觀察菌株於含 4％血清 Bacto-agar 培養皿上的生長情形

tpi1/TPI1::TR 突變株（編號 10）觀察菌絲於培養皿上型態。野生株 SC5314 為正對照，有菌絲生成的菌落，在培養皿上的菌落外觀上會有明顯的毛茸 茸放射性的形狀，雙突變株(cph1/cph1efg1/efg1)為負對照，單一菌落外觀上 呈圓形，tpi1/TPI1::TR 突變株（編號 10）在不加藥（-DOX）情形下，仍是 有毛茸放射性形狀，但中心部分的毛茸情形明顯沒野生株來的濃密，加藥

（+DOX）情形下，沒有毛茸的放射狀，但不是圓形，而是輪廓明顯的斑駁 聚集（圖三十一）。

4.4.7 侵犯力分析(Invasion assay)

野生株 SC5314 及雙突變株(cph1/cph1efg1/efg1)為對照組，觀察 tpi1/TPI1::TR 突變株（編號 10）侵入培養基的能力。雙突變株

(cph1/cph1efg1/efg1)在陪養基上的菌落型態為光滑圓形，在固定水量的沖洗 下，一分三十秒能將所有菌落沖離陪養基，野生株SC5314 於培養基上的菌 落呈皺縮狀，在固定水量、一分三十秒內，無法將菌落沖離培養基。

tpi1/TPI1::TR 突變株（編號 10）在不加藥（-Dox）情形培養下，菌落呈皺 縮狀，在相同沖洗條件下，菌落無法被沖洗離培養基，而在加藥（+DOX）

的培養下，菌落呈較小顆，當沖洗不到一分鐘，全部菌落脫落（圖三十二）。

第五 第 五章 章、 、討 討論 論

5.1 初步證實白色念珠菌中，抗藥性和致病力途徑的相關連

利用北方墨點法初步分析，ERG3 和 ERG11 於血清誘導培養下，在致 病性株和非致病性株的表現量差異，而結果顯示此兩基因在

HLC54(CPH1/CPH1 efg1/efg1)及 HLC52(cph1/cph1 efg1/efg1)的表現量皆大 於SC5314(CPH1/CPH1 EFG1/EFG1)及 JKC19(cph1/cph1 EFG1/EFG1)，根 據此結果，初步推論，ERG3、ERG11 此二基因受 EFG1 基因調控(圖三)。

然而，就已知資料只知道EFG1 基因所展現的生理功能有許多，例如：細 胞黏附作用、細胞型態變化、菌絲生長、假菌絲形成、調控基因轉錄作用、

生物膜的形成等，尚未有研究指出其調控抗藥性機制的可能性，但以北方 墨點法結果(圖三)可初步推論，EFG1 可能同時影響抗藥性機制。根據這些 結果，國家衛生研究院羅秀容老師實驗室進一步將efg1/efg1 突變株進行抗 真菌藥物敏感性測試(E-test)，結果發現，在 fluconazole 處理下，HLC52

（CPH1/CPH1 efg1/efg1）的抑菌圈明顯大於 SC5314（CPH1/CPH1

EFG1/EFG1），MIC 等於 4μg/ml（附圖四）(Lo, et al., 2005)。所以，白色 念珠菌之致病因子Efg1 可能經由負向調控 ERG3 基因而改變對真菌藥物的 敏感性 (圖五)，也證實抗藥性及致病力在 Candida albicans 中是相互連接 的。

另外，Efg1 為白色念珠菌之 transcription factor，具有 basic

helix-loop-helix(bHLH) motif。研究也指出(Leng, et al., 2001)，Efg1 為 DNA-binging protein，可以專一性地對 E box (consensus sequence, 5’-

CANNTG-3’)作結合。為了更進一步的瞭解，Efg1p 是如何影響 ERG3、ERG11

之基因表現量。因此，將E box 之 consensus sequence (5’- CANNTG-3’)和 EFG3、ERG11 其 promoter region( -1000 ~ -1 of ORF)作比對。結果顯示，ERG3 及ERG11 此二基因之 promoter 區域並沒有 E box consensus sequence（表三、

表四）。所以，Efg1p 有可能不是直接經由 protein-DNA 的交互作用而達到 調控功能; Efg1p 可能是透由其它調控子的作用而間接地影響 ERG3、ERG11 之基因表現量。

5.2 分析醣解酵素基因生理功能具有抗藥性改變和型態變化

承襲本實驗室以往利用 SSH 技術，得到許多可能與調控菌絲生長或是致 病力的相關基因，分析比對發現其中有些是醣解酵素基因。因此，實驗室(陳 杏芳，2004)將整個生合成途徑上的十一個基因（附圖二），以北方墨點法分 析該基因在野生株 (SC5314)、efg1/efg1 cph1/cph1(HLC54)、

CPH1/CPH1efg1/efg1(HLC52)、cph1/cph1EFG1/EFG1(JKC19)等四菌株內的 表現量差異為何，分析醣解酵素十一個基因的結果中，TPI1、ENO1、GPM1、

