白色念珠菌之致病力/型態變化及抗藥性可經由麥角固醇生合成及醣解酵素基因進行協同調控

國 立 交 通 大 學

生化工程研究所

碩 士 論 文

白色念珠菌之致病力/型態變化及抗藥性可經由

麥角固醇生合成及醣解酵素基因進行協同調控

Linking morphology/virulence and drug resistance

via ergosterol biosynthesis and glycolysis pathways

in Candida albicans

研 究 生：蕭婷尹

指導教授：楊昀良 博士

白色念珠菌之致病力/型態變化及抗藥性可經由

麥角固醇生合成及醣解酵素基因進行協同調控

Linking morphology/virulence and drug resistance via

ergosterol biosynthesis and glycolysis pathways

in Candida albicans

研 究 生：蕭婷尹 Student：Ting-Yin Hsiao

指導教授：楊昀良 Advisor：Dr. Yun-Liang Yang

國 立 交 通 大 學

生 化 工 程 研 究 所

碩 士 論 文

A Thesis

Submitted to Institute of Biochemical Engineering

National Chiao Tung University

in partial Fulfillment of the Requirements

for the Degree of

Master

in

Biochemical Engineering July 2006

白色念珠菌之致病力/型態變化及抗藥性可經由麥角固醇生合成 及醣解酵素基因進行協同調控 研究生：蕭婷尹 指導教授：楊昀良 博士 國立交通大學生化工程所 碩士班 摘要 白色念珠菌是一種伺機性病原菌。在探討致病力的實驗中發現，EFG1 及 CPH1 基因的雙突變株在 in vitro 實驗中會失去形成菌絲的能力，且對小 鼠是不致病的，因而得知白色念珠菌的致病力與其在酵母菌型與菌絲型之 間的型態轉變有關。先前本實驗室利用抑制刪除雜交法（SSH）篩選和致病 力調控有關的基因時，得到麥角固醇生合成 ERG3 和 ERG11 基因。有趣的 是，這兩個基因的已知功能是影響念珠菌對於藥物的敏感性。本篇論文之 第一個研究目標：探究麥角固醇生合成基因是否和致病力及抗藥性途徑皆 有關連。實驗策略以北方墨點法分析 ERG3

、

ERG11 基因表現量。結果顯示， ERG3 和 ERG11 在 efg1/efg1 cph1/cph1 突變株 (HLC54)和 efg1/efg1

CPH1/CPH1(HLC52)的 mRNA 表現量大於野生株(SC5314)。同時也發現白 色念珠菌之致病因子 Efg1 會經由負向調控 ERG3 基因而改變對真菌藥物的 敏感性。再者實驗室曾針對醣解酵素所有生合成途徑進行研究，以北方墨 點法檢驗基因之表現，發現其中五個基因 ENO1、TPI1、GPM1、PYK1、PGK1 其 mRNA 表現量於酵母菌型菌體(cph1/cph1 efg1/efg1)中及長菌絲型菌體 (CPH1/CPH1 EFG1/EFG1)中不同。因此，本篇論文之第二研究目標：經由 北方墨點法瞭解此五個醣解酵素基因是否和致病力/型態變化及抗藥性途徑 皆有關連。結果顯示，TPI1、GPM1、PYK1、PGK1 之表現皆可同時受血清 及藥物所影響。為進一步探討其機制，並且選擇 TPI1 以同源重組的方式將 四環黴素調控表現系統置入其啟動子區域作基因功能之研究，目前已知， TPI1 與型態變化、細胞生長有關，但和抗藥性途徑的關係仍有待探討。

Linking morphology/virulenc and drug resistance via ergosterol biosynthesis and glycolysis pathways in Candida albicans Student:Ting-Yin Hsaio Adviser: Dr. Yun-Liang Yang

Institute of Biochemical Engineering National Chiao Tung University

ABSTRACT

Candida albicans is an opportunistic fungal pathogen in humans. It has been

reported that the cph1/cph1 efg1/efg1 double mutant of C. albicans is defective in filamentous growth and is also avirulent in a mouse model. The ability of C.

albicans to switch between a yeast form and a filamentous form has been

implicated in its virulence. Previous comparative genomics studies have profiled the expression differences between the wide-type and the cph1/cph1 efg1/efg1 double mutant strains by the method of Suppression Subtractive Hybridization (SSH) and sequence analysis. Two ergosterol genes, ERG3 and ERG11, were isolated. Mutations in ERG3 or ERG11 can alter the susceptibility of antifungal drugs in Candida albicans. Therefore, the first aim of this study was to

investigate the coordination of morphogenesis/ virulence and drug resistance via ergosterol biosynthesis genes. The mRNA expression levels of these two genes were assessed by northern blot analysis. The results shown that the mRNA levels of ERG3 and ERG11 were higher in the cph1/cph1 efg1/efg1 double mutant and

CPH1/CPH1 efg1/efg1 mutant than that in the wild-type cells, suggesting a

negative regulation of ERGs by EFG1. And it has been proven that in addition to virulence, Efg1 was also involved in drug resistance by negatively regulating

ERG3 of the ergosterol biosynthesis pathway in C. albicans.

Furthermore a previous study has shown that ENO1、TPI1、GPM1、PYK1and

PGK1 of glycolytic genes expressed differently in cph1/cph1 efg1/efg1 double

mutant and in wide-type strain. Thus, investigating the linkage of

morphogenesis/virulence and drug resistance via glycolysis genes was the other purpose of this study. The results indicated that the expressions of TPI1, GPM1,

PYK1 and PGK1 could be affected by the presence of goat serum and antifungal

drug. Besides, TPI1 gene was subjected to genetic study by introduction of tetracycline-regulated system. These results indicated that TPI1 gene was

associated with morphogenesis and also involved in cell growth. Whether TPI1 gene is involved in drug resistance will require further studies.

誌 謝 三年來的研究所生涯結束了，人生新的旅程緊接著展開。回首過去，從 大學時期的專題到研究所碩士論文的完成，幫助我最大的莫過於指導教授 楊昀良老師。由於老師一路上耐心指導與寬容接納我的不足，讓我明白如 何精準地表達學術用語以及培養我組織化與解決問題的能力，甚至在最後 一個階段仍細心地修改我的碩士論文，協助我釐清概念及邏輯。同時，也 感謝口試委員林苕吟老師與藍忠昱老師在口試及論文修改上給予了諸多寶 貴的意見，受益良多。在此，衷心地感謝老師們對我的用心栽培。 實驗室的生活，時而振奮人心，時而低落，每當遇到困難時，所幸周遭 有著一群彼此加油打氣、互相切磋的好夥伴。早在還沒進研究所前，已接 受到采瑜學姐、明浩學長、美惠學姐、雅文學姐等的溫暖關懷。碩一時， 杏芳學姐帶著我學習北方墨點法的技術，雅文學姐更是我時常請益的對 象。實驗室生活中，出現了四位好同學：我的好姊妹柏吟、細心且好脾氣 的建斈、活潑的馥嘉、專業且認真的宛真。碩二時，實驗室來了學弟妹： 口條清晰且做事俐落的怡瑾、聰明且洋派的歐陽、為人客氣的志豪、幽默 風趣的杏枚。爾後，又有金蓉、育穎、欣彬加入研究所行列。當然，實驗 室少不了一群年輕又有朝氣的專題生：逸修、政毅、虹綾、志轅、欣悟、 曜禎、大馨、瀞云、佳叡、萍芳、伯伶、宗翰等。因為這一群人，使得實 驗室充斥著一股陽光的氣氛。在此，我要感謝所有的人，因為你們讓我的 研究所生活更加精彩！ 最後，也要謝謝在初踏入生科研究領域的專題生時期，所接觸到的良師 與益友們：國衛院羅秀蓉老師、逢叡、佳君學姐、大勳等的指導，啟蒙了 我對生科的熱忱。還有一路走來，陪伴著我的社團老師、同學和親愛的家 人，爸媽的支持，兄弟姊妹的關心與照顧。甚至是在我研究所階段離開人 世間的爺爺、奶奶，我知道，不管你們在哪，依然會眷顧著我。 面對未來，我相信這三年所學的必定可學以致用，正因為有大家的支 持與協助，它將成為我人生旅途中美麗的瑰章。

目錄

頁次 中文摘要………...i 英文摘要………...…...ii 誌謝……….iii 目錄……….iv 圖表目錄………..…….viii 附圖目錄………...…...x 一、緒論………..……...……1 1.1 白色念珠菌………...…... . 1 1.2 致病因子……… … … … … . . 2 1.3 真菌藥物種類及抗藥機制..………...6 1.4 研究緣起及目的………11 二、材料………...13 2.1 菌株………13 2.2 質體………14 2.3 引子………14 2.4 藥品試劑………16 2.5 緩衝溶液及溶劑………18 2.6 培養基配製………... 20 2.7 儀器設備………21 三、方法………..22 3.1 北方墨點法………..………22

