第四章 結果
第二節 美白測試
一、 體外測定抑制 Mushroom Tyosinase 結果
將蔓越莓、藍莓、覆盆子三種植物之粗萃與分層萃取物，與市面上常 見的美白成分－左旋維他命 C 做體外酪胺酸酶抑制實驗之比較，測得各萃 取物之抑制率及IC50結果如表 4-7 所示：CWC 為 0.54 mg/mL、CAC, 2.806 mg/mL、BAC, 0.071 mg/mL、RAC, 0.622 mg/mL、CWW, 1.182 mg/mL、CAW, 2.122 mg/mL、BAW, 0.066 mg/mL、RAW, 2.208 mg/mL、CWE, 0.378 mg/mL、
CAE, 0.311 mg/mL、BAE, 0.515 mg/mL、RAE, 0.574 mg/mL；其中先前抗氧 化實驗中表現最佳的蔓越莓乙醇粗萃，在美白方面表現不佳，而藍莓倒是 一枝獨秀，特別在水層及粗萃（IC50, 0.066, 0.071 mg/mL），都遠優於其他植 物以及左旋維他命 C。
Tyrosinase 抑制率（％）
L-ascorbic acid 100.21 40.33 2.88 0.393
表 4-7 蔓越莓、藍莓、覆盆子之各萃取物之 mushroom tyrosinase 活性抑制
CWC CAC BAC RAC L-ascorbic acid
抑制率(%)
1 0.1 0.01 (mg/mL)
圖4-34 粗萃物對 Tyrosinase 抑制與左旋維他命 C 比較圖。
粗萃物於低濃度下抑制酪氨酸酶與 L-ascorbic acid 比較，呈顯著差異，＊：
*
**
** **
**
水 層 抑 制 Tyrosinase比 較 圖
CWW CAW BAW RAW L-ascorbic acid
抑制率(%)
CWE CAE BAE RAE L-ascorbic acid
抑制率(%)
1 0.1 0.01 (mg/mL)
圖4-36 EA 層對 Tyrosinase 抑制與左旋維他命 C 比較圖。
＊：P＜0.01，0.1mg/mL 下相較於 L-ascorbic acid 抑制慮較佳並有顯著差異。
* * *
*
*
二、 抑制 B-16 cells 結果：
將蔓越莓、藍莓及覆盆子之萃取物分別加入已培養於 6-well 盤中的 B16
melanoma cell 之培養液中其濃度分別為 1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL，
並製作空白對照組，發現蔓越莓的水層以及藍莓及覆盆子之粗萃，對於抑
圖4-37 CWC 添加至 B-16 細胞 72 小時後培養基之顏色變化
圖 4-38 CAC 添加至 B-16 細胞 72 小時後培養基之顏色變化
圖 4-39 BAC 添加至 B-16 細胞 72 小時後培養基之顏色變化
1 mg/mL
1 mg/mL
1 mg/mL
0.5 mg/mL
0.5 mg/mL 0.5 mg/mL
0.25 mg/mL
0.125 mg/mL 0.0625 mg/mL 不加樣品
0.25 mg/mL
0.125 mg/mL 0.0625 mg/mL 不加樣品 0.25 mg/mL
0.125 mg/mL 0.0625 mg/mL 不加樣品
圖 4-40 RAC 添加至 B-16 細胞 72 小時後培養基之顏色變化
圖4-41 CWW 添加至 B-16 細胞 72 小時後培養基之顏色變化
1 mg/mL 1 mg/mL
1 mg/mL
0.5 mg/mL
0.5 mg/mL 0.5 mg/mL
0.25 mg/mL
0.125 mg/mL 0.0625 mg/mL 不加樣品
0.25 mg/mL
0.125 mg/mL 0.0625 mg/mL 不加樣品 0.25 mg/mL
0.125 mg/mL 0.0625 mg/mL 不加樣品
圖 4-43 BAW 添加至 B-16 細胞 72 小時後培養基之顏色變化
圖4-44 RAW 添加至 B-16 細胞 72 小時後候培養基之顏色變化