PGK1、PYK1 等五個基因表現量差異較為明顯（附圖二）。因此推測此五個 基因的確是有可能和菌絲生長或致病力有所關聯。有鑒於ERGs 的結果，本 研究也想了解，醣解酵素基因是否有可能同時和抗藥性改變有所關聯。至 於為何選用HLC54、HLC52、JKC19 此三突變株，因為，EFG1 為白色念 珠菌transcription factor，具有 helix-loop-helix motif，和 Myc 相似，其過度 表現會誘導酵母菌(在酵母菌中，此基因稱為 PHD1)和白色念珠菌假菌絲的 生長，所以是正向調控型態變化(Stoldt, et al., 1997);CPH1 基因產物同源 (homologous)於 S.cerevisiae 中的 STE12，在白色念珠菌中突變此基因，會 明顯地影響菌絲的生長，也損害血清誘導所長出的germ tube 及菌絲的形成 (Liu, et al., 1994);當 EFG1 和 CPH1 同時被剔除掉時，會破壞菌絲生長的能 力，且無法在巨噬細胞的攻擊下生存(Lo, et al., 1997)，也使得念珠菌在小鼠

模式中沒有致病力，證實Cph1p 及 Efg1p 是白色念珠菌中促進菌絲生長的 獨立途徑(Riggle, et al., 1999)，所以偵測目標基因於此三菌株中的表現量和 野生株中的差異，可知目標基因功能是否和致病力有關，甚至可推測其調 控路徑可能為何。

就實驗方法設計上，採取實驗室常使用的北方墨點法，分析目標基因其 mRNA 於以上所述的四菌株中的表現量差異，更外加了 Candt80/Candt80 突變株的兩個strain。其原因為已知過度表現藥物幫浦 CDR1 基因，是促進 白色念珠菌抗藥性主要的機制之一，而在研究其調控因子時，發現

Candt80/Candt80 突變株，其抗真菌藥物敏感性大於野生株，也就是

CaNDT80 基因會抑制 CDR1 基因的表現(Chen, et al., 2004)，因此為了更能 解讀型態變化和抗藥性途徑的關連為何，多加此突變株。

除此之外，針對致病性的瞭解，在培養菌體時，其培養條件為可誘導白 色念珠菌產生菌絲的環境：37℃、YPD 培養液外加山羊血清，爾後萃取 RNA 進行北方墨點法，分析其mRNA 在野生株 (SC5314)、efg1/efg1

cph1/cph1(HLC54)、CPH1/CPH1efg1/efg1(HLC54)、cph1/cph1 EFG1/EFG1(JKC19) 、Candt80/Candt80(YLO133) 、

Candt80/Candt80(YLO136)等六菌株中的表現量差異。為進一步瞭解目標基 因和抗藥性的關連及其調控途徑可能為何，一樣偵測目標基因在上述六個 菌株中mRNA 表現量差異，把操控變因改為加入抗真菌藥物(miconazole)，

再萃取RNA 進行北方墨點法。

5.2.1 北方墨點法分析 ENO1 基因表現量之探討（表二）（圖四、五）

ENO1 在加血清培養下，在 HLC52（CPH1/CPH1 efg1/efg1）、YLO133

（Candt80/Candt80）、YLO136（Candt80/Candt80）中表現量小於 SC5314

（CPH1/CPH1 EFG1/EFG1），在 JKC19（cph1/cph1 EFG1/EFG1）、HLC54

（cph1/cph1 efg1/efg1）中表現量大於 SC5314（CPH1/CPH1 EFG1/EFG1）。

由此可知，ENO1 可能經由 CPH1 和 EFG1 基因的共同調控而影響型態變化

（圖四、圖十四）。

Enolase 為 ENO1 基因產物。研究指出，當白色念珠菌的 enolase 結合至 plasminogen 會增加人類腦部為血管上皮細胞的侵犯能力(Jong, et al.,

2003)，另外，enolase 也會與細胞壁上的 glucan 結合，而出現在細胞壁內層，

是引起宿主免疫反應的重要因子，常被用來鑑定白色念珠菌入侵深部組織 之標的物，因此enolase 是極有可能參與白色念珠菌的致病過程(Chaffin, et al., 1998)。承襲本節提及醣解酵素基因是否涉及型態致病力途徑，本實驗室 針對ENO1 基因利用北方墨點法、分析單基因突變株及四環黴素調控突變 株，生長情形、芽管試驗、型態變化等，確認ENO1 基因的表現量多寡會 影響生長及型態變化(Yang, et al., 2006)。綜合以上前人研究及本實驗的確 認，顯示白色念珠球菌的ENO1 基因涉及生長及形態途徑。至於致病性則 有待進一步釐清。而ENO1 基因在加血清情形下，於 Candt80/Candt80 突變 株(YLO133、YLO136)中表現量較低，推測 ENO1 可能受 CaNDT80 基因的 調控下影響其他未知性狀或白色念珠球菌對藥物的敏感性，或者是

