嘉南藥理科技大學化粧品科技研究所碩士論文

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嘉南藥理科技大學化粧品科技研究所

碩士論文

蔓越莓、藍莓及覆盆子之生物活性及在保養品之應用 The Bioactivity and Effectivity in Cosmetics of

Cranberry, Blueberry and Raspberry.

指導教授：陳榮秀博士研究生：楊仲平

中華民國九十七年七月二十二日

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嘉南藥理科技大學化粧品科技研究所 Institute of Cosmetic Science

Chia-Nan University of Pharmacy and Science

碩士論文

Thesis for the Degree of Master

蔓越莓、藍莓、覆盆子之生物活性及在保養品之應用 The Bioactivity and Effectivity in Cosmetics of

Cranberry, Blueberry and Raspberry.

指導教授：陳榮秀博士研究生：楊仲平

中華民國九十七年七月二十二日

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本授權書所授權之論文全文電子檔案，為本人於嘉南藥理科技大學，撰寫之碩士學位論文。(以下請擇一勾選)

以非專屬、無償授權嘉南藥理科技大學圖書館和國家圖書館。基於推動「資源共享、互惠合作」之理念，於回饋本校與社會作為學術研究目的之用，得不限地域、

時間與次數，以紙本、光碟、學位論文全文系統、網路或其他各種方法收錄、重製、與發行，或再授權他人以各種方法重製與利用，以提供讀者基於個人非營利性質之線上檢索、閱覽、下載或列印。

研究生簽名：___________ ______________________

論文名稱：___蔓越莓蔓越莓蔓越莓、蔓越莓、、、藍莓及覆盆子之生物活性及在保養品之應用藍莓及覆盆子之生物活性及在保養品之應用藍莓及覆盆子之生物活性及在保養品之應用藍莓及覆盆子之生物活性及在保養品之應用___

指導教授：_____ ____陳榮秀陳榮秀陳榮秀陳榮秀_________________

系所：__________化粧品科技研究所化粧品科技研究所化粧品科技研究所化粧品科技研究所__________

學號：_______________G9518006G9518006G9518006G9518006___________________

日期：民國______979797__年___7777____月___2397 2323____日 23

_____________________________________________________________________

同意立即開放

同意一年後開放，原因是：___________________________

同意二年後開放，原因是：___________________________

同意三年後開放，原因是：

___________________________________________________

嘉南藥理科技大學碩士論文全文電子檔案上網授權書

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謝誌

如果就讀粧品所只是學習科學研究的方法，那過程必定缺了些精采。如果撰寫論文只是一人單打獨鬥的成果，那過程一定少了些溫暖。很高興我在粧品所學到不僅僅是科學的研究方法，更感激我的論文一路走來得到許多人的幫助，這些人，我要在下文中，慎重而真誠地感謝您們。

本論文承蒙恩師陳榮秀教授兩年多來的指導與薰陶，除了學業上的授業解惑外，還有生活細節的叮嚀與照顧，尤其在論文撰寫期間，

感謝恩師不厭其煩地逐字逐句指正，耐心地教導我在數據當中找到價值。恩師之悉心指導與諄諄教誨，吾生在為人處世及研究態度上受益良多，感激之情不能盡言，特此敬致最誠摯之謝忱。

感謝本系林清宮老師多方面的熱心協助與討論，以及研究室長穎、聖哲、慧敏等同學在實驗上之砥礪協助。

由衷感謝王貴弘老師代測核磁共振並且給予我無私的指導與鼓勵，楊朝成院長、黃明星老師提供寶貴意見、經驗分享以及精神上的鼓勵，感謝黃昭菱老師特地撥冗替我口試，並細心的指正。

兩年來家人是我精神上最大的支柱，父母與親戚朋友們給我滿滿的祝福與支持，讓我能秉持堅定信心與毅力，才能完成本研究，藉此致上萬分的感激。

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摘要

目前市面上化粧品多傾向應用天然物萃取為原料或添加劑，蔓

越莓（Cranberry）、藍莓（Blueberry）以及覆盆子（Raspberry）近幾年來，被廣泛的運用在保健食品以及健康訴求的果汁飲料，根據文獻表示，它們除了營養價值高以外，更包含許多的抗氧化物質。

因此，本研究將探討這三種植物果實萃取物，以不同極性之溶劑分配分離後，測試其抗氧化、美白、以及細胞毒性等活性，並予以比較；實驗中，我們將蔓越莓分別以酒精與水粗萃後得到水粗萃

（CWC）、水萃水層（CWW）、水萃乙酸乙酯層（CWE）、乙醇粗萃

（CAC）、乙醇萃水層（CAW）及乙醇萃取乙酸乙酯層（CAE）；而藍莓以乙醇粗萃後得到粗萃（BAC）、水層（BAW）以及乙酸乙酯層

（BAE）；覆盆子亦以乙醇粗萃得到粗萃（RAC）、水層（RAW）、乙酸乙酯層（RAE）。

結果顯示，經過各種抗氧化以及美白、細胞毒性實驗後，發現清除DPPH．自由基效果最好為蔓越莓乙醇萃取乙酸乙酯層（CAE）（SC50, 0.0197mg/mL）；清除 ABTS⁺．自由基效果最好為蔓越莓乙醇萃取乙酸乙酯層（CAE）與藍莓乙醇萃取乙酸乙酯層（BAE）（SC50, 0.017, 0.019mg/mL）；抑制過氧化氫活性效果最好為蔓越莓水萃乙酸乙酯層

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0.011mg/mL）；以Puc DNA 電泳評估抗氧化能力效果最好為蔓越莓乙醇萃取乙酸乙酯層（CAE）（SC50, 0.88mg/mL）；以 λ-Hind III marker DNA 電泳評估抗氧化能力效果最好為藍莓乙醇萃乙酸乙酯層（BAE）

（SC50, 3.72mg/mL）；抑制 Tyrosinase 效果最好為藍莓乙醇粗萃

（BAC）（IC50, 0.034mg/mL）；抑制B16 melanoma cells 分泌黑色素效果最好為蔓越莓乙醇萃水層（CAW）、藍莓乙醇粗萃（BAC）、覆盆子乙醇粗萃（RAC）（IC50約為 1mg/mL）；細胞存活率除了各果實乙醇萃乙酸乙酯層LD50為0.554~0.872mg/mL 以外，其於細胞毒性皆低

（LD50＞1mg/mL）。

根據本實驗各種結果可推知，三者天然果實抗氧化能力都很好，

尤其以蔓越莓最佳，而酒精萃取的效果又比水萃來的好，藍莓在美白活性上及抑制黑色素細胞都都顯示出較好的效果。所以蔓越莓、覆盆子萃取物，其安全性高故未來可開發在添加於化妝品中作為抗氧化

（抗老化）的活性成分，而藍莓萃取物則適合開發為美白功效的成分。

關建字：蔓越莓、藍莓、覆盆子、美白、抗氧化、DNA 保護

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Abstract

The application of natural product as a component of the cosmetic product is a trend at present in the cosmetic industry. Cranberries, Blusberries and Rspberries are widespread application in heathy foods or drinks. According to literature, they not only have nutrients but also antioxidants.

Therefore, the aim of this research is extract these fruits by different solvent and investigate its whitening, antioxidation, and cytotoxicity. In my research, the water crud of Cranberry （CWC）was divided into H₂O layer from water crude（CWW）and eathyl acetate layer from water crude

（CWE）; enthanol crude extract of Cranberry（CAC）was divided into H₂O layer from enthanol crude extract（CAW）and eathyl acetate layer from enthanol crude extract（CAE）; the enthanol crude extract of Blueberry（BAC）has been divided into H₂O layer（BAW）and eathyl acetate layer（BAE）; the enthanol crude extract of Raspberry（RAC）

has been divided into H2O layer（RAW）and eathyl acetate layer（RAE）.