3.1.1 製備 DNA 探針（DNA probe labeling）………..…22

3.1.1.1 Random-priming DIG labeling…..………...…...22

3.1.1.2 PCR DIG labeling………22

3.1.2.1 加血清誘導培養………23 3.1.2.2 加抗真菌藥物誘導培養………....23 3.1.3 萃取 RNA（RNA extraction）...24 3.1.4 轉漬 RNA（Transfer）...25 3.1.5 雜交反應（Hybridization）………26 3.1.6 偵測（Detection）………...26 3.1.7 定量……….26

3.2 檢查 TPI1 單套基因(Heterozygous knockout)破壞株……… ..27

3.2.1 抽取染色體 DNA………..27

3.2.2 利用 PCR 檢查 TPI1 單套基因(Heterozygous knockout)破壞株…….27

3.3 於 TPI1 置入四環黴素調控系統………....28 3.3.1 限制酶切割反應…….………....28 3.3.2 進行白色念珠菌轉形作用……….………....28 3.3.3 抽取染色體 DNA…….………..28 3.3.4 PCR 確認 TR 系統之突變株……….29 3.4 性狀分析……….29 3.4.1 觀察突變株生長曲線………...29 3.4.2 菌落生長情形………30 3.4.3 觀察單一菌落生長情形………30 3.4.4 芽管試驗………30 3.4.5 觀察增長型菌絲實驗………30 3.4.6 觀察菌株於含 4％血清 Bacto-agar 培養皿的生長情形……….30 3.4.7 侵犯力分析(Invasion assay)………..30 四、結果………..32 4.1 北方墨點法分析抗藥性基因於誘導生長菌絲環境下的表現量……….32 4.1.1 ERG3 之基因表現量……….32 4.1.2 ERG11 之基因表現量………...32

4.2 醣解酵素基因之北方墨點法………...33. 4.2.1ENO1 之基因表現量……….33 4.2.1.1 ENO1 於誘導菌絲生長環境中之北方墨點法結果………….33 4.2.1.2 ENO1 於誘導藥物感受性發生之北方墨點法結果………….34 4.2.2 TPI1 之基因表現量………..34 4.2.2.1 TPI1 於誘導菌絲生長環境中之北方墨點法結果………34 4.2.2.2 TPI1 於誘導藥物感受性發生之北方墨點法結果…………...34 4.2.3 GPM1 之基因表現量………35 4.2.3.1 GPM1 於誘導菌絲生長環境中之北方墨點法結果………….35 4.2.3.2 GPM1 於誘導藥物感受性發生之北方墨點法結果………….35 4.2.4 PYK1 之基因表現量……….35 4.2.4.1 PYK1 誘導菌絲生長環境中之北方墨點法結果………35 4.2.4.2 PYK1 誘導藥物感受性發生之北方墨點法結果………35 4.2.5 PGK1 之基因表現量………36 4.2.5.1 PGK1 於誘導菌絲生長環境中之北方墨點法結果……….. 36 4.2.5.2 PGK1 於誘導藥物感受性發生之北方墨點法結果………...36 4.3 目標基因 TPI1 的突變………36 4.3.1 確認 TPI1 單套突變株的正確性……….36 4.3.2 TPI1 四環黴素調控表現系統突變株之建構………..37

4.3.2.1 限制酶反應製備帶有 TPI1 同源序列、TR promoter 及 URA3 篩選標記………..37

4.3.2.2 以 PCR 確認 TR promoter 及 URA3 標記是否置入 （knockin） TPI1 基因………...37

4.4 TPI 突變株的性狀分析………...38

4.4.1 觀察生長曲線………...38

4.4.2 觀察菌落生長情形………...39

4.4.4 芽管試驗（Germ tube assay）………39 4.4.5 觀察增長型菌絲實驗………39 4.4.6 觀察菌株於含 4％血清 Bacto-agar 培養皿上的生長情形……...40 4.4.7 侵犯力分析(Invasion assay)………..…40 五、討論……….41 5.1 初步證實白色念珠菌中，抗藥性和致病性途徑的相關連………..41 5.2 分析醣解酵素基因生理功能具有抗藥性改變和型態變化………..42 5.2.1 北方墨點法分析 ENO1 基因表現量之探討………43 5.2.2 北方墨點法分析 TPI1 基因表現量之探討……….45 5.2.3 北方墨點法分析 GPM1 基因表現量之探討………..46 5.2.4 北方墨點法分析 PYK1 基因表現量之探討………..47 5.2.5 北方墨點法分析 PGK1 基因表現量之探討………..49 5.3 TPI1 基因性狀分析之探討……….50 5.3.1 生長情形之探討……….50 5.3.2 型態變化之探討……….50 5.4 未來展望………..52 六、參考文獻………..53 圖表……….65 附圖………...96 簡歷………...101

圖表目錄

頁 次

表一、白色念珠菌之麥角固醇生合成基因功能整理表………66

表二、醣解酵素基因分別於YPD＋goat serum (＋S)及YPD＋Drug環境中的 表現………...69

表三、Efg1之consensus binding sequence和ERG3之promoter region比 對的結果………...70

表四、Efg1之consensus binding sequence和ERG11之promoter region 比對的結果………...72 圖一、ERG3的北方墨點法……….74 圖二、ERG11 的北方墨點法………...75 圖三、ERG3、ERG11 涉及抗藥性及型態變化的可能途徑...75 圖四、ENO1 於血清誘導培養下之北方墨點法結果………..76 圖五、ENO1 於藥物誘導培養下之北方墨點法結果...76 圖六、TPI1 於血清誘導培養下之北方墨點法結果………77 圖七、TPI1 於藥物誘導培養下之北方墨點法結果………77 圖八、GPM1 於血清誘導培養下之北方墨點法結果………78 圖九、GPM1 於藥物誘導培養下之北方墨點法結果………78 圖十、PYK1 於血清誘導培養下之北方墨點法結果……….79 圖十一、PYK1 於藥物誘導培養下之北方墨點法結果……….79 圖十二、PGK1 於血清誘導培養下之北方墨點法結果……….80 圖十三、PGK1 於藥物誘導培養下之北方墨點法結果……….80 圖十四、ENO1

、

TPI1 調控途徑示意圖………..81 圖十五、GPM1

、

PYK1

、

PGK1 調控途徑示意圖………..82 圖十六、確認 TPI1 單套基因突變株正確性之 PCR 之引子設計圖……… .83 圖十七、PCR 確認 TPI1 單套基因突變株之結果………83

圖十八、建構 TPI1 四環黴素調控系統示意圖………..84

圖十九、確認四環黴素調控之突變株之引子設計圖……….85

圖二十、PCR 結果之電泳圖………..………..85

圖二十一、進一步確認四環黴素調控系統正確性的 PCR 引子設計圖…....86

圖二十二、PCR 結果之電泳圖………86

圖二十三、用於確認 BWP17/tetR 中的 TPI1

之

TR construction 的 PCR 之引 子設計圖...87 圖二十四、PCR 結果電泳圖………...87 圖二十五、TPI1 突變株之生長情形………....88 圖二十六、觀察 tpi1/TPI1::TR 突變株於 YPD 固態培養皿上的生長情形…89 圖二十七、觀察 tpi1/TPI1::TR 突變株於 SD 固態培養皿上的生長情形...90 圖二十八、觀察 tpi1/TPI1::TR 突變株單一菌落型態變化……….……91

圖二十九、Germ tube assay………92

圖三十、在含山羊血清中之 YPD 培養液中的生長……….94

圖三十一、突變株於含 4％血清 Bacto-agar 培養皿上的菌落型態…………95

附圖目錄

頁次

附圖一、白色念珠菌麥角固醇生合成途徑………..97 附圖二、白色念珠菌醣解作用………..98 附圖三、建構四環黴素調控表現系統之示意圖………..99 附圖四、白色念珠菌之 EFG1 的 null mutation 會增加菌體對藥物的敏感性 ……….…100

第

第

一

一

章

章

、

、

绪

绪

論

論

1.1 白色念珠菌 白色念珠菌，為具有多型態的真菌，可以酵母菌（yeast form）、假菌絲 （pseudohyphae）、菌絲（hyphae）型態存在。從人類小嬰兒期，便存在人 體的表面皮膚、腸道、陰道以及口腔內等黏膜組織。正常情況下，為人體 內的正常菌叢，但當人體的抵抗力降低了，或是念珠菌的數量增加太多的 時候，就會成為致病菌，造成各種疾病，即是所謂的『伺機性致病菌』。 然而，念珠菌（Candida species）在 1960 年代以前是人類感染疾病中罕見 的致病菌（陳宜君，2003），但隨著醫療科技的發達，治療方式的改變， 或者，因疾病造成免疫系統變弱，使得病例增加，例如：癌症治療、器官 或骨髓移植或AIDS 等(Marr, et al., 1998)，促使院內真菌感染的比率在近年 來不斷地升高。在台灣，目前院內感染的統計，真菌培養後分離出之菌種 中白色念珠菌（Candida albicans）所佔比例至少約一半且可高達 60﹪