CaNDT80 基因其未知功能中，可能包含了對型態變化的影響(圖十四)。

為了進一步瞭解 ENO1 基因是否也涉及抗藥性途徑，於菌體培養時，加 入抗真菌藥物(miconazole)培養，萃取 RNA，進行北方墨點法分析，結果顯 示ENO1 mRNA 在每個菌株中的表現差異並不大（圖五）。然而有研究指出，

當白色念珠菌的生物膜形成時，ENO1 基因的表現量也隨之增加

(Garcia-Sanchez, et al., 2004)，而生物膜的產生將菌株和藥物隔絕，使之對 azoles 和 Amphoteric B 產生非常高的抗性(Ramage, et al., 2001)。另外，

enolase 是一個念珠菌細胞壁上的主要 glucan-associated protein(GAPs)，研究 發現，當藥物敏感性菌株，在fluconazole 的處理下，會改變念珠菌上 GAPs 的組成改變，其組成比例變成和抗藥性菌株的組成相當，例如：主要的

GAPs，enolase 和 phosphglycermutase(GPM1 基因產物)的成分減低，而被 exoglucanase 取 而代之。然而，這些 GAPs 具有高抗原性，所以當它在細 胞壁上出現量減低，即減低了抗原性，使得念珠菌不但得以逃避宿主免疫 系統的攻擊，也因改變了GAPs 組成而導致抗藥性(Angiolella, et al., 2002)。

由此看來，ENO1 雖然在 mRNA level 上無法明顯偵測到和抗藥性的關聯 性，但並不代表，其最後展現的生理功能和抗藥性絕對沒有關聯，例如：

有可能在protein level 上有所調控。若有機會得到突變株功能缺失 (null mutant)，仍是可以進行性狀分析。

5.2.2 北方墨點法分析 TPI1 基因表現量之探討（表二）（圖六、七）

在加血清誘導培養下，其mRNA 表現 JKC19（cph1/cph1

EFG1/EFG1）、HLC54（cph1/cph1 efg1/efg1）中小於 SC5314（CPH1/CPH1 EFG1/EFG1），在HLC52（CPH1/CPH1 efg1/efg1）、在 YLO133

（Candt80/Candt80）、YLO136（Candt80/Candt80）約等於 SC5314

（CPH1/CPH1 EFG1/EFG1）。在野生株(SC5314)和雙突變株(HLC54)中的 表現量差異，和實驗室先前(陳杏芳，2004)所得到的結果，呈現逆向趨勢 的解讀，可能是之前實驗室所得到的結果，在操作上並沒有加入internal control，而將 formaldehyde gel 上的 ribosomal RNA 視為定量標準，這樣的 作法並非十分精準，仍得考量電泳圖曝光時間是否得當、雜交反應的一致 性、每個菌株所抽取得到的total RNA 的穩定性差異、、、等等操作誤差。

Triose–phosphate isomerase 為 TPI1 基因產物，研究指出

當白色念珠菌在小鼠系統性感染，Tpi1p 具有引起宿主免疫反應的能力 (Pitarch, et al., 2001)；在極低溫度(－20℃)時，其 TPI1 mRNA 會因此外在 壓力而有大量表現的趨勢(Rodriguez-Vargas, et al., 2002)，而白色念珠菌的 型態變化也受溫度所影響，回顧以上所述文獻，及結合本實驗之北方墨點 法結果，可知 TPI1 基因可能受 CPH1 基因調控而影響型態變化/致病性。

針對 TPI1 基因是否涉及抗藥性途徑，於菌體培養時，加抗真菌藥物誘 導培養下，萃取RNA，進行北方墨點法，結果顯示，TPI1mRNA 表現在 JKC19（cph1/cph1 EFG1/EFG1）、HLC52（CPH1/CPH1 efg1/efg1）中的表 現量和在SC5314（CPH1/CPH1 EFG1/EFG1）相當，在 HJL54（cph1/cph1 efg1/efg1）表現量小於 SC5314（CPH1/CPH1 EFG1/EFG1），但差異性不 到一倍，可見TPI1 也有可能受致病力之調控。在 YLO133

（Candt80/Candt80）、YLO136（Candt80/Candt80）中則小於 SC5314

（CPH1/CPH1 EFG1/EFG1），其差異性相差到一倍之多。由此可知，TPI1 可能受CaNDT80 基因的正向調控。因此，CaNDT80 在驅使 CDR1 的基因 表現，而正向影響藥物幫浦的形成，產生抗藥性(Chen, et al., 2004)的時候，

（CPH1/CPH1 EFG1/EFG1），其差異性相差到一倍之多。由此可知，TPI1 可能受CaNDT80 基因的正向調控。因此，CaNDT80 在驅使 CDR1 的基因 表現，而正向影響藥物幫浦的形成，產生抗藥性(Chen, et al., 2004)的時候，