Our results indicated that the CAE showed the minimum scavenge concentration in DPPH radical assay（SC₅₀, 0.0197mg/mL）; CAE and BAE showed the minimum scavenge concentration in TEAC assay（SC₅₀, 0.017and 0.019 mg/mL）. To determine whether antioxidants protect pUC119, λ-Hind Ⅲ Marker DNA, CAE and BAE have good pUC 119 and λ-Hind Ⅲ Marker DNA protection ability（SC₅₀, 0.88 and 3.72 mg/mL ） . BAC has the best Tyrosinase inhibition （ IC₅₀, 0.034mg/mL）.CAW, BAC, RAC could inhibit B-16 melanoma cells

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extrat of others have low cytotoxicity（LD₅₀＞1mg/mL）.

Based on our results, the Cranberry, Blueberry and Raspberry have siginificant antioxidation ability; Blueberry in whittening test have the best effentiveness. They could be regarded as a component of a cosmetic product with whittening, antiaging fuctions.

Keywords：Cranberry; Vaccinium sp.; Blueberry; Cyanococcus sp.;

Raspberry; Rubus idaeus.; Antioxidant; Whitting; DNA protection.

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目錄

頁次謝誌………..….….I 中文摘要………..….…II 英文摘要……….…….IV 目錄……….…….VI 圖目錄………...…...IX 表目錄………..……...XII 第一章序論

第一節前言………..……1

第二節研究動機與目的………..……3

第三節實驗架構………..……4

第二章文獻整理 第一節植物介紹……….…….4

一、蔓越莓……….….….4

二、覆盆子……….……..…8

三、藍莓……….……….10

第二節自由基……….………13

第三節美白簡介……….16

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第三章實驗材料與方法

第一節儀器與設備………22

第二節藥品與試劑………23

第三節植物萃取與粗分 ………..25

第四節活性試驗………29

一、清除DPPH‧自由基能力測定……….….….29

二、清除ABTS‧^＋陽離子自由基實驗………..……...31

三、體外抑制酪胺酸酶實驗………..……34

四、以超微弱冷光技術（BJL）評估過氧化氫自由基抑制率..36

五、以DNA 電泳評估自由基對 DNA 損傷之防護作用….…38 六、 B-16 黑色素瘤細胞之抑制實驗………..…...40

七、細胞存活率實驗（MTT assay）………..42

八、配方調製………..……44

九、人體有效性評估………..………45

第四章結果 第一節抗氧化測試……….……….…..48

一、抑制DPPH‧自由基結果……….……48

二、抑制ABTS⁺‧自由基結果………..…..51

三、以BJL 測定抑制 H202自由基結果……….…..54

(12)

四、以DNA 電泳評估抑制羥基自由基……….58

第二節美白測試………70

一、體外測定抑制Mushroom Tyosinase 結果……….…..70

二、抑制B-16 melanoma cells 結果……….….…..73

第三節細胞毒性測試一、細胞存活率測試（MTT assay）……….….79

第四節配方調製之均一性與有效性評估一、以雷射粒徑分布儀測定乳液粒徑………82

二、以全臉膚質診斷儀評估受測者膚質………84

第五章討論... ………..…..96

第六章結論………..…………98

第七章參考文獻………..…..……100

(13)

圖目錄

頁次

圖2-1 本實驗所採用的蔓越苺果實。………..4

圖2-2 蔓越莓中主要的黃酮類化合物。………..7

圖2-3 本實驗採用的覆盆子果實。………..8

圖2-4 本實驗所採用的藍莓果實。……….10

圖2-5 自由基與氧化壓力造成老化示意圖。………16

圖2-6 黑色素行成後，由黑色素小體送至角質細胞示意圖。………18

圖2-7 真黑色素與褐黑色素在體內合成路徑圖。………20

圖3-1 蔓越莓水萃取與分離流程圖。………27

圖3-2 蔓越莓酒萃取與分離流程圖。………27

圖3-3 覆盆子酒萃取與分離流程圖。………28

圖3-4 藍莓酒萃取與分離流程圖。………28

圖3-5 ABTS 與 ABTS+自由基結構圖。……….31

圖3-6 MTT 與 NADH 的反應機制。………..42

圖4-1 蔓越莓、藍莓、覆盆子之初萃物清除 DPPH‧自由基比較圖。…50 圖4-2 蔓越莓、藍莓、覆盆子之 EA 層清除 DPPH‧自由基比較圖。….50 圖4-3 蔓越莓、藍莓、覆盆子之水層清除 DPPH‧自由基比較圖。……51

圖4-4 蔓越莓、藍莓、覆盆子之初萃物清除 ABTS⁺‧自由基比較圖。…53 圖4-5 蔓越莓、藍莓、覆盆子之 EA 層清除 ABTS⁺‧自由基比較圖。…53 圖4-6 蔓越莓、藍莓、覆盆子之水層清除 ABTS⁺‧自由基比較圖。……54

圖4-7 蔓越莓、藍莓、覆盆子初萃抑制過氧化氫比較圖。……….56

圖4-8 蔓越莓、藍莓、覆盆子之水層抑制過氧化氫比較圖。………..…….56

圖4-9 蔓越莓、藍莓、覆盆子之 EA 層抑制過氧化氫比較圖。…………..57

圖4-10 蔓越莓水初萃（CWC）－保護 pUC 119 DNA 電泳圖。……….60

圖4-11 蔓越莓酒初萃（CAC）－保護 pUC 119 DNA 電泳圖。……….…60

圖4-12 藍莓初萃（BAC）－保護 pUC 119 DNA 電泳圖。………….….…60

圖4-13 覆盆子初萃（RAC）－保護 pUC 119 DNA 電泳圖。……….….…60

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圖4-14 蔓越莓水萃水層（CWW）－保護 pUC 119 DNA 電泳圖。……...61 圖4-15 蔓越莓酒萃水層（CAW）－保護 pUC 119 DNA 電泳圖。…….…61 圖4-16 藍莓水層（BW）－保護 pUC 119 DNA 電泳圖。………61 圖4-17 覆盆子水層（RW）－保護 pUC 119 DNA 電泳圖。………61 圖4-18 蔓越莓水萃 EA 層（CWE）－保護 pUC 119 DNA 電泳圖。……..62 圖4-19 蔓越莓酒萃 EA 層（CAE）－保護 pUC 119 DNA 電泳圖。….…..62 圖4-20 藍莓 EA 層（BE）－保護 pUC 119 DNA 電泳圖。……….62 圖4-21 覆盆子 EA 層（RE）－保護 pUC 119 DNA 電泳圖。……….62 圖4-22 蔓越莓水初萃（CWC）－保護 Marker DNA 電泳圖。…………..64 圖4-23 蔓越莓酒初萃（CAC）－保護 Marker DNA 電泳圖。………64 圖4-24 藍莓初萃（BAC）－保護 Marker DNA 電泳圖。………65 圖4-25 覆盆子初萃（RAC）－保護 Marker DNA 電泳圖。………65 圖4-26 蔓越莓水萃水層（CWW）－保護 Marker DNA 電泳圖。……….66 圖4-27 蔓越莓酒萃水層（CAW）－保護 Marker DNA 電泳圖。………..66 圖4-28 藍莓水層（BAW）－保護 Marker DNA 電泳圖。……….67 圖4-29 覆盆子水層（RAW）－保護 Marker DNA 電泳圖。……….67 圖4-30 蔓越莓水萃 EA 層（CWE）－保護 Marker DNA 電泳圖。………68 圖4-31 蔓越莓酒萃 EA 層（CAE）－保護 Marker DNA 電泳圖。………68 圖4-32 藍莓 EA 層（BAE）－保護 Marker DNA 電泳圖。………69 圖4-33 覆盆子 EA 層（RAE）－保護 Marker DNA 電泳圖。….…………..69 圖4-34 初萃物對 Tyrosinase 抑制與左旋維他命 C 比較圖。………..………71 圖4-35 水層對 Tyrosinase 抑制與左旋維他命 C 比較圖。………72 圖4-36 EA 層對 Tyrosinase 抑制與左旋維他命 C 比較圖。………..72 圖4-37 CWC 添加至細胞後 72 小時候培養基之顏色變化。…….……….74 圖4-38 CAC 添加至細胞後 72 小時候培養基之顏色變化。……….…….74 圖4-39 BAC 添加至細胞後 72 小時候培養基之顏色變化。……….…….74

(15)