(Hsueh, et al., 2002)。念珠菌感染的影響除了高死亡率外（(Barelle, et al., 2003)，通常造成病患住院時間延長，增加醫療成本的負荷。 雖然白色念珠菌成為近年來院內感染的主要致病菌之一(Chen, et al., 1997)，然而，目前可用以治療真菌的藥物不多，且有某些真菌治療效果不 佳、抗藥性問題亦日漸增加及具有副作用等問題(White, et al., 1998)，暴露 出治療真菌感染的危機。所以，了解其致病因子（virulence factor）及抗藥 機制，作為尋找新藥物目標（drug target）的契機，盼能發展出更有效、低 副作用、藥效性長的藥物，是目前發展的方向之一。

1.2 致病因子

念珠菌感染的致病因子，目前所知，可略分為四類：第一、當環境改變 時，念珠菌產生菌絲（hyphal formation）的細胞型態變化；第二、念珠菌 於宿主細胞產生黏附；第三、分解蛋白酶的分泌(Haynes, 2001)；第四、念 珠菌其平滑白色的white phase(W)和 opaque phase (O)之間的 phenotypic switching(Lan, et al., 2002; Slutsky, et al., 1987)。以下簡介這些因素： 1.菌絲生長 白色念珠菌為多種型態之菌體，隨著環境的改變，可以轉變於酵母菌型 （yeast form）、真菌絲（hyphae）、假菌絲（pseudohyphae）之間，惟真菌絲 和假菌絲之間的關係仍未清楚明瞭。但已經知道在細胞週期中，它們型態 明顯不同；真菌絲是由酵母菌狀細胞以芽管(germ tube)的方式繼續往外生 長，且膈膜緊跟著延伸而逐漸形成；而假菌絲的形狀相較於延展中的細胞 來的小，比真菌絲多一層隔膜(Merson-Davies and Odds, 1989)，其隔膜未隨 菌體延伸，在倒立式顯微鏡下觀察，看起來就像是一條條的臘腸相連在一 起。 如上所述，在環境的轉變下，白色念珠菌可從單細胞的酵母菌型轉變為 多細胞菌絲型。早先由於發現菌絲細胞藉由菌絲可以較快的速度黏附及入 侵寄主細胞，由此推測白色念珠菌可能藉此促進其致病力(Leberer, et al., 1997)。近來，已發現白色念珠菌隨著不同環境做改變所產生的型態變化時， 細胞體內有些轉錄訊號在此扮演重要角色，白色念珠菌中的CPH1、HST7、 CST20 基因產物同源(homologous)於 S.cerevisiae 中的 STE12、STE7、

STE20，而進一步發現，在白色念珠菌中突變任何一個上述基因，都會明顯

地影響菌絲的生長，也損害血清誘導所長出的germ tube 及菌絲的形成(Liu, et al., 1994)。另外，研究發現白色念珠菌

△

efg1/

△

efg1 突變株在小鼠中會降

(Weide and Ernst, 1999)。EFG1 為白色念珠菌 transcription factor，具有 helix-loop-helix motif，和 Myc 相似，其過度表現會誘導酵母菌(在 S.cerevisiae 中，此基因稱為PHD1)和白色念珠菌假菌絲的生長，所以是正向調控型態

變化(Stoldt, et al., 1997)。當 EFG1 和 CPH1 同時被剔除掉時，會破壞菌絲 生長的能力，且無法在巨噬細胞的攻擊下生存(Lo, et al., 1997)，也使得念珠 菌在小鼠模式中沒有致病力。然而，隨後之研究指出cph1/cph1 efg1/efg1 突

變株於in vivo 下仍可長出菌絲，造成輕微的鵝口瘡、眼睛表皮細胞損害、

colonize 在免疫不全 gnotobiotic piglet 的舌頭上(Riggle, et al., 1999)，所以 Cph1p 及 Efg1p 是白色念珠菌中促進菌絲生長的獨立途徑(Riggle, et al., 1999)，但並未包括所有途徑。例如：TUP1 則是個型態變化的負向調控子 (Braun and Johnson, 1997)，其

△

tup1/

△

tup1 突變株會促使菌株之菌絲生長，

致病力變弱、小鼠致死率減低(Braun, et al., 2000)。由以上文獻回顧可知， 在菌絲及酵母菌型態間轉換的能力是致病力的關鍵。 2、 黏附作用 附著至宿主組織上，避免被宿主免疫防禦系統消滅，為一般病菌入侵宿 主的首要侵略步驟，白色念珠菌也不例外，當其散佈於寄主血液中，會藉 由黏附於血管內襯的表皮細胞，進而入侵組織(Filler, et al., 1996)，而此黏附 作用主要受由專一性的黏著素（adhesin）和接受器（receptor）的交互作用 所調控。於1991 年，已知 Candida albicans 及 Candida tropicalis (Asakura, et al., 1991)，在活體外測試時，其黏附宿主細胞的能力遠大於非致病性微生 物。研究報告指出，當白色念珠菌在活體外時，減低其黏附能力時，也會 破壞其感染動物（animal models）的能力(Calderone and Fonzi, 2001)，且當 此菌體具有較高黏附口腔黏膜細胞的能力，及可以產生更多的細胞外基質 蛋白分解酶時，也會提升白色念珠菌在小老鼠體（mouse model）內的致死 率(Ghannoum and Abu Elteen, 1986)。

至於在作用機制方面的瞭解，已知念珠菌會與含有 RGD (Arg－Gly－ Asp)motif 的蛋白質有相互作用，例如：纖維黏連蛋白（fibronectin）及 iC3b(Hostetter, 2000)，白色念珠菌的 Int1p 便有這樣的功能。INT1 的基因產 物為真菌細胞表面成分，為一種iC3b-binding RGD 蛋白質，和哺乳類動物 所具有的黏連蛋白 (integrins)相似，INT1 在 S. cerevisiae 中表現時，可以誘 導凝結作用的產生（aggregation）(Gale, et al., 1996)，並且刺激類似 germ tube 的管狀物生成，這些結果，足以引導在一般狀態下不具有黏附力的酵母菌 型細胞，產生黏附力，附著到人體的上皮細胞上(Gale, et al., 1998)。而在白 色念珠菌中，INT1 基因的剔除，則導致念珠菌在某些培養基中產生型態變

化，抑制了菌絲的生成、減低黏附力及在小老鼠體內的致病力(Gale, et al., 1998)。另外，在白色念珠菌上，有一群蛋白具有的特性類似 S.cerevisiae 的 細胞表面黏附醣蛋白的Agglutinin-like sequence (ALS) (Hoyer, et al., 1995; Lipke, et al., 1989)，這些蛋白後來被發現會造成黏附作用，而稱為 ALS 蛋 白質(Fu, et al., 1998)。的確，黏附作用會造成感染宿主的機會增加，但和致 病過程之間的關連尚未明確。

當白色念珠菌要侵入寄主時，其細胞壁也發生重大改變，因為細胞壁的 功能主要展現於保護細胞、生長作用所需及對抗滲透性外力有關，當細胞 表面的配體（ligands）或菌體的表面分子（biomolecules）和受體（receptors） 交互作用時，會促進其對於宿主細胞及組織的植入(Braun and Johnson,

1997)，而這些生物分子多由多醣類（polysaccharides）或醣蛋白（glycoprotein） 組成，能與宿主的內皮細胞或細胞外基質蛋白（extracellular matrix protein； ECM protein）結合，達到附著的目的。

3、 蛋白分解酶(Secreted factors)

白色念珠菌中已知和致病力有關的水解酵素有：Secreted aspartic proteinase(SAPs)、phospholipases、lipase 等。SAPs 至少由九個 member 組

成(Hube, et al., 1994; Magee, et al., 1993; Monod, et al., 1998; Monod, et al., 1994)。它們在不同的環境之下可能會表現不同的 member，例如：SAP2 在 酸性pH 值下表現， SAP4-6 在中性 pH 值下表現(Hube, et al., 1994; Schaller, et al., 1999; Schaller, et al., 1998)。另外，SAPs 各個 member 結合起來的功能 為促進念珠菌具有致病力的主要驅動力，如SAP2p 是負責入侵步驟使菌體 得以穿越內皮層的屏障(Ibrahim, et al., 1998)，也是造成念珠菌在小鼠陰道模 式中具有致病力的主因(De Bernardis, et al., 1999)；而 SAP4p-6p 扮演逃避巨 噬細胞的吞噬作用而使菌體得以生存(Borg-von Zepelin, et al., 1998)；當

SAP1(PEP1)失去表現時，會導致菌體在新生的老鼠皮膚上開始聚集 (colonization)，影響念珠菌入侵寄主能力，導致致病力減低(Hube, et al., 1997)。SAPs 所扮演的酵素生化活性主要在於入侵寄主細胞及疾病的擴散， 因為SAPs 的受質範圍很廣，能分解許多宿主上的蛋白，如：免疫球蛋白、 膠原蛋白、白蛋白、血紅素、角質及其他細胞蛋白等(Hube, et al., 1997)。這 些受質被分解後，可提供菌體生長養分、避免免疫系統攻擊。 而Phospholipase 為 PLB1 基因產物，研究指出菌體剔除掉 PLB1 基因後並 不會造成黏附作用的改變，但會減低菌體的侵犯能力，對老鼠的毒性也降 低，亦較少引發免疫反應(Leidich, et al., 1998)，但其對人類感染所扮演的角 色和功能並未完全清楚。

