第二章、 研究方法
第三節、 研究設計
C. 西方墨漬法 Western blot
(一)細胞萃蛋白
萃蛋白前先做加藥處理，當細胞養到 8 分滿時，換 serum-free medium
（使細胞處於飢餓狀態）。
serum-free(12hrs)→銀杏、NAC 4 µM、DPI 10 µM (30min) →Ang II 0.1 µM (5min)→收細胞。
銀杏萃取液 (0.84 mg/ml = 840 µg/ml)
control 12.5 25 50 100 0µl 40µl 30µl 20µl 10µl 抗氧化劑
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NAC 4 µM DPI 10 µM 100µl 50µl
將舊的 medium 抽掉，以 PBS buffer 做 wash，重複洗 2 次之後加入 serum-free medium，並置於 37℃培養箱 12hrs。
(二)加藥處理
銀杏萃取液(0.84 mg/ml = 840 µg/ml)預配成(12.5、25、50、100 µg/ml stock)，所以加入銀杏萃取液分別是(0、168、337、675、1351µl )、
NAC 4 µM(100µl)、DPI 10 µM(50µl)，並置於 37℃培養箱 30 min。再 於每個plate中加入 Ang II 0.1µM (10µl) 再置於 37℃培養箱 5min 。 接著取出plate，並將 plate 放置於冰上，將 medium 倒掉於廢液瓶中。
加PBS buffer wash 2 次，同樣將 PBS buffer 倒掉，再用 pipette 將邊 緣的餘液儘量吸乾，加入大約200ul 的 lysis buffer 到 plate 中。將欲 分裝蛋白的eppendrof 標示好。用刮棒將 plate 上細胞刮下（先將刮棒 上酒精擦乾，刮的方式可先刮外面一圈，再刮 plate 中間部分，最後 將細胞集中在邊緣處）。將刮下的細胞分裝到新的 eppendrof。將 eppendrof 放到冰上後震盪，並且每隔 5 分鐘後震盪一次共 30 min，
之後再用12000rpm，4℃，離心 20min。最後取上清液，分裝到新的 eppendrof，保存於-80℃。
(三)蛋白質濃度測定( Lowry protein assay )
蛋白質的定量採用Lowry protein assay，其原理為蛋白質胜肽先與鹼
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性 溶 液 中 的 銅 離 子 作 用 ， 蛋 白 質 中tyrosine 及tryptophan 再還原 phosphomolubdate 而形成有顏色之複合物。
本方法過程為當鹼性銅離子試劑與蛋白質中少數胜肽腱（peptide bond）反應，產生低層次之biuret顏色，其次當folin-Ciocalteu phenol reagent 試劑加入後，與蛋白質中的tyrosine 及tryptophan 反應後產生 藍綠色之複合物。
1. 首先配製 standard：
BSA 的濃度為 0.5mg/ml
µg/µl 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
ddH20 50µl 40µl 30µl 20µl 10µl 0µl BSA 0µl 10µl 20µl 30µl 40µl 50µl 2. 配製 sample：
10X ddH20(PBS) 45µl
sample 5µl
同時以BSA (Bovine Serium Albumin)當作對照組，首先配製standard
（0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/ml，用來當作標準曲線，接著將樣 品稀釋為10倍（總體積為200 μ l），步驟為二重複。
1. 各取50ul 的 standard 及 sample
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2. 加入 250ul 的三種溶液均勻混合為一（Na-K：CuSO4：Na2CO3=1：
1：98 之比例混合，需現配先加 Na2CO3，再加 Na-K，最後加 CuSO4
後vortex 一下），於室溫下作用 10 分鐘。
3. 加入 25ul Folin reagent，混合並於室溫下 30 分鐘。
4. 取 200ul 到 96-well plate 上。以 750nm 吸光值波長測 ELISA 吸光 值。
SDS-聚丙烯胺板膠電泳之上層膠體為 12% Stacking gel，下層膠體為 12% Separating gel。先配 separating buffer 為 separating gel，加入水將 separating gel 壓平，約等 30 分鐘待凝，接著將水倒掉。接著再先配 stacking buffer 為 Stacking gel，且於 stacking gel 插上 comb，待凝，
等要加入蛋白樣品溶液再將comb 拔起來。取樣品蛋白 30 mg 與 5X Loading dye 混合均勻 protein denature 120℃，5 分鐘。再進行 SDS-聚丙烯胺板膠電泳分析，將做好之板膠固定到電泳裝置上，並將電泳 緩衝液（running buffer）注滿電泳槽，然後將處理過的蛋白樣品溶液 加入板膠上所形成的 U 型槽中，以 90 伏特(依所需時間進行調整)進 行電泳。電泳結束後配製transfer buffer 進行蛋白轉移，將膠體取出，
預先用甲醇浸濕的PVDF membrane。順序由下而上(由黑至白)置入：
菜瓜布→濾紙→膜→膠→濾紙→菜瓜布，扣上後放入 transfer system 內含有 transfer buffer。於 4℃下進行 100 伏特電壓轉移，電轉移 1 個
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半小時之後，取出 PVDF membrane 浸入含 5 %（w/v）脫脂牛奶 (Blocking buffer)/(TBS-non-fat milk powder)於室溫下搖動反應一小時。
將 PVDF membrane 置於 4℃冰箱中與一級抗體反應隔夜，之後以 Washing buffer(1XTBS)清洗三次，每一次 10 分鐘，最後再清洗一次 到掉即可。再以二級抗體 (2μl/ml /1X TBS buffer)於 4℃下反應 1 小時，
同樣以 TBS 清洗 PVDF membrane wash 3 次，每次 10min，加在 membrane 上加入混合體積 1：1＝A：B 液，進行冷光螢光儀反應。
Separating：
2M Tris-base(PH8.8) 75ml
10%SDS 4ml
ddH2O 21ml
stacking：
1M Tris-base(PH6.8) 50ml
10%SDS 4ml
ddH2O 46ml
Separating gel(12%)三片量：
ddH2O 9.9ml
40%Acyl-Bis 6.75ml Separating 5.625ml 10%APS 180μl
TEMED 30μl stacking gel(12%)三片量：
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ddH2O 6.5625ml
40%Acyl-Bis 937μl
stacking 2.5ml 10%APS 80μl
TEMED 20μl Running buffer：
Tris-base 0.75g Glycine 3.675g 10%SDS 5ml ddH2O 加到 250ml
Transfer buffer：
Tris-base 3.033g Glycine 14.4g Methanol 200ml ddH2O 加到 1L
5% Blocking buffer：
奶粉 5g
1XTBS 100ml