圖4-41 CWW 添加至細胞後 72 小時候培養基之顏色變化。……….75

圖4-42 CAW 添加至細胞後 72 小時候培養基之顏色變化。……….75

圖4-43 BAW 添加至細胞後 72 小時候培養基之顏色變化。………76

圖4-44 RAW 添加至細胞後 72 小時候培養基之顏色變化。……….76

圖4-45 CWE 添加至細胞後 72 小時候培養基之顏色變化。……….76

圖4-46 CAE 添加至細胞後 72 小時候培養基之顏色變化。………..77

圖4-47 BAE 添加至細胞後 72 小時候培養基之顏色變化。……….77

圖4-48 RAE 添加至細胞後 72 小時候培養基之顏色變化。……….77

圖4-49 L-ascorbic acid 添加至細胞後 72 小時候培養基之顏色變化。…78 圖4-50 濃度 250μg/mL 下萃取物對細胞的細胞存活率…………....80

圖4-51 蔓越莓 EA 層萃取添加 2％至配方中粒徑分布圖。……….81

圖4-52 藍莓 EA 層萃取添加 2％至配方中粒徑分布圖。……….81

圖4-53 覆盆子 EA 層萃取添加 2％至配方中粒徑分布圖。………..82

圖4-54 維生素 C 添加 2％至配方中粒徑分布圖。………82

圖4-55 基本配方中粒徑分布圖。………….………...82

圖4-56 受試者膚色類型分布圖。…………..………..84

圖 4-57 4 號受測者使用添加蔓越莓萃取 2％之配方四週數值的變化。…86 圖 4-58 5 號受測者使用添加蔓越莓萃取 2％之配方四週數值的變化。…87 圖 4-59 11 號受測者使用添加蔓越莓萃取 2％之配方四週數值的變化。..87

圖4-60 4 號受測者使用配方添加 2％蔓越莓萃取在斑點有較好改善效果。 ………...88

圖4-61 11 號受測者使用配方添加 2％蔓越莓萃取在皮膚紋理有較好改善效果。………88

圖 4-62 6 號受測者使用添加藍莓萃取 2％之配方四週數值的變化。……89

圖 4-63 7 號受測者使用添加藍莓萃取 2％之配方四週數值的變化。……89

圖 4-64 12 號受測者使用添加藍莓萃取 2％之配方四週數值的變化。…..90 圖4-65 6 號受測者使用配方添加 2％藍莓萃取在痤瘡桿菌有較好改善效

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果。……….90 圖 4-66 1 號受測者使用添加覆盆子萃取 2％之配方四週數值的變化。….91 圖 4-67 9 號受測者使用添加覆盆子萃取 2％之配方四週數值的變化。…..91 圖 4-68 2 號受測者使用添 AA2G 2％之配方四週數值的變化。…….……92 圖 4-69 10 號受測者使用添 AA2G 2％之配方四週數值的變化。……..…..92 圖4-70 1 號受測者使用配方添加 2％覆盆子萃取在痤瘡桿菌有較好改善效果。………....…93 圖4-71 1 號受測者使用配方添加 2％覆盆子萃取在皮膚紋理有較好改善效果。

………....….…93 圖 4-72 3 號受測者使用未添加有效成分之配方四週數值的變化。…....…94 圖 4-73 8 號受測者使用未添加有效成分之配方四週數值的變化。…...94 圖4-74 萃取物 in vitro 有效性評估各組平均改善率。……...…….……95

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表目錄

頁次

表2-1 皮膚的類型………...……22

表2-2 ITA^。值與皮膚類型對照表……….22

表3-1 萃取物名稱與代號對照表………...………..26

表3-2 乳液成分配方與比例。……….44

表4-1 蔓越苺、藍莓、覆盆子萃取物之代號。………...….…..47

表4-2 蔓越莓、藍莓、覆盆子萃取物 DPPH‧自由基之清除率。...….49

表4-3 蔓越莓、藍莓、覆盆子萃取物對於 ABTS⁺自由基清除率。………52

表4-4 蔓越莓、藍莓、覆盆子萃取物對過氧化氫之清除率。………..…..55

表4-5 蔓越莓、藍莓、覆盆子之各萃取物以 pUC 119 DNA 電泳評估抑制 OH‧自由基之抑制率。………..…….59

表4-5 蔓越莓、藍莓、覆盆子之各萃取物以 λ-Hind III marker DNA 電泳評估抑制OH‧自由基之抑制率。……….………63

表4-7 蔓越莓、藍莓、覆盆子之各萃取物之 mushroom tyrosinase 活性抑制率。………..……71

表4-8 蔓越莓、藍莓、覆盆子之各萃取物對於 B16 melanoma cells 之黑色素產生抑制率。………..………73

表4-9 蔓越莓、藍梅、覆盆子之各萃取物之細胞存活率。………80

表4-10 萃取物 in vitro 生物活性半數有效劑量總表。………...………81

表4-11 受試者手臂內側之 L*a*b*值、ITA^。與膚色類型。…...………85

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第一章緒論

第一節前言

中草藥係我國固有國粹，傳統中藥之使用歷史悠久，故世界各國越來越重視天然藥物的開發。根據中華民國經濟部表示：2000 年全球中草藥銷售額已超過 200 億美元，並且正以每年 10% 的速度成長。且在 2000 年 8 月 10 日美國食品暨藥物管理局 ( Food and Drug Administration, FDA )公佈

「植物藥產品審查準則草案」( Guidance for Industry-Botanical Drug

Products-Draft Guidance ) 之後，植物藥品正式列入 FDA 管理範圍，因此中草藥在全球市場迅速發展，更為世界各國掀起一股草藥研發及應用熱潮。

且 2008 年經濟部工業局將化粧品、保養品產業列入國家重點發展。

隨著人們生活品質不斷的提高、科技不斷進步，回歸自然的聲浪，也應聲而起，添加天然植物萃取的保養品、食品，儼然是目前消費者挑選商品的首選，所以各大保養品廠商，積極研究有效的各種天然植物成分之療效及在化粧品之應用^【¹^】。

本研究乃探討三種植物－蔓越莓（Vaccinium sp.）、覆盆子（Rubus idaeus）、藍莓（Cyanococcus sp.）的不同萃取方式所取得之萃取物之生物 活性比較，以期提供爾後應用在化粧品上的價值參考。

(19)

第二節研究動機與目的

近年來化粧品科技的蓬勃發展，經濟部工業局也將化粧品保養品產業列入 2008 年國家重點發展。天然成分添加於化粧品中，已成為趨勢。

而蔓越莓、覆盆子與藍莓這三種植物，近幾年來常被運用在添加於保健食品中，例如永信藥品代理日本的健康食品，常可見到藍莓萃取的添加，

蔓越莓以及覆盆子也被添加在一些營養補充品以及保養品中，但其成分之生物活性相關文獻偏少。

美麗、健康、自然是大眾之訴求，由文獻得知，隨著年齡的增加，人體氧化壓力也越大，而氧化壓力及自由基是老化的主因^【²^】，而肌膚的美白關鍵與黑色素的生合成中抑制酪氨酸酶之活性有緊密之關係^【³^】。

有鑒於此，本研究將蔓越莓、覆盆子與藍莓利用萃取溶劑的不同，所取得之萃取物，探討其各種生物活性，並利用各種抗氧化、捕捉自由基以及抑制酪胺酸酶的實驗劑型調製做人體測試有效性評估，建立一套完整的天然物萃取應用於化妝品的生化活性及人體有效性測試平台。

(20)

第三節實驗架構

新鮮植物之果實

以乙醇與H2O 萃取

EA 層粗萃水層

partition

生物活性評估、成份分析

抗氧化測試美白測試細胞測試成分分析

DPPH ‧自由基抑制實驗 ABTS +自由基抑制實驗過氧化氫自由基抑制實驗 DNA 保護實驗 Mushroom Tyrosinase 抑制 B-16 melanoma cell 抑制細胞存活率 - MTT assay LC-MS-MS 指標成分分析 HPLC 建立指紋圖譜