4. White(W) and Opaque switch phenotypes

白色念珠菌中，在人體最主要的致病機制為可自發、可逆性且高頻率的 發生轉換型態，可分為三種主要的轉換系統，第一、白色念珠菌株3153A 其型態變化的轉換，可分為七種不同型態間的互換(Soll, 2002; Soll, et al., 1987)。第二、白色念珠菌會從含有濃密的 myceliation 及沒有 mycelation 的 菌體間轉換(Soll, et al., 1987)。第三、從病人分離出來的白色念珠菌株 WO-1，可從白色半球型，表面亮滑的菌落型 white(W)轉換成灰色扁平的菌

落型opaque(O)，W/O 的 phenotypic switching 影響到細胞的形狀和大小，而 影響到菌絲的形成、細胞表面特性(例如：黏附力、 滲透力等)、細胞膜的 組成、抗藥物敏感性等性狀特徵(Lan, et al., 2002; Slutsky, et al., 1987)。

1.3 真菌藥物種類及抗藥機制 從 1980 年代開始，關於抗真菌藥物的抗藥性問題已大量地被研究，累積 了從臨床上、生化、基因觀點的知識，但從分子層次解讀抗真菌藥物問題， 在90 年代才算真正開始，加上目前真菌治療方面的困難，這方面探討將成 為被高度重視的研究領域(White, et al., 1998)。本實驗室也致力於此，探討 真菌抗藥性問題。接下來，將從目前臨床常用抗真菌藥物的種類與抗藥機 制兩方面作概述。 第一部分，就目前臨床真菌用藥可分為三類：Polyenes、ergosterol biosynthesis inhibitors、5-flucytosine。除了 5-flucytosine 之外，其他兩類藥 物皆是直接作用在與麥角固醇相關的活性表現及目標上，而麥角固醇為真 菌細胞膜上的主要固醇類，其成分和哺乳類細胞的膽固醇相似，扮演維持 真菌細胞膜的流動性及完整性，及影響一些膜上酵素其蛋白質功能的穩定 性，例如：基丁質合成酶（chitin synthetase），其功能為細胞分裂及細胞成 長。此三類藥物其作用原理詳述於下： 1、 Polyenes：此類藥物主要作用於含麥角固醇的細胞膜上，其常見的 藥物包含amphotericin B（以下簡稱為AMB）、nystatin，其結構上具有雙極 性，一端為親水性、另一端為疏水性，會嵌入細胞膜內，在細胞膜上形成 通道，使得細胞膜的質子（主要是鉀離子梯度）被破壞。AMB為一種土 壤中的放射線菌( Actinomycetes )，Streptomyces nodosus 的醱酵產物，它

可和細胞膜上麥角固醇結合，形成孔洞而造成細胞死亡，AMB也可和哺 乳類細胞膜上的膽固醇結合，惟親合力較低，但仍會造成毒性。它也可抑 制膜上的酵素來達到作用，如黴菌的proton APTase及哺乳類的Na＋/K＋-

ATPase 等。在體外可在遠低於標準劑量在血或組織中達到的濃度下表現 出殺菌性 (fungicidal) 的特性，是一種和濃度有關concentration-dependent 抗生素。（孔祥琪、陳宜君，90年）

2、 Ergosterol biosynthesis inhibitors：麥角固醇生合成途徑，從squalene 經由十種以上的酵素合成到最終產物麥角固醇，此類藥物常見的有 allyamines、thiocarbamates、morpholines、azoles等。這些藥物皆是直接作 用在麥角固醇生合成上的酵素，藉由破壞酵素活性而達到抑菌功效。 Allyamines（例如：naftifine、terbinafine）及thiocarbamates（例如： tolnaftate、 tolciclate）作用在催化squalene產生成2,3-oxidosqualene的酵素 （squalene epoxidase；ERG1基因產物）（附圖一）上。 Morpholines(fenpropimorph、amorolfine)作用於此途徑上的兩個酵素：C-14 sterol reductase(ERG24基因產物)（附圖一）及C-8 sterol isomerase(ERG2基 因產物)（附圖一）。

Azole 類藥物包括 imidazoles ( miconazole, ketoconazole ) 和 triazoles ( fluconazole, itraconazole )，作用機轉是經由抑制 cytochrome P450系統的 酵素14-αdemethylase（ERG11基因產物）（附圖一），而抑制黴菌細胞 膜上的主要成分麥角脂醇 ( ergosterol ) 的合成，作用過程主要是使得結 合酵素輔酶（heme）無法活化氧分子而破壞酵素去甲基化的功能(White, et al., 1998)，當ERG11功能被抑制時，其受質lansterol則會受到△5,6－

desaturase(ERG3基因產物)（附圖一）催化行程3,6-diol衍生物，此衍生物 大量堆積於體內，造成細胞毒性(Sanglard and Odds, 2002)。而針對azole 類藥物產生的抗藥機制，則主要是（一）、突變造成demethylase的結構型 態變化，降低了azole類藥物對於demethylase的親和力。（二）、ERG11 基因(demethylase gene)及和藥物幫浦調控基因的過度表現也會造成抗藥 性的結果產生。（三）、ERG3突變，因此無法進行3,6-diol衍生物之合成。

3、 5-Flucytosine(5-FC)：此類藥物作用機轉完全不同於azole物。Cytosine permease將5-FC帶入細胞內後，被cytosine deaminase作用後，變成 5-fluorouracil(FU)，另外，5-FC可專一性作用於真菌，因為哺乳類細胞中 只含微量的Cytosine permease，甚至是沒有此類滲透酶。FU再經由細胞內 的代謝嘧啶的相關酵素作用後，產生5-fluoro-dUMP(FdUMP)及 5-fluoro-UTP(FUTP)，然而，FdUMP可專一性抑制DNA合成中重要酵素 (thymidylate synthetase)，FUTP可嵌入RNA分子，透由以上兩步驟達到干 擾蛋白質生成。惟因抗藥性問題普遍，在臨床上治療的角色已變的非常輕 微。 1950 年代以後，靜脈注射amphotericin B deoxycholate是過去四十年來對 於威脅生命之真菌感染的全身性藥物治療的主流，但受限於其和劑量相關 的腎毒性，所以此藥通常視為最後防禦線。相對於 AMB 的殺菌性

( fungicidal )，azoles 被認為是一種抑菌性(fungistatic) 的抗真菌藥物。不過 利用真菌藥物治療疾病，其宿主的免疫系統必須是健康的，否則會一再復 發。所以，並沒有適合的抗真菌藥物以治癒末期愛滋病病人的侵襲性隱球 菌（Cryptococcosis）感染。目前臨床上仍是大量使用azole藥物，然而因其 只能抑菌而非殺菌，造成抗藥性情形與日俱增。 第二部分，關於真菌抗藥性機制方面，抗藥性真菌會利用以下一種或一 種以上的機制來達到抗藥目的。已熟知的機制有三個關鍵因素： 第一，減少藥物在體內的累積，這包含了減低藥物的進入和增加藥物的 排出，但藥物的進入體內機制未明，而藥物排出是臨床上真菌抗藥最重要 的因素之一，目前已知ABC transporter (CDR1、CDR2) 和major facilitator proteins (MDR1)為控制此機制的膜蛋白輸出幫浦 (efflux pumps)，當其大量 表現時，會促進藥物的排出(Sanglard, et al., 2003a)。其細胞功能上的差異， ABC transporters包含四個domains，兩個domains貫穿細胞膜，另外兩個

domains為ATP-binding domains，可水解ATP使物質運送(Jenkinson, 1996)， 藉此將藥物排出，且大部分的azole藥物均為其受質。在抗藥性方面，已確 認與azole類藥物抗藥性有關，臨床上對azole藥物有抗藥性的菌株其CDR1 mRNA表現量比藥物敏感性菌株來得高(White, 1997)，同時CDR1基因缺失 會造成對azole藥物的高敏感性，且對terbinafine、amorolfine、一些代謝抑制 劑也有相同現象(Sanglard, et al., 1996)。但是突變CDR1基因並不影響菌株對 amphotericin B或5-flucytosine的敏感性。另外，針對CDR2基因，不論是高 度表現或基因缺失，都不會對抗藥性有明顯的影響(White, et al., 1998)， cdr2/cdr2突變株沒有提高對azole藥物的敏感性，但臨床抗藥性菌株的CDR2 基因有過量表現的情形且cdr1/cdr1 cdr2/cdr2雙基因突變株比cdr1/cdr1突變 株對藥物有較高的敏感性 (Sanglard, et al., 1996)。目前由分子生物技術鑑定 出超過8個CDR基因，但這些基因與抗藥性的關係還未完全了解。 Azole如何進入菌體內的機制目前還是未知，有研究報告推測，它是經由 被動運輸的方式穿越細胞壁與細胞膜(Timpel, et al., 1998)，穿越此屏障後， 會針對目標酵素－lansterol demethylase(ERG11基因的產物)，此酵素為麥角 固醇生合成途徑上其中一個步驟，爾後可觀察到CDR1和MDR1的基因表現

