北方墨點法分析 PYK1 基因表現量之探討

PYK1 其基因產物為 Pyruvate kinase，為催化醣解反應最後一個步驟 (Swoboda, et al., 1993)。PYK1 基因在白色念珠菌感染寄主過程，會引發寄

主的抗體反應(Pitarch, et al., 2001)。此外，M. Andrew Uhl 等人(Uhl, et al., 2003)利用轉位子(transposon)突變技術法，將 Tn7 轉位子插入白色念珠菌 之基因體DNA 片段上，大量複製此片段後，再利用同源置換的原理將此 ＤＮＡ片段轉形回白色念珠菌，進而取得共有18,000 之單股基因突變菌株 的library，最後藉由改變環境因子來培養突變株，利用兩者有效的控制變 因促使菌絲生長，觀察其突變株的型態變化，第一種為加入血清培養，第 二種為營養匱乏(starvation)的調控－將菌體培養在 Spider medium 上。在此 大量篩選下，146 個基因會影響型態變化，其中依其功能可分出七類，而 營養新陳代謝為一類，PYK1 是其中之一的 candidate。文獻進一步指出 PYK1 單套基因突變株皺褶的情形比起野生株沒那麼明顯(Uhl, et al., 2003)，經由 上述文獻回顧，得知PYK1 基因可能涉及型態變化。

本實驗之北方墨點法結果，可知 PYK1 在加山羊血清誘導下，分析其 mRNA 表現量的結果顯示，在 JKC19（cph1/cph1 EFG1/EFG1）、HLC52

（CPH1/CPH1 efg1/efg1）、YLO133 (Candt80/Candt80)、

YLO136(Candt80/Candt80)，其 mRNA 表現量皆約等於 SC5314

（CPH1/CPH1 EFG1/EFG1），但在HLC54(cph1/cph1 efg1/efg1)中的表現量 大於SC5314(CPH1/CPH1 EFG1/EFG1)（圖十），所以由本實驗結果可進 一步推論PYK1 可能藉由 Cph1p 和 Efg1p 共同的調控而影響型態變化（圖 十五）。而且在加藥誘導培養下，於JKC19（cph1/cph1 EFG1/EFG1）、

YLO133(Candt80/Candt80)、YLO136(Candt80/Candt80)，其 mRNA 表現量 約等於SC5314（CPH1/CPH1 EFG1/EFG1），但在 HLC52(CPH1/CPH1 efg1/efg1)、HLC54(cph1/cph1 efg1/efg1)中表現量皆小於

SC5314(CPH1/CPH1 EFG1/EFFG1)（圖十一）。所以，PYK1 可能經由 Efg1p 負向調控而協同影響菌體對藥物的感受性及型態變化（圖十五），符合本 實驗論文所欲研究之目的，找出可協同影響菌體的藥物感受性及型態變化

的基因。

4.2.5 北方墨點法分析 PGK1 基因表現量之探討（表二）（圖十二、十三）

PGK1 之基因產物為 phosphoglycerate kinase，為醣解反應中其中之一的 酵素，而關於此酵素和型態變化/致病性及抗藥性的關連，有以下說法：

白色念珠菌其產生致病力的主要特徵，一個是型態變化，可從blastospores 轉變成菌絲型細胞(hypae)。另一特徵為白色念珠菌可經由細胞壁上的成分 對寄主細胞產生黏附作用（adhesion）(Cutler, 1991; Odds, 1994)。而真菌細 胞壁組成成分為彈性變化，其表現常和一些生理變化過程有關，包含維持 細胞型態、膨壓保護細胞等(Cid, et al., 1995; Klis, 1994)，除了這些重要功能 之外，真菌的致病菌其細胞壁亦是決定致病力的關鍵因素。例如：抗原性 決定因子（antigenic determinants）和黏附作用的產生有關，會經由細胞壁 成分在寄主細胞形成菌落和使得寄主產生免疫反應，更進一步導致致病

（pathogenesis）(Navarro-Garcia, et al., 2001)。所以，有些科學家認為一些 只出現在菌絲型細胞壁上而不出現在酵母型細胞上的蛋白，有可能為導致 白色念珠菌在寄主內產生致病力的因子，其中就有研究指出Pgk1p 即是此 種蛋白之一(Urban, et al., 2003)，因此推論 Pgk1p 的表現可能會影響型態變 化。此推論和本實驗結果相似，當菌體加入血清、YPD 培養液、37℃培養 後，萃取RNA 所進行的北方墨點法結果，其 mRNA 表現量於 JKC19

（cph1/cph1 EFG1/EFG1）、HLC52(CPH1/CPH1 efg1/efg1)、

HLC54(cph1/cph1 efg1/efg1)、YLO133(Candt80/Candt80)、

YLO136(Candt80/Candt80)中表現量明顯低於 SC5314(CPH1/CPH1

EFG1/EFG1)（圖十二），由此結果可進一步推論得知，PGK1 基因可能經由 CPH1、EFG1、CaNDT80 等基因分別調控而可能影響型態變化/致病力或是