產品配方調製

人體有效性評估（全臉膚質診斷儀）

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第二章文獻整理

第一節植物介紹

一、蔓越莓：

圖2-1 本實驗所採用的蔓越苺果實蔓越莓在植物界的分類是：

被子植物門 (Magnoliophyta)

雙子葉植物綱 (Magnoliopsida) 杜鵑花目 (Ericales)

杜鵑花科 (Ericaceae) 越橘屬 (Vaccinium)

蔓越莓又稱小紅莓，生長在矮藤小而圓的酸澀鮮紅果實，性喜高酸性砂土，每年春天開花，9 月至 11 月採收，由於花形像鶴所以取名

「Cranberry」。美國醫學會期刊（JAMA），於 2002 六月份出版的研究報告中指出，經常飲用蔓越莓汁，將有助於保護人體免於遭受某些產

(22)

生抗藥性細菌，所導致之泌尿道感染症狀^【⁴^】。美國藥典（USP）也記載著蔓越莓有這種功效。對於婦女常見的尿道感染預防十分有效，故市面上各種以蔓越莓製成的果汁或錠狀製劑的營養補充品，也都有標榜具有預防泌尿道感染的功效。新英格蘭醫學期刊的發表研究證實，

蔓越莓中含有青花素（proanthocyanidins）或稱濃縮單寧酸（condensed tannins）^【⁵^】。這份報告中一再表示，若長期飲用蔓越莓汁，可以在這些細菌危害人體前，就可以順利將它們排出體外。

中山醫學大學營養學研究所的研究顯示，蔓越莓汁之酚類化合物主要存在於乙酸乙酯（EA）層中，蔓越莓汁及其 EA 層皆具有抗氧化性、自由基清除活性以及抑制環氧化酵素-2（COX-2）活性之功效，且隨劑量呈正相關，而以 EA 層的效果最佳^【⁶^】。另外，經過人體試驗之後，發現每天飲用 27%蔓越莓汁 660mL 並且連續飲用 10 週，確實可有效增加人體之抗氧化能力並增加低密度脂蛋白（LDL）之氧化耐受性，而主要之作用成分可能是蔓越莓汁中的酚類化合物^【⁶^】。

根據台北護理學院的研究，每日早晚各給予尿道炎患者蔓越莓果汁 165 mL，十二週後，發現尿道細菌感染率有明顯的降低，與國外的研究相呼應，證明了蔓越莓能夠防止大腸桿菌等細菌附著在尿道，達到預防泌尿道感染的功效^【⁷^】。

(23)

化能力相當的強，而Ellagic acid 經研究證實可抑制 LDL 引發血管平滑肌細胞增生及凋亡作用^【⁸^】，國外研究並指出富含Ellagic acid 的水果有抗癌的作用^【⁹^】。

對於格蘭氏陰性菌引起的牙周病，所造成的牙齦組織壞死，主因是發炎的細胞分泌了金屬蛋白酶（MMPs）與彈性蛋白酶（Elastase），

對於 MMPs 與 Elastase，蔓越莓的萃取物也有很高的抑制作用^【¹⁰^】，另外對於牙菌斑產酸酵素（GTFs）B 型與 C 型（GTF-B、GTF-C）以及細菌粒線體上之F 型傳輸蛋白（F-ATPase）也有抑制作用^【⁴^】。

而蔓越莓含有的馬來酸（maleic acid）對於抑制人類肝癌細胞

（HepG2）有很好的作用，而 ursolic acid 可以抑制人類乳癌細胞

（MCF-7）^【¹¹^】，所以無論是將蔓越莓應用在保健口腔衛生、牙齒健康，

或是預防泌尿道疾病，甚至是預防癌症、心血管疾病、捕捉自由基，

文獻報告都有很好的功效，所以蔓越莓應用於化粧品配方中，也將會有很好的功效。

(24)

圖 2-2 蔓越莓中主要的黃酮類化合物。FLAV 為黃酮（flavonols），A 為花青素（anthocyanins），PAC 為原花青素（proanthocyanidins）

(25)

二、覆盆子

圖2-3 本實驗採用的覆盆子果實覆盆子在植物界的分類是：

雙子葉植物綱 (Magnoliopsida) 薔薇目 (Rosales)

薔薇科 (Rosaceae)

薔薇亞科 (Rosoideae) 懸鉤子屬 (Rubus) 覆盆子(idaeus) 覆盆子是一種紅色漿果，外形類似野生草莓，略有甜味，生長於溫帶地區，歐洲、北美、紐澳均有生產。覆盆子與蔓越莓、藍莓類似，含有豐富的營養價值以及抗氧化物質^【¹²^】，在食品用途上常被用來調製果醬，做為冰淇淋、蛋糕等食品之佐料。經研究證實覆盆子具有抑制金屬蛋白酶MMP-1

(26)

及MMP-9活性的成份，在皮膚炎的治療或是加速皮膚傷口癒合上有著相當的潛力^【¹³^】。文獻報告給予齧齒類動物每日進食量5％的新鮮冷凍的覆盆子，

可以降低化學引發的食道癌30~60％，即降低直腸癌達80％，其效果優於草苺^【⁹^】。

在in vitro的實驗中，發現覆盆子的乙醇萃物對於突變敘利亞倉鼠胚胎細 胞（SHE）有抑制作用，口服後有選擇性的抑制癌前細胞（pre-malignant cell）

以及突變細胞（malignant cell）又不影響正常細胞的生長^【⁹^】。營養價值方面，單位重量中覆盆子所含之總胡蘿蔔素類（total

carotenoids）含量為370 μg/100g是紅醋栗（45 μg/100g）的8倍、草莓（26 μg/100g）的14倍以上，並且富含黍黃素（zeaxanthin），是水晶體重要的營養物質，也含有茄紅素（lycopene）^【¹⁴^】，其抗氧化能力、總維生素C含量、

總花青素含量、總酚類皆優於紅醋栗（red currants）^【¹²^】。

文獻報告，人類B型、C型肝炎以及酒精造成的肝病、肝硬化等疾病，

體內的生長轉化因子β（TGF-β）都有增高的趨勢，所以TGF-β是造成肝病以及肝細胞凋亡（aptosis）的主因，而覆盆子萃取物可以拮抗TGF-β，延緩肝病的發生^【¹⁵^】。並且富含多種抗氧化物質如花青素：cyanidin-3-glucoside、

cyanidin-3-sophoroside 等抗氧化物質^【¹⁶^】。

立陶宛的研究顯示，國內各種時間採收的覆盆子抗氧化活性差異甚大

(27)

三、藍莓

圖2-4 本實驗所採用的藍莓果實藍莓在植物界的分類是：

雙子葉植物綱 (Magnoliopsida) 杜鵑花目 (Ericales)

杜鵑花科 (Ericaceae) 越橘屬 (Vaccinium)

青液果亞屬 (Cyanococcus) 藍莓果實色澤藍色並被層白色果粉，果肉細膩，種子極小，全果可食。

藍莓果實中除糖、有機酸和維生素 C 外，富含維生素 A、B、E、SOD、

Resveratrol（白黎蘆醇）、蛋白質、花青苷、食用纖維以及豐富的 K、Fe、

Zn、Ca 等元素^【¹⁸^】；除供鮮食外還有極強的藥用價值及營養保健功能，國際糧農組織將其列為人類五大健康食品之一。

(28)

藍莓含有豐富的抗氧化物質，像是類黃酮素、胡蘿蔔素類與香豆素

、白黎蘆醇等，可以預防慢性疾病與癌症。具有高生化活性及抗氧化活性的白黎蘆醇^【²²^】，經研究容易因加熱而消失^【¹⁸^】。

營養價值方面，單位重量中藍莓的總胡蘿蔔素類（total carotenoids）含量為 290 μg/100g 是紅醋栗（45 μg/100g）的 6 倍、草莓（26 μg/100g）的 11 倍以上，並且富含黍黃素（zeaxanthin），是水晶體重要的營養物質，也含有茄紅素（lycopene）^【¹⁴^】，正式當紅的抗氧化物質，其抗氧化能力、總維生素 C 含量、總花青素含量、總酚類皆優於紅醋栗（red currants）^【¹²^】。藍莓有抗寄生蟲的效果，對於造成腹瀉、潰瘍、營養不良的蘭布爾吉 亞爾氏鞭毛蟲（Giardia duodenalis，是一種單細胞原生寄生生物，寄生於腸 壁），有抗寄生蟲的作用；對於隱孢子蟲（Cryptosporidium parvum）卵囊體