圖4-45 CWE 添加至 B-16 細胞 72 小時後培養基之顏色變化
1 mg/mL 1 mg/mL
1 mg/mL
0.5 mg/mL
0.5 mg/mL
0.25 mg/mL
0.125 mg/mL 0.0625 mg/mL 不加樣品
0.25 mg/mL
0.125 mg/mL 0.0625 mg/mL 不加樣品 0.25 mg/mL
0.125 mg/mL 0.0625 mg/mL 不加樣品 0.5 mg/mL
圖4-46 CAE 添加至 B-16 細胞 72 小時後培養基之顏色變化
圖4-47 BAE 添加至 B-16 細胞 72 小時後培養基之顏色變化
1 mg/mL
1 mg/mL
1 mg/mL
0.5 mg/mL
0.5 mg/mL
0.25 mg/mL
0.125 mg/mL 0.0625 mg/mL 不加樣品
0.25 mg/mL
0.125 mg/mL 0.0625 mg/mL 不加樣品 0.25 mg/mL
0.125 mg/mL 0.0625 mg/mL 不加樣品 0.5 mg/mL
圖4-49 L-ascorbic acid 添加至 B-16 細胞 72 小時後培養基之顏色變化
1 mg/mL 0.5 mg/mL 0.25 mg/mL
0.125 mg/mL 0.0625 mg/mL 不加樣品
第三節 細胞毒性測試
一、 細胞存活率測試（MTT assay）：
將蔓越莓、藍莓及覆盆子之萃取物分別加入已培養於 6-well 盤中的 B16
melanoma cell 之培養液中其濃度分別為 1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL，
並製作空白對照組，經培養三天後測試其細胞存活率已評估細胞毒性，其 中蔓越莓乙醇萃取物之 EA 層、藍莓 EA 層、覆盆子 EA 層細胞毒性較高，
LD50分別為0.554、0.563、0.872 mg/mL，其它萃取物細胞毒性皆低，LD50 均大於 1 mg/mL。，結果呈現於表 4-9。
B16 細胞存活率（％）
LD50分別為0.554、0.563、0.872 mg/mL，其它萃取物細胞毒性皆低，LD50
均大於 1 mg/mL。
250 μg/mL 下的細胞存活率 101.71% 99.00% 101.62% 98.63%
110.71%
CWC CWW CWE CAC CAW CAE BAC BAW BAE RAC RAW RAE L-ascorbic
acid
cell viability (%)
圖4-50 濃度 250μg/mL 下萃取物對細胞的細胞存活率
SC50 (mg/mL) IC50 (mg/mL) LD50 (mg/mL)
B16 melanoma cell viability
第四節 配方調製之均一性與有效性評估
一、以雷射粒徑分布儀測定乳液粒徑：
分別將添加蔓越莓、藍莓、覆盆子之 EA 分層萃取物 2％於乳液配 方中，以雷射粒徑分布儀，靠著雷射光束因通過乳液中乳滴的散射角 度，估計此配方中乳液粒徑之分布之均一性：
（1）配方 A：基本配方＋蔓越莓 EA 層萃取物 2％：
圖4-51 蔓越莓 EA 層萃取添加 2％至配方中粒徑分布圖
（2）配方 B：基本配方＋藍莓 EA 層萃取物 2％：
圖4-52 藍莓 EA 層萃取添加 2％至配方中粒徑分布圖
（3）配方 C：基本配方＋覆盆子 EA 層萃取物 2％：
圖4-53 覆盆子 EA 層萃取添加 2％至配方中粒徑分布圖
（4）配方 D：基本配方＋維生素 C（AA2G）2％：
圖4-54 維生素 C 添加 2％至配方中粒徑分布圖
（5）配方 E：基本配方：
由圖 51~55 之雷射粒徑分布結果，顯示基本配方中乳化的粒徑大 約集中在2~3 μm：而蔓越莓 EA 層萃取物添加於配方中較不影響配方 乳滴大小分佈，約為2~8 μm：藍莓 EA 層萃取物添加於配方中乳滴大 小則增為集中分布於50~100 μm；覆盆子 EA 層加於配方中，則粒徑分 布大致成兩個主要範圍：2~8 μm 與 90~120 μm；維生素 C 對於配方影 響也不大，分布於5~20 μm 之間，由以上結果顯示，三種植物對配方 乳化的均一性。