會減低。而major facilitator protein（MDR），於細胞功能上，利用質子流動 (H＋ _{gradient)作為能量驅動，藉以運送物質，而針對azole藥物，只專一性運} 送fluconazole(Lupetti, et al., 2002; White, 1997)。

第二，改變藥物標的酵素，包括了大量表現、突變、改走其他代替途徑 取代因藥物作用所阻斷的反應，使真菌仍是可合成生長所需的物質，因此，

ERG11的大量表現或是產生胺基酸的定點突變，以降低酵素催化能力或減低

標的酵素和藥物的親和力，而已知某些特定的突變如Y132H、G464S、R467k 等和抗藥性的產生有關係(Franz, et al., 1998; Marr, et al., 1998; White, 1997)。

法有效合成過多的毒性中間產物14α-methyergosta-8,24(28)-dien-3β,6α -diol，即使azole抑制Erg11，細胞仍是可以繼續生長，使C.albicans對azole 敏感性降低。又因此時麥角固醇的含量很低，使得菌株對amphotericin B產 生交錯抗性(cross-resistance)(Kelly, et al., 1996)。 第四，藥物失去活性。經由抑制某些特定酵素的功能，這些酵素可以 將沒有活性的藥物轉化成有活性藥物，而達到使藥物失去活性的目的。或 者，真菌體內會分泌一些酵素至細胞基質外，這些酵素會降解藥物 (degradation)，使藥物結構破壞而達到藥物失去活性的目的(Ghannoum and Rice, 1999)。

1.4 研究緣起及目的

在白色念珠菌之致病力研究方面，實驗室先前利用抑制刪除雜交法 (Suppression Subtractive Hybridization, SSH)來篩選和型態變化相關的基 因，找出長菌絲型(SC5314)與酵母菌型(HLC54)兩者之間表現量不同的基 因，若目標基因在酵母菌型(SC5314)中的表現量比長菌絲型(HLC54)有所 差異，則此基因可能與致病力或促進菌絲生長有關。利用 SSH 技術得到 991 種可能與致病能力或菌絲生長有關的 cDNA 選殖株（徐嘉瞳，2003）， 接著以限制脢圖析（restriction mapping）的方式作選殖株之分類並定序之， 然後將所得之定序資料於 Stanford 白色念珠菌基因資料庫（http://www- sequence.stanford.edu:8080/bncontigs19super.html）及 NCBI 資料庫中進行比 對，所得到的基因依照功能分類，共得到52 個已知基因（郭大榮，2002）。 有趣的是，在此篩選結果中，包含了 ERG3 和 ERG11 這兩個麥角固醇 生合成基因（附圖一），而麥角固醇生合成途徑是已被大量研究，其已知功 能之一是念珠菌對抗真菌藥物的感受性。例如： ERG11、ERG3(Sanglard, et

al., 2003b)、ERG24(Jia, et al., 2002)、ERG6(Jensen-Pergakes, et al., 1998)等基 因的null mutation 會影響真菌對藥物的感受性（表一）。所以，在 SSH 實驗 中尋找致病性相關因子時，得到ERG3 和 ERG11 的結果，可能的解釋是這 些基因涉及了致病性途徑和抗藥性途徑。其它研究亦指出，erg24 突變株會 些微影響抗藥性狀，卻可在小老鼠體內明顯觀察到其致病力大大減低。此 外，在人體血清誘導培養下，不會形成菌絲(Jia, et al., 2002)（表一），此結 果和上述的推論不謀而合。 因此，本篇論文之第一研究目的：探究麥角固醇生合成基因是否和致 病力及抗藥性途徑皆有關連。實驗策略以北方墨點法針對ERG3

、

ERG11 作基因表現分析，此方法可偵測基因在野生株、cph1/cph1 efg1/efg1 突變株、 CPH1/CPH1 efg1/efg1 突變株、cph1/cph1 EFG1/EFG1 突變株中的 mRNA 表

現量差異，進而能得知ERG3 及 ERG11 此二基因是否受到致病因子 CPH1 基因或EFG1 基因所調控。 再者實驗室先前之SSH 結果中，亦出現醣解酵素基因(郭大榮，2002； 林啟陽，2002)，因此曾針對醣解酵素所有生合成途徑進行研究(陳杏芳， 2004)(附圖二)，以北方墨點法作為第一步的實驗方法，發現在環境 37℃、 pH6.5 及加血清的 YPD 培養液下培養，其中五個基因 ENO1、TPI1、GPM1、

PYK1、PGK1(附圖一)其 mRNA 表現量於酵母菌型菌體(cph1/cph1 efg1/efg1)

中和長菌絲型菌體(CPH1/CPH1 EFG1/EFG1)中不同。並且建構了

eno1::ARG4/ENO1::TR-ENO1-URA3 突變株，以四環黴素調控表現系統

（TR-system）(Nakayama, et al., 2000)（附圖三）調控 ENO1 之基因表現， 也就是此修飾後的ENO1 基因表現量，在不外加四環黴素藥物時，ENO1 基

因呈過量表現，當加入四環黴素藥物後，基因表現量則被抑制。以此調控 系統，觀察其性狀變化，醣解酵素基因ENO1 確實會影響白色念珠球菌的

型態變化並會影響細胞生長(Yang, et. al., 2006)。在此背景下，加以上述的 抗藥性基因也有涉及致病力途徑的可能。因此，本論文之第二研究目的： 經由北方墨點法瞭解此五個醣解酵素基因是否和致病力及抗藥性途徑皆有 關連。實驗策略為先分析其mRNA 在野生株、非致病菌株、藥物敏感性菌 株中的表現量差異，再進一步找出目標基因分析其性狀變化，試圖勾勒出 白色念珠菌中致病力/型態變化和抗藥機制之間的關連性為何。

第

第

二

二

章

章

、

、

材

材

料

料

2.1 菌株 Escherichia coli DH5α：質體增值、保存宿主 Candida albicans : 菌株 (Strain) 基因型 (Genotype) Reference

SC5314 CPH1/CPH1 EFG1/EFG1 (Gillum, et al., 1984) HLC52 CPH1/CPH1 efg1/efg1 (Lo, et al., 1997) JKC19 cph1/cph1 EFG1/EFG1 (Liu, et al., 1994) HLC54 cph1/cph1 efg1/efg1 (Lo, et al., 1997) BWP17/tetR arg4/arg4his1/his1ura3/ura3 ENO1/ENO1-tetR-ScHAP4AD-3×HA-CaH IS1 羅 秀 容 實 驗 室 ， 2003，國衛院臨床研 究組，未發表 YLO133 Candt80::GFP-Arg/ Candt80::URA3-dp1200 (Chen, et al., 2004) YLO136 Candt80::GFP-Arg/ Candt80::URA3-dp1200 (Chen, et al., 2004) MLC89 tpi1::ARG4/TPI1 陳杏芳，楊昀良實驗 室，2004，交大碩士 論文 MLC92-3 MLC92-4 MLC92-10 tpi1::ARG4/TPI1::TR-TPI1-URA3 本實驗

2.2 質體 質體 特性 Reference p99CDT2 將白色念珠菌之 TPI1 基因片段連 接至p99CAU 載體上，篩選標記為 抗 Ampicillin，並含 TR promoter 及URA3 基因。 陳杏芳，楊昀良實 驗室，2004，交大 碩士論文 2.3 引子 製備北方墨點法探針（DNA probe）之引子 引子 序列5’~3’ 位置 GPM1-F CACGGTCAATCCGAATGG GPM1gene： +24~+41 GPM1-R TTGAGCAGCAACAGCAGC GPM1gene： +731~+714 ENO1-F AGATACGTCTACGACTCC ENO1 gene:

+28~+45 ENO1-R ACCAACTGACAAGTCAGC ENO1 gene:

+1162~+1179 TPI1AF TTTGGGCCCTGGTCAGTTGGTAAGACAAT TPI gene：

-383~-360 TPI1BR GCTCTAGAATGGCTCGTCAATTTTTTC TPI gene：

+316~+298 Orf3651-F GAAGTCACCAAGGCTGTT PGK1 gene :

PGK1-R AGTAGCAGTATCACCACC PGK1 gene :

+1114~1131 CDC19-F CCACCAAACCACGAAATG PYK1 gene :

+322~339 CDC19-R AACACAGTCAGCACCATC PYK1 gene :

+982~+999 ERG3-F CCCAGCAACTATTCCAAG ERG3 gene：

＋210~＋227 ERG3-R CAACTGGGTCATTAGACC ERG3 gene：

＋905~＋922 ERG11-F CCTTGGTTTGGTTCTGCA ERG11 gene：

＋166~＋183 ERG11-R TCTATGTCTACCACCACC ERG11 gene：

+1390~＋1407 TEF3-F TCAATTCAGACCATTAACCAG TEF3 gene：

+2610~+2630 TEF3-R TCTTCTTCTTCTTAGCAGCG TEF3 gene：

+3036~+3055

製備突變株之引子

引子 序列 5’~3’ 位置

TPI1AF TTTGGGCCCT GGTCAGTTGGTAAGACAAT TPI1 gene： -383~-360

HJL241 TCAATGGATCAGTGGCAC pRS-ARG4ΔspeI： +3339～+3357 of NCBI ACCESSION No.AF173956 HJL133 ACCAGTAGCACAGCGATT pGEM-URA： 3459～3476 TPI1SR AATGAAGCACCACCGAC TPI1 gene：