（oocysts）的自然脫囊，有抑制作用^【²⁰^】。

藍莓總酚類含量以及抑制 ABTS⁺‧自由基的能力，藍莓的總酚類含量

（26 μmol GAE/g FW）比櫻桃（12.55 μmol GAE/g FW）高，抑制 ABTS⁺‧ 自由基的能力（39.45 TEACμmol TE/g FW）也比櫻桃（26 TEAC μmol TE/g FW）好^【²¹^】。

藍莓含有的花青素包括 delphinidin-3-hexose、malvidin hexose 等^【²²^】，其萃取物有清除活性氧、抗菌止瀉、強化微血管、強化視網膜、預防糖尿

(29)

臟的功能有促進作用，對胰臟不全之糖尿病有間接輔助之效^【²⁴^】。

由文獻報告，蔓越莓、藍莓以及覆盆子這三種植物的果實，除了營養價值高以外，所含的成分生化活性也很多，對一些人類的疾病都有改善的效果，經文獻報告，乙醇萃取物的生化活性可能較高^【²²^】，而花青素、多酚類物質大部份於 EA 層中^【⁶^】，並且抑制ABTS⁺．由基的實驗經過比對，與總酚類測試的結果相關度極高^【²¹^】（r＝0.949），另外文獻亦報告此三種果實含有豐富的白黎蘆醇以及鞣花酸，有極明顯之生物活性以及抗氧化活性^【⁸^】

【18】【25】

，本研究將蔓越莓、藍莓及覆盆子分別以水及乙醇萃取，經濃縮後，

再以乙酸乙酯分配萃取，探討其利用於化妝品成分的有效性，所以本篇研究以各種抗氧化試驗、美白實驗、細胞實驗、DNA 的保護實驗以及配方調製、人體有效性評估，來探討這三種果實萃取物於化妝品中之應用。

(30)

第二節自由基

自由基學說最初於 1956 年由 Denham Harman 所提出 46，此學說認為隨著年齡增加而衰老的現象是由於自由基產生的作用所引起。另外，1986 年 Mccord 與 Fridovichc 成功自牛的紅血球細胞中分離出超氧化物歧化酶 Superoxide Dismutase（SOD），證實了生物體內緣性自由基的存在^【²⁸^】。

一、自由基種類

自由基是指具有一個或多個不成對電子的原子或分子^【³¹^】，會與非自由機反應進一步產生新的自由基而行程連鎖反應（chain reaction）大部分的自由基都是瞬間產生，處於較不穩定的狀態，半衰期很短，許多研究報告指出，自由基與癌症、心血管疾病及老化等有關。其中對人體有重大影響的常見活性氧種類（ROS）可歸納如下^【²⁹^】：

1. 超氧化物自由基（Superoxide anion radical）：O₂^-．

通常是最先也是最早產生的自由基，體內的吞噬細胞以及粒腺體中的電子傳遞鏈都會產生^【³⁰^】。超氧化物自由基的半衰期極短，但是接著產生的自由基如過氧化氫即會造成傷害。在正常情況下人體內的抗氧化系統SOD 可有效轉換超氧化物自由基成為過氧化氫，再由其他酵素轉化為無害的水。

2. 過氧化氫（Hydrogen peroxide）：H₂O₂

除了由 SOD 作用轉化而來以外，體內過氧化氫也可能來自吞噬細胞的

(31)

吞噬作用、醯基的 β-氧化作用以及其他氧化還原反應。過氧化氫對細胞的傷害性較大，因其能通過細胞膜，使細胞內或是細胞膜上的脂質過氧化、

和體內運轉中的鐵和銅（transitionions）發生 Fenton 反應，產生破壞性極大的羥基自由基。

Fe²⁺＋ H₂O2 Fe³⁺＋ HO．＋ HO^- 3. 羥基自由基（Htdroxyl radical）：HO．

可說是最活耀的自由基之一，除了上述自由基轉換而來以外，照射 X-ray 也會產生大量的羥自由基。它除了會造成體內脂質過氧化而破壞細胞外，也會和糖類、胺基酸、脂肪酸、磷脂質、核醣體、有機酸等任何生物體內物質反應，造成 DNA 的傷害^【^31,32^】。

4. 單重態氧（Singlet oxygen）：¹O₂

體內穩定的氧分子受到紫外線照射後大量產生的不穩定物質，單重線態氧極易與氫反應，直接攻擊不飽和脂肪酸，造成脂質過氧化。

5. 過氧化脂質（Lipid hydroperoxide）：LOOH

可說是許多自由基連鎖反應的產物，而且多半發生在細胞膜上的多元不飽和脂肪酸。過氧化脂質可以再斷裂成其他自由基，形成有害的醛類、

鹼類或其他產物，過氧化脂質及其他產物即直接和蛋白質、脂質、酵素或核酸作用，導致細胞甚至器官的變性或死亡。

其實，自由基並非全然不是好的分子，在正常狀況下，人體也會自行

(32)

產生自由基，例如需要活化細胞或殺死一些細菌時，便需要產生自由基，

此類自由基在殺死入侵細菌上扮演極重要的角色。

不過外在環境包括空氣污染、化學藥劑、香菸、煙霧、紫外線照射及農藥等往往使人體產生過多的自由基，由於自由基的產生及作用是連鎖反應，一個自由基的產生將引發另一個新的自由基，再繼續和周圍的分子反應，產生更多的自由基，而破壞蛋白質、脂質、酵素或核酸分子，可能造成許多疾病，包括癌症、接觸性皮膚炎、老化、紅斑性狼瘡等。

圖2-5 自由基與氧化壓力造成老化示意圖^【²^】

(33)

第三節美白簡介

擁有美麗白皙的肌膚，幾乎是所有女性所嚮往的，今日的社會因環境汙染、精神壓力、陽光照射及人本身體質變化，所引起的膚色晦暗問題，

遂大量需求美白保養化粧品以預防或改善皮膚的色澤^【³⁴^】。一、膚色的決定因素

皮膚的顏色，主要是由表皮內黑色素（Melanin）、真皮內之胡蘿蔔素（Carotene）及真皮微血管中之血液所造成。各種人種所含之黑色素細胞數量大致相等，而皮膚顏色有差別，主要是與黑色素細胞活躍程度及其製造的黑色素數量及分布情形不同有關^【³⁵^】。

二、黑色素的形成機轉

黑色素細胞位於皮膚基底層細胞之間，佔表皮約 4~10％，由胚胎時期神經脊（neural cret）內的細胞轉移而來。其細胞呈圓形，為多突起的細胞，呈長條狀不規則的突起，會深入表皮及其他細胞之間。黑色素細胞可合成黑色素顆粒，分泌黑色素，使人體呈現不同膚色。合成黑色素顆粒可分為四個時期^【³⁶^】：

1. 在粗糙內質網上的核醣體中合成前酪胺酸酶，支後進入內質網腔。

2. 內質網以出芽小泡方式，將前酪胺酸酶轉運到高基氏體進行濃縮，

並包成卵圓形前黑色素小體。

(34)

3. 當前酪胺酸酶被活化為酪胺酸酶時，前黑色素小體內即出現黑色素微粒，該小體則稱為黑色素小體，並被轉運到細胞突起的基部。

4. 隨著黑色素小體內酪胺酸酶催化酪胺酸使黑色素越多時，黑色素小體輪廓逐漸消失，並移向細胞突起內，固突起內是均質狀的黑色素顆粒，而細胞體內不含黑色素顆粒而成透明狀。

圖2-6 黑色素行成後，由黑色素小體送至角質細胞示意圖^【³⁷^】。

三、黑色素的種類

由於酪胺酸酶會催化酪胺酸行程 3,4-二羫基苯丙酸（DOPA），DOPA 再與洛氨酸酶進行氧化行成 DOPA quinone，而生成的 Dopa chrome 其代謝物為 Eumalanins，另外，生成的 5-S-cysteinyldopa 其代謝物則為 Pheomalanins。在哺乳動物中，黑色素即可分為真黑色素（Eumelanins）