二、以全臉膚質診斷儀評估受測者膚質：
Type I Type II Type III
圖4-56 受試者膚色類型分布圖 1 人 2 人
9 人
I III
II
（2）實驗四週後結果： 由51 降至 48，改善率 5.9%；Texture 由 117 降至 85，改善率 27.4%；Porphyrins 由 88 降至 68，改善率 22.7%。
5號受測者(蔓越莓)
圖4-60 4 號受測者使用配方添加 2％蔓越莓萃取在斑點有較好改善效果。
圖4-61 11 號受測者使用配方添加 2％蔓越莓萃取在皮膚紋理有較好改善效果。
（4）使用添加藍莓萃取之受測者數值變化：
12號受測者(藍莓)
（5）使用添加覆盆子萃取之受測者數值變化：
（6）使用添加 AA2G 之受測者數值變化：
圖 4-70 1 號受測者使用配方添加 2％覆盆子萃取在痤瘡桿菌有較好改善效果。
（7）使用未添加有效成分之受測者數值變化：
萃取物添加於配方中改善膚質狀況
-60 -40 -20 0 20 40
Spots Pores Wrinkles Texture Porphyrins UV spots
改善率(%)
蔓越莓 藍莓 覆盆子 AA2G 無添加(BASE) 圖4-74 萃取物 in vitro 有效性評估各組平均改善率。
第五章 討論
經過本研究探討，蔓越莓、藍莓、覆盆子不同溶劑萃取分層萃取液在 in vitro 抗氧化、美白研究，發現抗氧化實驗方面，EA 層的效果較粗萃與水
層強；而美白實驗方面，水層與乙醇粗萃較EA 層突出。
以蔓越莓為例，分成水萃以及 95％乙醇萃取後分層，互相比較的結果 之下，發現生物活性方面，普遍乙醇萃取物優於水萃取物，依照判斷，應 是乙醇溶解力較高，極性與非極性之物質都能徹底溶解，而水萃只能溶解 較大極性部分的物質，可能有些具有活性的低極性物質無法萃取得，而究 竟不同溶媒提取到的物質差異在哪邊，本篇研究只針對生化活性上是否有 差異討論，詳細的成分分析，還待各種分析實驗佐證。
抗氧化方面，蔓越莓以及覆盆子都有很好的效果，尤其在乙醇萃取 EA 層的萃取物，特別是蔓越莓 95％乙醇萃取物的 EA 層，許多抗氧化生化活 性都可與左旋維他命 C 相提並論。推測是所含的多酚類物質，造就了如此 優秀的抗氧化能力。
美白方面，藍莓的水層與粗萃物，對於抑制酪氨酸酶的活性，優於蔓 越莓以及覆盆子，並且優於左旋維他命C，在 in vivo 的人體有效性評估中，
藍莓萃取添加於配方中，對於皮膚深層斑以及皺紋的改善顯著。文獻指出 藍莓含有 Resveratrol（白黎蘆醇）【21】，此成分即具有強抗氧化作用，而與本 實驗所研究結果相符合。
蔓越莓對於皮膚紋理有明顯改善；而覆盆子對於皮膚紋理以及斑點與
痤瘡桿菌代謝物改善顯著。
然而本研究－蔓越莓、藍莓、覆盆子均富含花青素，而花青素對膠原 酶（Collagenase）、透明質酸酶（Hyaluronidase）、彈性蛋白酶（Elastase）
都有極佳的抑制作用【33】，因此應用在抗老化保養品中，相信功效可期。
綜觀上述各項結果，蔓越莓、藍莓、覆盆子，不光是可以當保健食品，
也同時具有應用在化粧之保養品上的潛力，若能開發成復方劑型調至於化 粧品中，相信在市場上，一定能掀起另一波商機。
第六章 結論
近年來全球化保養品市場，總離不開抗老化，尤其東方人種地區，更
偏好美白課題。人體皮膚老化最大的元兇莫過於自由基的傷害，自由基除 了紫外線以外，從飲食、環境中，總是無時無刻在對人體威脅著。隨著健 康意識的抬頭，飲食方面講求健康、擦防曬品，似乎已經成為愛美男女性 必做的事了，除了由內而外的防護之外，添加於保養品中的天然植物成分，
也越來越受歡迎，尤其是能夠抗氧化、捕捉自由基的成分，通常都能夠應 用在抗老化產品上，迎合市場的需求。