+706~+690

TPI1-CF ACCGAGAGTTTCCATTAG TPI1 gene： -486~-469

TPI1-CR GACGTTGACAGAAGTTTC TPI1 gene： +903~+886

YYL001 GTGCCACTGATCCATTGA pRS-ARG4ΔspeI： +3356~+3339 of ACCESSION No.AF173956 YYL002 TGTTGTCCTAATCCATCACC pGEM-URA3:

+4048~+4067 of ACCESSION No. AF173954

2.4 藥品試劑

z Amresco：Glycerol (Cat.No.0854-1L-PTM)、Phenol saturated solution (Cat.No.0945)

z Bio-Rad：Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)(Cat.No.161-0729)

z Difco：Bacto agar (Cat.No.143175)、Yeast nitrogen base w/o amino acid(Cat.No.145368)、YPD broth (Cat.No.135141XB)、Nutrient Broth

(Cat.No.149018)、D-Mannitol

z GiBco BRL﹕Goat serum (Cat.No.16210-072)

z J.T.Baker：Dextrose (Cat.No.1916-01)、Formamide (Cat.No.33272)、 Formaldehyde (Cat.No.15512)、3-(N-Morpholino propanesulfonic acid) (MOPS) (Cat.No.1132612)、Triton® X-100 (Cat.No.X198-07)

z Kodak：X-film (Cat.No.1651454)

z Merck：Dodecyl Sulfate Sodium Sat (SDS) (Cat.No.1.12012.0500)、Ethanol (Cat.No.1.00983.2500)、Tris-HCl (Cat.No.1.01547.1000)、Sodium Acetate (Cat.No.1.06267.0500)、Sodium Citrate (Cat.No.1.11037.1000)、Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (Cat.No.1.06346.0500)、 Di-sodium hydrogen phosphate dihydrate (Cat.No.1.06580.0500) 、 Maleic acid (Cat.No.8.17058.1000)

z NEB：Restriction Enzyme，ApaΙ、Sac Π

z Promega：Taq polymerase (Cat.No.PTM1661)、10XPCR buffer、dNTPs Mixture (Cat.No.PTM8010)

z Riedel-deHaen：Sodium hydroxide (Cat.No.30620)、Sodium chloride (Cat.No.31434)

z Roche：DIG DNA Labeling mix (Cat.No.1277065)、Hexanucleotide mix(Cat.No.1277081)、Anti-DIG-AP (Cat.No.1093274)、CSPD

(Cat.No.1655884)、Klenow enzyme (Cat.No.1008404)、Blocking reagent (Cat.No.1096176)

z SibEnzyme：1 kb DNA ladder (Cat.No.SEM11C001)

z Sigma：Glass Beads (Cat.No.G-9268)、Lithium Acetate(Cat.No.L-6883)、 L-Arginine (Cat.No.A-5131)、Uridine (Cat.No.U-0750)、L-Histidine (Cat.No.H-8125)、Polyethylene Glycol3350 (Cat.No.P-4338)、Potassium

phosphate(Cat.No.P-9666)、polyoxyethene-sorbitan monolaurate (Tween20) (Cat.No.P-1379)、Phenol (Cat.No.P-4682)

2.5 緩衝溶液及溶劑

z 50X TAE buffer

48.4 g Tris base，0.5 M EDTA (pH 8.0) 20 ml，11.42 ml acetic acid added dd H2O to 200 ml

z 5 M EDTA stock solution

186.1 g EDTA added dd H2O to 800 ml (pH 8.0)

z RNA isolation buffer

2.5 M NaCl，0.5 M Tris-Cl，0.25 M EDTA，1﹪(w/v) SDS z 10X MOPS Electrophoresis buffer

0.22 M MOPS (pH 7.0)，20 mM sodium acetate，10 mM EDTA (pH8.0) z 20X SSC buffer

3 M NaCl，300 mM sodium citrate (pH 7.0) z Prehybridization/Hybridization solution

0.5 M sodium phosphate (pH 7.2)，7﹪(w/v) SDS，1 mM EDTA (pH 7.0)

z Maleic acid buffer

0.1 M maleic acid，0.15 M NaCl (pH 7.5) z Washing buffer

0.1 M maleic acid，0.15 M NaCl，0.3﹪(v/v) Tween 20 (pH 7.5) z Blocking solution

1﹪(w/v) blocking reagent dissolved in maleic acid buffer z Detection buffer

0.1 M Tris-Cl，0.1 M NaCl (pH 9.5) z 1 M Lithium Acetate

40.8 g Lithium Acetate added dd H2O to 400 ml (pH 7.5)

z 10X TE buffer

100 mM Tris-Cl (pH 8.0)，10 mM EDTA z 50% PEG3350

75 g polyethylene glycol3350 added dd H2O to 150 ml

z 40% Dextrose

40 g Dextrose added dd H2O to 100 ml

z LATE buffer

0.1 M Lithium acetate, 10 mM Tris HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA z PLATE buffer

40% polyethylene glycol3350 in LATE buffer

z Lysis buffer

10 mM Tris-Cl (pH 8.0)，1﹪(w/v) SDS，2﹪(v/v) Triton X-100，100 mM NaCl，1 mM EDTA

2.6 培養基配製

z LB (Luria-Bertni)培養液

1% tryptone，0.5% yeast extract，1% NaCl z LB (Luria-Bertni)/Ampicillin 培養基

1% tryptone，0.5% yeast extract，1% NaCl，1.5% agar，50 μg/ml Ampicillin z YPD 培養液

2% Bacto-peptone，1% yeast extract，2% dextrose z YPD 培養基

2% Bacto-peptone，1% yeast extract，2% dextrose，2% agar z YPD/Uridine 培養基

2% Bacto-peptone，1% yeast extract，2% dextrose，2% agar，80 mg/liter uridine

z YPD/Doxcycline 培養基

2% Bacto-peptone，1% yeast extract，2% dextrose，2% agar，20μg/ml Doxcycline

z YPD/Goat Serum 培養基

2% Bacto-peptone，1% yeast extract，2% dextrose，2% agar，4% Goat Serum z SD/Uridine 培養基

0.67% Bacto-yeast nitrogen base w/o amino acid，2% dextrose，2% agar， 80 mg/liter uridine

z SD 培養基

0.67% Bacto-yeast nitrogen base w/o amino acid，2% dextrose，2% agar z Solid spider 培養基

10g of nutrient broth，10g of mannitol，2g K2HPO4，13.5g agar

2.7 儀器設備

核酸快速固定儀XL-1000UV CROSSLINKER(SPECTRONICS) 分光光度計 20GENESYS RT(SPECTRONIC INSTRUMENTS)

程式溫度控制儀 PTC-100RT (MJ RESEARCH INC.) PCR 溫度控制儀 Gene CyclerRT (BIO-RAD)

震盪器 VORTEX-GENIE2 G560 (SCIENTIFIC INDUSTRICS) 試管震盪器 IKA-VIBRAX-VXR 加熱攪拌器 S101 (FIRSTEK SCIENTIFIC) 乾燥加熱板 DB102 (FIRSTEK SCIENTIFIC) 酸鹼值檢測計 Φ360 (BECKMAN) 電子天秤 PB153-S (METTLER TOLEDO) 往復式恆溫水槽 B206-T1 (FIRSTEK SCIENTIFIC) 水平式電泳槽 MJ-105(MEDCLUB)

微量離心機 MICRO 240A (DINVILLE SCIENTIFIC INC.) 電子防潮箱 DX106 (台灣防潮科技)

恆溫式震盪培養箱 B206(FIRSTEK SCIENTIFIC) 電泳影像處理系統 GEL DOC 2000(BIO-RAD)

桌上型低溫高速離心機Centrifuge 5804R (eppendorf) 桌上型高速離心機5100(KUBOTA CORPORATION) 4℃三門冰藏櫃 KS-101-MS (MINI KINGKON) -20℃直立冷凍櫃 (WHITE-WESTINGHOUSE) -80℃超低溫冷凍櫃 925/926(FIRSTEK SCIENTIFIC) 倒立顯微鏡OLYMPUS CK40

第三章、實驗方法

3.1 北方墨點法（Northern blot analysis）

3.1.1 製備 DNA 探針（DNA probe labeling） 3.1.1.1 Random-priming DIG labeling

使用Roche 廠商產品 DIG system（Cat.No.1 175 033），以 digoxigenin- 11-dUTP（DIG）標記 DNA，取欲標記的 DNA 15 μl（約 10-30 ng）置於微 量離心管中，於 95℃加熱 10 分鐘後迅速置於冰上 5 分鐘，然後加入 2 μl 的 hexanucleotide、2 μl 的 10X dNTP labeling mixture 及 1 μl 的 Klenow enzyme（100 unit/ml），在 37℃水浴槽中反應 20 小時後，最後加入 2 μl 的 0.2 M EDTA 並於 65℃加熱 10 分鐘作終止反應，製備完成之 DNA 探針儲 存於-20℃。

