 是 儀器辨別臉部皮膚的細微凹凸，評估粗糙程度；Porphylins 是痤瘡桿 菌代謝物，藉由儀器定量後，可估算臉部痤瘡桿菌之多寡；Pore 是 臉部毛孔，儀器可定量毛孔數目，並可放大照片判別毛孔是否擴大 或變小；Wrinkles 是皺紋與細紋，藉由儀器可定量全臉之皺紋與細 紋。
在校園中徵求 12 位女性自願同學進行測試，年齡分佈為 20 至 30 歲，於測試前先以全臉膚質診斷儀進行使用前的數值與資料建 立，空調室溫調整在25℃，並在測試前以洗面乳清洗臉部後擦乾等 待五分鐘後測試，洗面乳統一使用Johnson & Johnson pH 5.5 不含皂
待使用前資料建立後，以抽籤方式隨機分配添加蔓越莓、藍莓、覆 盆子之EA 層、AA2G 乳液以及空白組乳液，且規範每天早晚於洗 臉後使用全臉，為期一個月，期間內所有美白產品停用並且於每週 與初測之相同固定時間回測。
第四章 結果
第一節 抗氧化測試
一、 抑制 DPPH‧自由基結果：
將蔓越莓、藍莓、覆盆子三種植物的不同極性分層萃取物，與 市面上常用的美白、抗氧化劑左旋維他命C（L-Arscorbic acid）對 照各種濃度下清除DPPH‧自由基的效果，結果如表 4-2 所示：SC50, CWC, 0.098 mg/mL、CAC, 0.056 mg/mL、BAC, 0.059 mg/mL、RAC, 0.049 mg/mL、CWW, 0.184 mg/mL、CAW, 0.059 mg/mL、BAW, 0.321 mg/mL、RAW, 0.212 mg/mL、CWE, 0.02 mg/mL、CAE, 0.014 mg/mL、
BAE, 0.027 mg/mL、RAE, 0.0375 mg/mL，而左旋維生素 C, 0.007 mg/mL；由上面數據顯示，經過乙酸乙酯分層萃取（partition）之後 的萃取物，抗氧化效用普遍較強，其中最強的為CAE（SC50, 0.014 mg/mL）。雖然各種植物所萃取的清除 DPPH‧自由基能力不及左旋 維生素C（SC50, 0.007 mg/mL），但左旋維生素 C 為純物質（pure compound），而蔓越莓、藍莓、覆盆子之萃取物為粗萃物（crud extract），若進一部再將其分離，相信效果一定更好。
各種萃取物與左旋維他命 C 的清除 DPPH‧自由基之比較圖如 圖4-1、圖 4-2、圖 4-3 所示。各種萃取物的自由基抑制作用皆表現 出與濃度相關的抑制率（dose depended）。
DPPH‧自由基抑制率（％）
粗 萃 抑 制 DPPH‧ 自 由 基 趨 勢 圖
CWC CAC BAC RAC Trolox
圖4-1 蔓越莓、藍莓、覆盆子之粗萃物抑制 DPPH‧自由基比較圖
CWE CAE BAE RAE Trolox
圖 4-2 蔓越莓、藍莓、覆盆子之 EA 層抑制 DPPH‧自由基比較圖。
水 層 抑 制 DPPH‧ 自 由 基 趨 勢 圖
CWW CAW BAW RAW Trolox
圖4-3 蔓越莓、藍莓、覆盆子之水層抑制 DPPH‧自由基比較圖
二、 抑制 ABTS+‧自由基結果：
將蔓越莓、藍莓、覆盆子三種植物的分層萃取物，和左旋維他命 C 做抑制ABTS+．陽離子自由基清除活性，並求其抑制率 SC50，結果如 表4-3 所示：CWC, 0.1 mg/mL、CAC, 0.086 mg/mL、BAC, 0.077 mg/mL、
RAC, 0.092 mg/mL、CWW, 0.149 mg/mL、CAW, 0.108 mg/mL、BW, 0.097 mg/mL、RW, 0.098 mg/mL、CWE, 0.04 mg/mL、CAE, 0.017 mg/mL、
BE, 0.019mg/mL、RE, 0.039 mg/mL，左旋維生素 C, 0.0008 mg/mL；由 上數據顯示，其清除ABTS+陽離子自由基效果最好為 CAE（SC50, 0.017 mg/mL），其次為BAE（SC50, 0.019 mg/mL），而粗萃物最好為BAC（SC50,
ABTS+陽離子自由基清除率比較，圖4-5 為 EA 層對 ABTS+陽離子自由
粗 萃 物 抑 制 ABTS+自 由 基 比 較 圖
CWC CAC BAC RAC L-ascorbic acid
抑制率(%)
CWE CAE BAE RAE L-ascorbic acid
CWE CAE BAE RAE L-ascorbic acid