有鑑於此，為了美白以及抗老這兩個最被大家所重視的問題，本研究 探討了蔓越莓，藍莓，覆盆子這三種植物的萃取物，並探討一系列的抗氧 化以及美白研究，抗氧化方面採用了清除DPPH‧自由基、抑制 ABTS+． 自由基、抑制過氧化氫活性，及DNA 電泳探討保護 DNA 的能力；美白方 面，除了體外的酪胺酸酶抑制時驗以外，還採取了細胞模式來評估美白的 功效。
研究結果發現：
（1）不同溶劑萃取其生物活性亦不同：以乙醇粗萃的粗萃物生物活性上，
效果比水萃來的好（蔓越莓水粗萃與乙醇粗萃清除ABTS+自由基SC50, 0.1, 0.086 mg/mL）；經不同極性溶劑分層萃取之後，在抗氧化方面，EA 層效果 較好（莓乙醇萃取 EA 層 DPPH‧、ABTS+‧清除率SC50, 0.0136, 0.017
mg/mL）；抑制酪氨酸酶、黑色素細胞活性上，乙醇粗萃及水層效果較顯著
（藍莓乙醇粗萃與水層抑制酪氨酸酶 IC50, 0.1, 0.011 mg/mL）
（2）三種植物果實之生物活性：抗氧化活性以蔓越莓及覆盆子較強；美白 活性以藍莓效果較顯著。
（3）in vivo 有效性評估研究中，與 AA2G 做有效性比較，藍莓能有效的減 少皮膚深層的斑點、皺紋，覆盆子能減少皮膚表面斑點與痤瘡桿菌代謝物，
而蔓越莓對皮膚紋理的改善也有相當不錯的幫助。
由於蔓越莓、藍莓、覆盆子調製於劑型具有穩定之有效性，故此三種 植物之果實未來在抗老化及美白化粧品上蠻有開發之潛力。
第七章 參考文獻
1. Aburjai, T.; Natsheh,F.M.“Plants used in cosmetics”. Phytother Res 2003, 17, 987-1000
2. Alex, B.; Asish, C.; Arlan, R. “The role of oxidative damage and stress in aging. ”Mech Ageing Dev 2004,125,811-826
3. Yohn J. J.; Lyons M. B.; Norris D. A.; “Cultured human melanocytes from black and white donors have different sunlight and ultraviolet A radiation sensitivities.” J. Invest. Dermatol 1992 100, 23-26
4. Simone D.; Stacy, G.; Ajay P. S.; Nicholi, V. Karen, S.; William, H. B.; Hyun, K.“Inhibitory effects of cranberry polyphenols on formation and Acidogenicity of Streptococcusmutans biofilms.”FEMS Microbiol Lett 2006, 257, 0–56
5. Howell, A.B.; Vorsa, N.; Marderosian, A.D.; Foo, L.Y. “Inhibition of the Adherence of P-Fimbriated Escherichia coli to Uroepithelial-Cell Surfaces by Proanthocyanidin Extracts from Cranberries” N Engl J Med 1998, Correspondence, 339: 1085
6. 呂正傑，蔓越莓汁之體外生物活性及調節人體血脂之研究，中
Christine, S.; John F. L. “Cancer prevention with freeze-dried berries and
Christine, S.; John F. L. “Cancer prevention with freeze-dried berries and