與褐黑色素（Pheomelanins）此兩種基本形式：

(35)

為一種外觀為黑色或棕黑色的含氮元素，廣泛存在於動物體內如上皮細胞、體毛、羽毛、視網膜、神經等處，通常泛指真黑色素為黑色素。

（二）褐黑色素（Pheomelanins）：

為一種外觀為黃色或紅棕色的含硫元素，大多存在於人類的紅色頭髮以及鳥類的紅、黃等顏色之羽毛處。而Pheomelanin 與 Eumelanin 依不同比例混合，則會呈現不同深淺之黑色樣貌。

由以上黑色素的體內生合成機轉以及因素，我們可得知阻斷黑色素的生成，可以透過酪胺酸酶的抑制如Arbutin、抑制酪胺酸酶的醣化

（glycosylation）如 glucosamin、抑制黑色素小體將黑色素送到角質細胞如Niacinamide^【³⁸^】、螯合同離子、還原黑色素如維生素C 等作用方式。

不過目前最常見的方式為抑制酪胺酸酶。

(36)

圖2-7 真黑色素與褐黑色素在體內合成路徑圖^【³⁷^】。

四、膚色的類型與測量

皮膚顏色乃因性別、年齡、季節、部位以及個人差異等因素而有所不同。通常老年人色素含量較年輕人多，男性較女性多^【³⁹^】。照射紫外線會造成皮膚色素沉著而使皮膚老化、暗沉、膚色變深，一些研究發現白人的黑色素細胞對於紫外線所造成的DNA 受損較其他人種敏感^【³^】。此外，長期曝曬於陽光下的皮膚，與未曝曬前的皮膚相比較，其黑色素細胞中DOPA 被活化的數目有明顯的增加^【⁴⁰^】。

(37)

曝曬於陽光會造成曬傷或曬黑等情況，是因為每個人在曝曬於陽光下對於紫外線產生的感受性不同所造成，感受性越高的人，越容易被紫外線曬傷。而皮膚的類型與皮膚對紫外線的感受性有關係，以往文獻中，皮膚主要分成六大類^【⁴¹^】^【⁴²^】：Type I~VI，膚色最淡的為 Type I，最容易曬傷，而膚色最深的是 Type VI，耐曬程度最高。而皮膚類型的分類依據為ITA^。，ITA^。是 1990 年 Chardon 等人使用 CIE（國際照明委員會）的L^＊a^＊b^＊表色系，來確立皮膚顏色類型與ITA^。表色值對應關係，經由ITA^。判定皮膚的類型。而ITA^。的計算公式為：

ITA^。＝{Arc Tangent[(L^＊－ 50) ÷ b ^＊]} × 180 ÷ π

(38)

皮膚類型

（skin type）

曝曬感受性

（Susceptibility to sunburn）

膚色

（Constitutive skin color）

耐曬能力

（Tanning ability）

造成皮膚癌機率

（Susceptibility to skin cancer）

I 高白很差高

II 高白差高

III 中等白好中等

IV 低淺棕色很好低

V 很低棕色很好很低

VI 很低黑色很好很低

表2-1 皮膚的類型

膚色類型（Skin colour categories） ITA^。 values

很白＞55^。

白 41^。~55^。

淺棕色 28^。~41^。

棕色 10^。~28^。

深棕色 -30^。~10^。

黑色 ≦-30^。

表 2-2 ITA^。值與皮膚類型對照表

(39)

第三章材料與方法

第一節儀器設備

1.精密天秤：XT 120A（Precisa）

2.旋轉式減壓濃縮機：VC-7600（Panchum）

3.ELISA reader：Thermo multiskan EX 4.恆溫水浴槽： MT-4896（Panchum）

5.桌上型離心機：Z233 M-2（HERMLE）

6.CO₂細胞培養箱：MCO-15AC（SANYO）

7.顯微鏡：Axiovert 40C（ZEISS）

8.桌上型震盪機：Vortex gene2（Scientific Industries）

9.紫外線/可見光分光光譜儀：Spectrophopometer U-2001（Hitachi）

10.無菌無塵操作台：4BH-24（海天）

11.冷凍乾燥機：HD45-12P（KINGMECH）

12.超音波震盪機：DC400H（DELTA）

13.電泳槽：mupid-2plus （ADVANCE）

14.紫外線燈箱：TCP-20M（VILBER LOURMAT）

15.UVB 劑量偵測器：UVB detector PMA2100（SOLOR LIGHT co.）

16.BJL 超微弱冷光分析儀

17.雷射粒徑分布儀：MASTERSIZER 2000（MALVERN）

(40)

第二節藥品與試劑

1. DPPH‧自由基：

1,1-disphenyl-2-picryl-hydrazyl（東京化成株式會社）

2. ABTS⁺自由基：2,2’-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonnium salt 98％（SIGMA）

3. 過氧化氫：Hydrogen peroxide solution 30％（Riedel- de haen）

4. 酪氨酸酶：Tyrosinase mushroom T3824-50KU（SIGMA）

5. PBS 緩衝溶液： Dulbcco’s Phosphate Buffered Saline（biosera）

6. DMEM 培養基：Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose 1X（GIBCO）

7. DMSO：Dimethyl sulfoxide 99.5％（Riedel- de haen）

8. L-ascorbic acid：L-(+) ascorbic acid 98+％（Lancaster）

9. Trolox：6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl chroman-2-carboxylic acid

（SIGMA）

10. TAE buffer：UltraPure TAE buffer（invitrogen）

11. 乙醇：優質酒精（台灣省菸酒公賣局）

12. 乙酸乙酯：ethyl acetate 99.9％（Mallinckrodt CHEMECAL）

13. 洋菜膠：Agarose S（NIPPON GEN CO.LTD）

(41)

15. Marker DNA：λ-Hind III DNA（Takara）

16. pUC DNA：pUC 119 DNA（Takara）

17. 過氧化酶：PEROXIDASE（SIGMA）

18. MTT 染劑：Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide＞97.5％

（SIGMA）

19. B-16 melanoma cell CCRC60030 （食品工業發展研究所）

20. Luminol：3-aminophtalhydrazide（SIGMA）

21. Jojoba oil （君凰生醫科技）

22. Castor oil（君凰生醫科技）

23. Xanthan Gun（君凰生醫科技）

24. Hrdroxy ethyl cellulose solution（君凰生醫科技）

25. 1,3 BG（君凰生醫科技）

(42)

第三節植物萃取與粗分

2006 年 9 月透過誠麗實業股份有限公司（台灣，台北）向加拿大訂購新鮮冷凍蔓越莓、覆盆子、藍莓各 5 公斤，經冷凍運送至實驗室冷凍保存。

將新鮮上述三種植物之果實清洗瀝乾秤重後，取 2.7 公斤蔓越莓以果汁機絞碎加入 2 公升浸泡三天後過濾減壓濃縮萃取，重複三次；另取蔓越莓、

覆盆子、藍莓 2 公斤，分別浸於 2 公升 95％乙醇三天後過濾濃縮萃取，重複三次。之後所得之粗萃取物以冷凍乾燥將溶劑去除後秤重，所得產物為蔓越莓水粗萃 270.614g、蔓越莓乙醇粗萃 258.72g、覆盆子乙醇粗萃

265.273g、藍莓乙醇粗萃 272.504g，再將上述所粗萃物以分液漏斗用乙酸乙酯（EA）與水液-液分層萃取，再將以酸乙酯層濃縮，重複至乙酸乙酯層透明無色為止，萃取物以代號命名之（表3-1）。萃取分離流程如圖所示：圖 3-1 為蔓越莓水萃流程；圖 3-2 為蔓越莓乙醇萃流程；圖 3-3 為藍莓萃取流程：圖 3-4 為覆盆子萃取流程。

文獻指出，覆盆子一般溶劑浸泡萃取與超音波震盪萃取後，經 HPLC 分析發現，所萃取的成分與含量並無差異^【²⁶^】；而藍莓經90℃蒸 1 分鐘之後，

所萃得的總花青素與總酚類皆有提高^【²⁷^】，但又有文獻指出藍莓的成份容易受熱而分解^【¹⁸^】，所以本篇研究採用一般溶劑浸泡萃取，並不做加熱。

(43)