3.1.1.2 PCR DIG labeling

使用Roche DIG Labeling mixture(Cat.No.1 1636 090)，藉由聚合酶鏈反 應直接將digoxigenin- 11-dUTP（DIG）標定在 DNA 上，將以下成分加入 已滅菌且置於冰上的微量離心管：

Reagent DIG-labeling Probe Unlabeled DNA control Template(Genomic DNA) 1μl

(300~1000 ng/μl)

1μl

(300~1000 ng/μl) PCR DIG Labeling Mix

(Roche) 2.5μl － dNTP stock solution (Takara) 2.5μl 5μl 10 X PCR buffer (Takara) 5μl 5μl Primer F 25μM 1μl 1μl

Primer R 25μM 1μl 1μl Sterile double dist. water 37.3μl 37.3μl Taq polymerase (Takara) 0.5μl (250 units/μl) 0.5μl (250 units/μl) Total 50μl 50μl 混合均勻後，稍微離心將所有樣品集合於 PCR 用的微量離心管底部， 進行 PCR 反應。反應結束後，取 5μl 的 PCR 產物跑電泳膠確認，而有標 定上DIG 的 DNA 在膠體內移動的會比控制組 DNA 還要慢，所以帶有 DIG 標定的DNA 在膠體上的片段大小會比預測中控制組 DNA 大小還要大，則 分裝（10μl/tube），存放於－20℃。 3.1.2 真菌培養 3.1.2.1 加血清誘導培養 將單一菌落之真菌接種至5 ml 的 YPD 培養液，於 30℃隔夜震盪培養 （200rpm），再取其中 2 ml 的菌液轉養至 50 ml 的 YPD 培養液，並再加 入適量的 YPD 培養液，調整菌液濃度吸光值 OD600至 0.1~0.2，再以體積

比1：5(山羊血清：YPD 培養液)，加入適量的山羊血清（GiBco BRL，Goat serum），37℃震盪培養（200rpm）4 小時至 O.D600nm吸光值達到約0.8~1.0， 分裝至15ml 無菌離心管，以桌上型低溫高速離心機於 4℃、3000rpm × 10 min 離心，接著去除上清液，再加入 15ml 菌液於離心管中，重複一次離心 及去上清液，再加入5 ml 的 DEPC-treated H2O 懸浮菌體，以桌上型低溫 高速離心機於4℃、3000rpm × 10 min 離心，去除上清液，之後的操作過 程皆儘可能地置於冰上進行，儲放置－80℃冰箱。

3.1.2.2 加抗真菌藥物誘導培養 將單一菌落之真菌接種至5 ml 的 YPD 培養液，於 30℃隔夜震盪培養 （200rpm），再取其中 2 ml 的菌液轉養至 50 ml 的 YPD 培養液，並再加 入適量的 YPD 培養液，調整菌液濃度，調至 OD600至 0.1~0.2，37℃震盪 培養（200rpm）3 小時，再加入 miconazole/DMSO(儲存濃度 100mg/ml， 終濃度等於10μg/ml)，37℃震盪培養（200rpm）1 小時，調至吸光值 OD600 約0.2，分裝至 15ml 無菌離心管，以桌上型低溫高速離心機於 4℃、3000rpm × 10 min 離心，去除上清液，再加入 15ml 菌液，同樣條件下離心及去上 清液，加入2 ml 的 DEPC-treated H2O 懸浮菌體，以桌上型低溫高速離心 機於4℃、3000rpm × 10 min 離心，去除上清液，之後的操作過程皆儘可 能地置於冰上進行，儲放置於－80℃冰箱。 3.1.3 萃取 RNA（RNA extraction） 從－80℃冰箱取出收集菌體的 15ml 離心管，置於冰上，進冷房，在 菌體尚未溶解之前，加入0.5 ml 的 RNA isolation buffer 懸浮菌體，加入 1/3 倍體積的玻璃珠，vortex 5 分鐘，加入 0.5 ml 的 phenol，vortex 5 分鐘， 加入0.5 ml 的 RNA isolation buffer，vortex 5 分鐘，以桌上型低溫高速離 心機於4℃、3000rpm × 10 min 離心，將上清液移至新的 1.5 ml 微量離心 管中，以桌上型低溫高速離心機於4℃、3000rpm × 10 min 離心，將上清 液移至新的1.5 ml 微量離心管，加入等體積 phenol 混合，以微量離心機 4 ℃、13,000rpm× 10 min 離心，將上清液移至新的 1.5 ml 微量離心管，加入 等量phenol 混合，以微量離心機離心機於 4℃、13,000rpm× 10 min 離心， 將上清液移至新的1.5 ml 微量離心管，加入 1/8 倍體積的 2.5 M 醋酸鈉及 2.5 倍體積的 100% -20℃冰乙醇混合均勻，置於－20℃，30 分鐘後，以微 量離心機於4℃、13,000rpm× 10 min 離心，將上清液倒掉，加入 1 ml 的 75% -20℃冰乙醇清洗管壁沉澱物，以微量離心機於 4℃、13,000rpm× 10 min 離

心，用微量吸管吸掉上清液，並將微量離心管斜放在室溫下乾燥至微乾狀 態，將RNA 溶於 35μl 的 DEPC-treated H2O 中，儲存於-80 ℃ 。 3.1.4 轉漬 RNA（Transfer） (以下依 Roche 廠商產品操作手冊進行) 首先進行1 %洋菜膠配製，秤取 1 g 的 agarose 於 72 ml 的 DEPC- treated H2O 中，微波加熱溶解，待稍微冷卻後加入 10ml 的 10X MOPS 及 18 ml 的甲醛（37% formaldehyde）混合均勻並製成膠體。而 RNA 樣品進 行電泳前之處理： 5 μl 的 37% formaldehyde、10 μl 的 formamide、3 μl 的 dye 以及 1 μl 的 10 mg/liter ethidium bromide 及適量的 10X MOPS（最終濃 度1X MOPS ）分別加入微量離心管內並充分混合均勻，最後加入約 6μg 的RNA，於 65℃加熱 10 分鐘後置於冰上 5 分鐘。將處理好之 RNA 樣品 以微量吸管置入洋菜膠之孔洞中，以 50 伏特之電壓進行 RNA 電泳 75~100 分鐘(若用來當定量的基因與所欲觀察的基因，兩者大小相近，則可以加長 電泳時間)，電泳結束後，在電泳影像處理系統照相，之後將膠體浸泡於適 量的20X SSC 中 15~20 分鐘，接著進行轉漬。利用毛細現象之原理，引導 10X SSC 溶液向上流動，進而帶動膠體中的 RNA 脫離膠體，吸附於耐龍 膜（nylon membrane）上進行轉漬。剪裁適當於膠體大小的 Whatman 3MM 濾紙、耐龍膜（先於10X SSC 溶液浸泡）及投影片(其孔洞大小合適於膠 體大小)，依濾紙、挖空的投影片、洋菜膠、耐龍膜及 Whatman 3MM 濾紙 之順序堆置，再堆上一疊衛生紙，促進毛細作用，並於最上層放置重物。 經12-16 小時後，取出耐龍膜，於核酸快速固定儀中，利用 UV 光（254nm） 照射作兩次cross-link 將 RNA 固定於耐龍膜上。另外，當耐龍膜於 UV 光 下照射時，可觀察轉漬效果是否完全，或者將膠體透由電泳影像系統照 相，觀察RNA 在膠體上的殘留量，若轉漬約達七成，則可繼續進行雜交 反應。

3.1.5 雜交反應（Hybridization） 將耐龍膜放置在含12 ml 的 prehybridization buffer 之培養皿，於 45℃ 平面震盪1~3 小時，之後將耐龍膜移至含標記探針的 12 ml 的 hybridization buffer 之培養皿中（探針濃度 50 ng/ml），於45℃平面震盪 12~18 小時後， 將耐龍膜以50 ml 的 2X Washing solution，於室溫下平面震盪 20 分鐘，再 以50 ml 的 0.5X Washing solution，於 58℃平面震盪 20 分鐘，之後再以 25 mlWashing buffer，於室溫震盪 15 分鐘兩次。 3.1.6 偵測（Detection） 耐龍膜以50 ml 的 Washing buffer 於室溫下平面震盪 20 分鐘兩次後， 以20 ml 的 Blocking buffer（Roche Blocking reagent (Cat.No.1096176)）平 面震盪30~40 分鐘後，以 15 ml 的 Antibody buffer（Roche Anti-DIG-AP (Cat.No.1093274)）平面震盪 30 分鐘，之後以 50 ml 的 Washing buffer 於 室溫下平面震盪15 分鐘兩次，接下來，將耐龍膜過 DEPC-H20 一兩次，最