其它性狀的改變產生。

另外，關於 PGK1 是否有可能和藥物誘導的白色念珠菌抗藥性機制有所 關連，實驗結果顯示，於加抗真菌藥物培養下，PGK1 基因在 mRNA 表現 量中mRNA 表現量在其他菌株中和長菌絲菌株 SC5314 並無太大差異，但 在YLO133(Candt80/Candt80)、YLO136(Candt80/Candt80)其 mRNA 表現量 略大於SC5314(CPH1/CPH1 EFG1/EFG1)（圖十三），因此，若 PGK1 涉及 抗藥性調控，則較可能直接受CaNDT80 產生作用（圖十五）。

5.3 TPI1 基因性狀分析之探討

由於先前實驗室已建構好了TPI1 單套突變株，加上北方墨點法之結果 推測，TPI1 可能和型態及抗藥性有關，進行 TR-system mutant 之建構。因 此取TPI1 基因為第一優先之分析目標基因。

5.3.1 生長情形之探討

將突變株培養於液態培養液及固態培養皿中，觀察其生長速度。將菌體 在培養液中的生長情形，記錄成生長曲線（圖二十五），從生長曲線的觀察 得知：當tpi1/TPI1::TR 突變株受 TetR 活化而 TPI1 基因過度表現時，其生 長速度大於對照組BWP17/tetR，當 tpi1/TPI1::TR 突變株其 TR promoter 被 doxycycline 抑制，TPI1 基因表現被抑制(down-regulate)時，生長速度比對照 組Bwp17/tetR 慢。從 YPD 和 SD 固態培養皿上的結果(圖二十六、二十七) 得知：當TPI1 基因被 down-regulate 時，其生長速度比起野生株減慢許多;

但TPI1 基因過度表現時，其突變株在 YPD 培養液中，生長速度大於 BWP17/tetR，而其在 YPD 培養基中和野生株 SC5314 的生長情形相似，這 不一致性的結果，可能是因培養時間天數所造成，培養液體中的觀察不到 一天，較短期的現象，而固態培養基是比較長期的觀察， TPI1 過度表現時，

突變株和對照組的最終的生長速度可能是一樣的。

5.3.2 型態變化之探討

針對TPI1 過度表現和抑制表現時，利用 YPD 培養皿外加血清的誘導，

發現其tpi1/TPI1::TR 突變株在不加藥(-DOX)，也就是 TPI1 基因過度表現之 下，其單一菌落的外觀與野生株SC5314 相似，外觀皺摺，面積也相當(約 4cm²)。當 tpi1/TPI1::TR 突變株在不加藥(-DOX)，也就是 TPI1 基因表現被 抑制時，其單一菌落的面積小於野生株SC5314 或是 tpi1/TPI1::TR 突變株在 不加藥(-DOX)情形下的菌落，面積約為 0.11 cm²，只有其1/36 的大小，明 顯小許多（圖二十八）。

進一步，進行芽管實驗瞭解芽管是否生成，結果顯示TPI1 過度表現的 情形和TPI1 表現被抑制下，芽管皆有生成（圖二十九）。為了在更一步瞭 解，觀察到芽管生成是否是因觀察時間點較短，而看不出性狀差異，所以 再一步將時間點增長為隔夜培養（18 hr），結果顯示，當TPI 基因過度表現，

其生成的增長型菌絲和野生株SC5314 差不多，但當 TPI1 基因表現被抑制 時，沒有增長型菌絲的生成（圖三十）。

另外，觀察突變株在單純只有血清提供營養的環境下，其單一菌落菌絲 分佈情形，結果顯示，當TPI1 過度表現，其菌絲毛茸的放射性存在，但菌 絲的濃密度比野生株SC5314 低，當 TPI1 基因表現被抑制時，其沒有毛茸 的菌絲生成，但輪廓也不像cph1/cph1 efg1/efg1 雙突變株為一個完整圓形，

而是呈現斑駁塊狀（圖三十一）。這樣菌絲生長的情形，可與侵犯力實驗作 連結（圖三十二）。當TPI1 基因被抑制時，雖有芽管生成，但菌體變小，

沒有增長型菌絲生成，單一菌落也沒有毛茸的放射狀分佈，對於solid spider 的侵犯力也相當低，在固定水量(水龍頭水不關)，沖刷 tpi1/TPI1::TR(+DOX) 突變株離開培養基的時間不到一分鐘，全部菌落脫落，而對照組

cph1/cph1efg1/efg1 突變株的脫落時間為一分三十秒。所以，可推測 TPI1 和 型態變化的相關性極高，所造成的型態變化，有可能影響到真菌聚落能力

和入侵寄主細胞的能力，而影響致病力。

5.4 未來展望

第一、由北方墨點法的分析，可知 TPI1、GPM1、PYK1、PGK1 之表現 皆可同時受血清及藥物之調控，因此可以針對這些基因進行突變分析，瞭 解其在型態、入侵能力及抗藥性之影響。

第二、TPI1 基因在本論文研究下，證實了其基因功能會影響型態變化，

但這是在TR-system 下所得到的結果，而此 gene targeting 之方法，進行單 套基因之破壞及TR-system 調控目標基因過度表現及抑制表現的機制，在研 究上的穩定性，是否能夠完全抑制目標基因、是否會受其他的未知的調控 子所影響等問題仍被探討中，所以如能得到TPI1 null mutant，不僅可作為 此系統的對照，也有利於將來進行藥物敏感性實驗(E-test)，為本研究最終 的目的，瞭解TPI1 基因功能和型態變化及抗藥性的關連性。

第六 第 六章 章、 、參 參考 考文 文獻 獻

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