表3-1 萃取物名稱與代號對照表

圖3-1 蔓越莓水萃取與分離流程圖萃取物 ^蔓越莓

水粗萃

蔓越莓水萃水層

蔓越莓水萃EA 層

蔓越莓乙醇粗萃

蔓越莓乙醇萃水層

蔓越莓乙醇萃EA 層

代號 CWC CWW CWE CAC CAW CAE

萃取物 ^藍莓乙醇粗萃

藍莓乙醇萃水層

藍莓乙醇萃EA 層

覆盆子乙醇粗萃

覆盆子乙醇萃水層

覆盆子乙醇萃EA 層

代號 BAC BAW BAE RAC RAW RAE

新鮮蔓越莓2.7 公斤

extracts

Residue（270.614g）

EA Layer（19.122g） H2O Layer（251.492）

water

filtration、concentrated

Partitioned：H2O/EA

(44)

圖3-2 蔓越莓乙醇萃取與分離流程圖

新鮮覆盆子2 公斤

extracts

EA Layer（21.993g） H2O Layer（243.38g）

95％ enthanol

Partitioned：H2O/EA 新鮮蔓越莓2 公斤

extracts

95％ enthanol

(45)

圖3-4 藍莓乙醇萃取與分離流程圖新鮮藍莓2 公斤

extracts

95％ enthanol

(46)

第四節活性試驗

一、清除 DPPH‧自由基能力測定^【⁴³^】

本實驗係參考 K.H. wang.等人 2006 年篩選中草藥抗氧化實驗的方法^【⁴³^】。DPPH．自由基（1,1-disphenyl-2-picryl-hydrazyl）是一個穩定的自由基，其甲醇或乙醇溶液在波長517 nm 有最大吸光值。藉由加入樣品溶液後測量其517 nm 吸光值變化，及可換算出該濃度下之自由基抑制率。

實驗流程：

Scavenging of Radical,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH‧）assay：

1. 試劑的配置（solution preparation）

a. 精秤 DPPH‧粉末 25 mg。

b. 溶於 1000 mL 的 95％乙醇溶液中（呈紫色），避光冷藏於 4℃

保存。

2. 實驗方法

a. 將 sample 以乙醇配製成 100、50、10、5、1、0.5 mg/mL 之乙醇溶液，取 10 μL 放入 1.5mL 的小離心管中。

b. 加入 240 μL 之 95％乙醇與 750 μL 之 DPPH 溶液，充份混合振盪後，於室溫下靜置30 分鐘。

(47)

d. 製作扣色組，將 DPPH 溶液以乙醇取代，加入樣品，以扣除樣品干擾色。

e. 將反應完成後之溶液各取 200 μL 至 96-well 盤中，以 ELISA reader 測定波長 540 nm 之吸光值

f. 以公式換算該濃度下對於 DPPH‧自由基之抑制率 3. 清除 DPPH 自由基能力計算

Scavenging activity％＝

【（control 540 nm OD－sample 540 nm OD）÷control 540 nm OD】×100 Control 540 nm OD：不加樣品的空白組，在波長 540nm 的吸光值。

Sample 540 nm OD：樣品扣除干擾色，在波長 540nm 的吸光值。

(48)

二、清除 ABTS^＋．陽離子自由基實驗^【⁴⁴^】

本實驗係參考 Osman 等人 2006 年的發表^【⁴⁴^】。其原理是ABTS 與 H₂O₂，在 Peroxidase 的催化下，產生 ABTS⁺‧自由基，在波長 734 nm 有最大吸光值。因此藉由加入樣品，測定 734 nm 吸光值的變化，評估其抗氧化能力。

圖3-5 ABTS 與 ABTS⁺．自由基結構圖。^【⁴⁴^】

Scavenging of Radical Cation

2,2’-azinobis-(3-ethybenzothiazolin-6-sulfonic acid)(ABTS‧^＋) assay：

1. 試劑配製：

(49)

秤取 ABTS 5.4 mg 加去離子水 10 mL

（2） H₂O₂（濃度 500 μM）：

a. 取 30％ H₂O₂ 60 μL＋去離子水 9.94 mL（此時為 50 mM）。

b. 再由 50 mM H₂O₂中取100 μL＋去離子水 9.9 mL （即得 500 μM）

（3） Peroxidase（44 unit/mL）：

依照藥品包裝的 unit 決定取用量，以去離子水稀釋成 44 unit/mL。

2. 測定方法：

a. 取 1.5 mL 去離子水加入試管內。

b. 分別加入 ABTS 溶液 250 μL（扣色組不加，以等量去離子水補足）。

c. 再加入 250 μL H₂O₂與 250 μL Peroxidase。

d. 利用震盪機將試管中液體混何均勻。

e. 避光靜置一小時。

f. 反應完成後，取出試管，分別再加入已配置好的待測樣品溶液 250 μL。

g. 利用震盪機將試管中液體混合，使其反應 10 分鐘。

h. 製作扣色組，ABTS、H²O²、Peroxidase 以水取代，加入樣品溶液，

(50)

以扣除樣品干擾色。

i. 取 1 mL 置於石英樣品槽中。

j. 利用紫外光/可見光分光光度計測定波長 734 nm 的吸光值。

k. 每次處理重複三次

3. 清除 ABTS⁺．陽離子自由基能力之計算 Scavenging effect ％＝

【（control 734 nm OD－sample734 nm OD）÷control734 nm OD】×100

Control734 nm OD：不加樣品的空白組，在波長 734 nm 的吸光值。

Sample734 nm OD：樣品扣除干擾色後，在波長 734 nm 的吸光值。

(51)

三、體外抑制酪胺酸酶實驗^【³⁹^】

本實驗方法係參考 N.Baurin 等人在 2002 篩選植物抑制酪胺酸酶的實驗方法^【³⁹^】。酪胺酸（L-tyrosin）因酪胺酸酶（Tyrosinase）

的反應催化下，可反應轉變為Dopa 以及 Dopaquinone 的深色物質，藉由測定反應後產物在波長450 nm 的吸光值，可換算出該濃 度下樣品對酪胺酸酶的抑制作用。

1、試劑的配製：

（1）酪胺酸緩衝溶液（L-Tyrosine buffer solution）：

a. 精秤酪胺酸（L-Tyrosine）0.5 g。

b. 加入磷酸緩衝溶液定容至 100 mL。

c. 均勻混合後，靜置 30 分鐘以上，貯存於 4℃冰箱備用。

d. 實驗時，取上清液使用。

（2）酪胺酸酶溶液（Tyrosinase solution）：

a. 將酪胺酸酶（Tyrosinase 50000unit，SIGMA），溶於緩衝液中，配置成 7 unit /μL。

b. 分裝於 1.5 毫升離心管中，每管 200μL，貯存於－20℃冰箱備用。

c. 使用時置於碎冰上，以維持其活性。

(52)

2、實驗方法：

（1）以純水稀釋配置待測樣品，濃度分別為 10 mg/mL、1 mg/mL、

0.1 mg/mL，並分別取 100 μL 至 1.5 mL 的離心管。

（2）再加入酪胺酸緩衝溶液 900 μL 及酪氨酸酶溶液 70 unit。

（3）負對照組為 1000 μL 酪胺酸緩衝溶液加酪胺酸酶溶液 70 unit。

（4）正對照組為 1000 μL 酪胺酸酶緩衝溶液。

（5）扣色組為 900 μL 酪胺酸酶緩衝溶液加 100 μL 待測樣品溶液。

（6）利用震盪機充分混合所有離心管內溶液。

（7）置於 37℃烘箱中反應 1 小時。

（8）以 ELISA reader 測定 96-well 空盤吸光值。

（9）反應完成後，各取 100 μL 於 96-well 盤中。

（10）利用 ELISA reader，測定波長 450 nm 吸光值。

（11）以上實驗均作三重複。

3、酪胺酸酶抑制率公式：

Tyrosinase inhibition（％）＝

【（Control 450 nm OD－Sample 450 nm OD）÷Control 450 nm OD】×100％

Control 450 nm OD：負對照組吸光值－正對照組。

Sample 450 nm OD：反應後樣品吸光值扣除樣品扣色組吸光值。

(53)

四、以超微弱冷光技術（BJL）評估抑制過氧化氫活性^【⁴⁵^】【⁴⁶^】【⁴⁷^】當過氧化氫與探針（Luminol，3-aminophtalhydrazide

）與 H₂O₂作用後產生之超微弱冷光，以BJL 超微弱冷光儀偵測。

當超微弱冷光之計數達平衡時（約10-15 分鐘），加入欲測試樣品，若該樣品有清除過氧化氫能力，則冷光計數會急速下降。可藉由不同計量產生冷光值的變化來計算IC₅₀值，藉以評估測試樣品的過氧化氫清除能力。^【⁴⁵^】【⁴⁶^】【⁴⁷^】

試劑：

試劑 I：Luminol（3-aminophtalhydrazide）

試劑 II：PBS 緩衝液。

試劑 III：過氧化氫。均冷藏 4℃保存。

1、操作步驟：

a. 以 C₁₄校正工具校正儀器。

b. 取 0.5 mL 試劑 I 放入石英測量杯內。

c. 取 0.5 mL 試劑 II 放入石英測量杯內。

d. 取 0.5 mL 試劑 III 放入石英測量杯內。

e. 搖晃測量杯數次，使測量杯內混合均勻。

f. 將石英測量杯放入機器測定冷光值。

g. 待冷光達平衡後將 10 μL 樣品加入測定冷光值的變化。

(54)

h. 等待冷光值再達平衡後，再加入另一劑量樣品，觀察冷光值再度下降。

2、數據計算：

將冷光變化值除以原始冷光值，即可求得抑制率：

Inhibition（％）＝【（A_initial－A1）÷A_innitial】×100％

A_initial：未加入樣品前機器所讀取之自由基微冷光數值。

A1：加入樣品後機器所讀取之自由基微冷光數值。

(55)

五、以 DNA 電泳評估自由基引發 DNA 損傷之防護作用

H2O2 經光解作用後形成羥基自由基，利用所生成的羥基自由基攻擊質體DNA^【⁴⁸^】，藉此模擬自由基對DNA 的傷害，評估抗氧化物的參與對於DNA 的保護效果。

pUC119 為環狀雙股螺旋狀的質體 DNA，原始狀態呈 supercoil form (S-form)，受到自由基傷害造成單股斷裂成為 open-circular form(C-form)，若再更進一步受到破壞，兩股斷裂即形成 linear form(L-form)。其能簡易提供 S-form 至 L-form 的型態轉變，便於評估抗氧化物保護 DNA 的程度，因而選用 pUC119 進行實驗。

由於少量自由基即能造成 pUC119 的斷裂，故另外選用 λ-Hind Ⅲ Marker DNA 一同比較，因需要較強烈的自由基攻擊 Marker DNA 才能被完全打斷。

1、試劑的配置與材料準備：

a. Marker DNA（λ-Hin d III digest）以 PBS 以 1：3 稀釋。

b. pUC 119 DNA 以 PBS 以 1：4 稀釋。

c. H₂O₂稀釋成0.3％。

d. 秤取 Agarose 0.96 g，以 TAE buffer 120 mL 配製成 8 mg/mL 後加熱至完全溶解，待稍微冷卻後注入膠模製膠。

2、實驗步驟：

(56)

a. 取 2 μL DNA 至小離心管中 b. 加入 5 μL H₂O₂

c. 加入 3 μL sample 溶液後離心 1000 rpm、1min

d. 以事先暖機之 UV 燈管照射 70％功率（Marker 12 分半；PUC 40 秒）

e. 加入 loading dye 3 μL 後離心（1000 rpm 1min）

f. 將所有離心管內液體注射至膠片孔洞中進行跑膠約 65 分鐘。

g. 以 ethidium bromide 染色膠片 30 分鐘後以 UV 燈箱拍照。

h. 將所拍得之照片，利用 Kodak 1D 軟體分析其每條 band 的亮度，並計算出其自由基清除率及 SC₅₀。

(57)

六、 B-16 黑色素瘤細胞之抑制實驗^【⁴⁹^】

本實驗係參考 Ching-Yuan Wu 等人 2006 年的發表，藉由 B-16 melanoma cell 加入樣品於培養基的培養，於 72 小時候以波長 450nm 測定其培養基的吸光值以估算黑色素的量^【⁴⁵^】。

1、細胞來源：財團法人食品工業發展研究所（B-16 細胞 CCRC60030）

2、B-16 黑色素瘤細胞之培養方法：

a. 將 B-16 細胞，以 DMEM medium（內含 10％ Fetal Bovine Serum、1％ PEN-Strep-Amphosol、1％ Non- Essential Amono Acids Solution）培養於培養瓶中。

b. 置於 37℃、5％ CO₂的培養箱中培養。

3、測試方法：

a. 將 B-16 cells 以 Trypsin 均勻懸浮在 DMEM medium 中，再分別移種在6-well 盤中

b. 置於 37℃、5％ CO₂的培養箱中培養一天使其細胞貼附。

c. 將 sample 以無菌 PBS 配置成不同濃度後，以 0.45 μm 的濾膜過濾。

d. 將樣品溶液加至細胞的 well 盤中，使其 medium 中含樣品濃度分別為1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL，並製作控制組。

(58)

e. 置於 37℃、5％CO₂的培養箱中培養三天，並每天拍照紀錄。

f. 從細胞的 well 盤中取 medium 上清液 100 μL 至 96-well 盤中。

g. 用 ELISA reader 測定波長 450 nm 的吸光值。

4、計算公式：

Inhibition（％）＝

【（Control 450 nm OD－Sample 450 nm OD）÷Control 450 nm OD】×100 Control 450 nm OD：不加樣品之空白組，在波長 450 nm 的吸光值。

Sample 450 nm OD：樣品扣除干擾色後，在波長 450 nm 的吸光值。

(59)

七、細胞存活率實驗（MTT assay）^【⁴²^】

利用 MTT reagent 中 tetrazolium 在活細胞中會被粒腺體的脫氫酵素（dehydrogenase）還原，而產生紫色 formazan 產物的特性，其在 550 nm 有最大吸收，利用比色法來測定細胞存活率。

當存活細胞越多，產生的 formazan 也越多，在 550 nm 的吸光值也越大，與已知細胞數的標準線（standard curve）比較，可計算出細胞存活率。

圖3-6 MTT與NADH的反應機制。MTT可與粒腺體中的NADH作用，將 tetrazolium轉為紫色不溶於水的MTT formazan，結晶於細胞的粒線體中。

1、試劑配置：

a. MTT solution：

精秤25 mg MTT 粉末，溶於 100 mL PBS 中。

2、測定方法：

a. 將 B-16 cells 以 Trypsin 均勻懸浮於 DMEM medium 中，移種至

(60)

6-well 盤中。

b. 置於 37℃、5％ CO₂的培養箱中培養一天。

c. 以 PBS 配置不同濃度的待測樣品，以 0.45 μm 濾膜過濾。

d. 將已過濾之樣品加入細胞的 well 盤中。

e. 置於 37℃、5％ CO₂的培養箱中培養三天。

f. 將細胞的 medium 抽乾，並以 PBS 清洗。

g. 每 well 中加入 MTT solution 1000 μL，於 37℃、5％ CO₂的培養箱中反應一小時。

h. 將 well 中的 MTT solution 抽乾。

i. 於每 well 中加入 DMSO 500μL。

j. 將 DMSO 溶下的紫色溶液，取 100 μL 至 96-well 盤中測定波長 570 nm 的吸光值。

3、細胞存活率計算：

Cell viability（％）＝

Sample 570 nm OD÷Control 570 nm OD × 100％

Control 570 nm OD：不加樣品之空白組，在波長 570 nm 的吸光值。

Sample 570 nm OD：有加樣品在波長 570 nm 的吸光值。

嘉南藥理科技大學 化粧品科技研究所 碩士論文