後將耐龍膜放置於投影片夾層，取300μl 的 CSPD 溶液（Roche

Cat.No.1655884），均勻地加到耐龍膜上，浸濕約一分鐘，再用微量吸管吸 掉多餘的液體，37℃避光反應 20 分鐘後，在暗房內以 X 光底片進行壓片， 感光適當時間後，沖洗底片（Develop buffer 中沖洗 1 分鐘，再置於 Fix buffer 沖洗1 分鐘）。 3.1.7 定量 Internal control 之表現量應為一致，以目標基因在 SC5314(CPH1/CPH1 EFG1/EFG1)中的呈色(包含 band 的顏色深度及寬度)為基準，比較目標基因 於SC5314 和其它菌株中的呈色。若洗片後 internal control 呈色結果的不一 致，則目標基因在突變株中表現量的判讀，需加成以internal control 於突變 株和野生株中呈色的差異倍數。

3.2 檢查 TPI1 單套基因(Heterozygous knockout)破壞株

3.2.1 抽取染色體 DNA

挑取單一菌落(MLC89)，接種至 5mlYPD 培養液，30℃隔夜震盪培養 (200rpm)，約 16~20 小時，取 1~1.5ml 菌液至 1.5ml 微量離心管，以微量 離心機13,000rpm × 5min 離心，去除上清液，加入 200ul 的 Lysis buffer， 充份混合後，將整個微量離心管暴露於-80℃冰箱兩分鐘，緊接著，95℃乾 浴中一分鐘，再反覆一次將微量離心管放置到-80℃冰箱反應兩分鐘，95 ℃乾浴一分鐘 ，vortex 30 秒鐘，加入 200μl chloroform，充份混合，vortex 兩分鐘，在microfuge 中，以微量離心機 13,000rpm 最高速離心五分鐘， 取上清液至新的微量離心管，加入400μl 100％冰乙醇，－20℃五分鐘， 以微量離心機13,000rpm × 5min 離心，去除上清液，加入 500μl 70％冰 乙醇沖洗管壁沉澱物，以微量離心機13,000rpm × 3min 離心，用微量吸管 吸掉上清液並將微量離心管斜放乾燥，以35μl 的無菌二次水溶解 DNA， －20℃存放。

3.2.2 利用 PCR 檢查 TPI1 單套基因(Heterozygous knockout)破壞株 利用引子TPI1AF 和 TPI1SR，TPI1AF 黏附至目標基因 TPI1ORF-5’端(同 源置換區的上游)，TPI1SR 位於 TPI1ORF-3’端的同源置換區域上，以確認 TPI1 單套基因是否被剔除及篩選標記 ARG4 基因是否置換到正確位置。爾 後，再以洋菜電泳膠確定DNA 產物大小。PCR program 如下： Step1：95℃，5 mins Step2：95℃，1 min 50℃，1 min 72℃，2 min 30 secs Step3：Repeat step 2 for 30 cycles Step4：72℃，8 mins

Step5：4℃

3.3 於 TPI1 置入四環黴素調控系統(Nakayama, et al., 2000)

(Tetracycline-regulatable system)

3.3.1 限制酶切割反應得到含有 TR promoter 及 URA3 標記之 DNA 片段 在TPI1 promoter 區域設計引子，以白色念珠菌染色體 DNA 為模板進

行 PCR 反應，得到 A 區域之 DNA 片段，依據同樣原理在 TPI1 之 ORF 設 計引子，以PCR 的方式得到包含 start codon 之 DNA 為 B 區(B 區域)，將 此A、B 區 DNA 片段 construct 至已含有 TR promoter 及 URA3 標記之質體 p99CAU，最後架構而成的質體稱為 pCDT2(陳杏芳，2004)(附圖三)。將 pCDT2 以限制酵素 ApaⅠ反應 1.5 小時，再加 SacⅡ反應 1.5 小時，停止反 應，進行clean-up。 3.3.2 進行白色念珠菌轉形作用 將白色念珠菌（MLC89；基因型：TPI1/tpi1）（陳杏芳，2004）之單 一菌落接種至 5 ml 的 YPD 培養液（含 uridine）中，於 30℃震盪培養 （150rpm）隔夜後，取其中 2 ml 的菌液轉養至 50 ml 的 YPD 培養液（含 uridine），於 30℃震盪培養（200rpm）4～5 小時至 O.D600nm約 0.6～0.8， 分裝至50 ml 無菌離心管，以桌上型高速離心機 2500rpm × 10 min 離心， 去除上清液，加入 10 ml 的無菌二次水懸浮菌體，以桌上型高速離心機 2500rpm × 10 min 離心，去除上清液，加入 5 ml 的 1 × TE Buffer 懸浮菌 體，以桌上型高速2500rpm × 10 min 離心，去除上清液，加入 3 ml 的 LATE Buffer 懸浮菌體，以桌上型高速離心機 2500rpm × 10 min 離心，去除上清 液，加入300 μl 的 LATE buffer 懸浮菌體，於室溫下靜置 20 分鐘後，即 為念珠菌之勝任細胞。取 3.1 製備之 DNA 片段 10 µl 及 10 µl 的 10 mg/ml salmon sperm DNA（預先以 95℃加熱 10 分鐘再迅速置於冰上 10 分鐘處理

之）於微量離心管，並加入 200 µl 的勝任細胞，混合均勻於 30℃靜置 30 分鐘後，加入0.7 ml 的 PLATE Buffer 於 30℃震盪培養（180rpm）16~20 小時後，於 44℃水浴槽中進行熱休克作用（heat shock） 15 分鐘，以微量 離心機5000rpm × 2 min 離心，去除上清液，加入 1 ml 的 1 × TE Buffer 懸浮菌體，以微量離心機5000rpm × 2 min 離心，去除上清液，加入 0.1 ml 的 1 × TE Buffer 混合均勻後，取出菌液塗抹至適當的篩選培養基 （selective medium），置於 30℃培養 3~4 天。 3.3.3 抽取染色體 DNA 如 3.2.1 所述 3.3.4 PCR 確認 TR 系統之突變株

引子 TPI1CF 和 TPI1CR，位於 TPI1 同源置換區外；引子 HJL241 和 TPI1SR，確認篩選標記 ARG4 是否正確置換掉 TPI1 單套基因；引子 YYL001 和 TPI1CF，用來確認 ARG4 置換掉 TPI1 單套基因另一方向的正確性；引 子 HJL133 和 TPI1SR，確認篩選標記 URA3 插入另一個 allele 位置的正確 性；引子YYL002 和 TPI1CF，用來確認 URA3 插入位置另一方向的正確性； 引子HJL199 和 TPI1SR，確認 TR promoter 是否插入正確位置。

3.4 性狀分析

3.4.1 觀察突變株生長曲線

以 Bwp17/tetR 作對照，觀察 MLC89（tpi1/TPI1）及 tpi1::TR/ARG4 於 加doxycycline 20μg/ml(+DOX)誘導和不加藥（－DOX）情形下，以 YPD 為營養源，30℃隔夜培養後，再將菌液轉養至 50ml 新鮮的 YPD 培養液中， 調整其吸光值OD600nm至相當，放入30℃培養箱，量測 1.5、2.5、3.5、4.5、

5.5、6.5、7.5、9.5 小時其菌體吸光值 OD600nm。所進行的觀察四環黴素系統

觀察對象。 3.4.2 菌落生長情形 將 SC5314、tpi1::TR/AGR4 (所得到三顆的突變株)分別接種於 5mlYPD 培養液中，30℃隔夜培養。第二天，取少量菌液，用 YPD 將每個菌株調整 至約相同的吸光值OD600nm，以棉花棒塗沾菌液於YPD(或 SD)培養皿及 YPD 外加四環黴藥(或 SD+ DOX)培養皿上，於 30℃培養三天，觀察結果。 3.4.3 觀察單一菌落生長情形 將新鮮的菌體塗至YPD(含 4%山羊血清)培養皿上，畫出單一菌落，於 37℃培養三天。 3.4.4 芽管試驗

將 YPD 培養液加至 24-well mini-plate，每個 well 加 900μl YPD 及 100 μl 山羊血清，再依需求加入 doxcycline (20μg/ml)。最後再將菌落接種於 YPD (+10%山羊血清)培養液中，37℃培養三小時後，於倒立式顯微鏡觀察， 以400X 倍數觀察。 3.4.5 觀察增長型菌絲實驗 挑新鮮菌落接種於含 10％山羊血清之 5ml YPD 培養液中，培養於 37℃ 的培養箱中，震動搖晃180rpm，持續 18 小時。爾後，取 100μl 於 24 well plate 中，於倒立式顯微鏡下以400X 倍數觀察。(觀察 tpi1/TPI1::TR 菌株其 knock down 的情形時，需於隔夜培養前加入 doxycycline(20μg/ml)。 3.4.6 觀察菌株於含 4％血清 Bacto-agar 培養皿的生長情形 挑新鮮菌落接種於含 4％山羊血清的 Bacto-agar plate 中，於 37℃培養七 天，最後於倒立式顯微鏡下以100X 倍數觀察。(觀察 tpi1/TPI1::TR 菌株其 knock down 的情形時，需於隔夜培養前加入 doxycycline(20μg/ml)

挑新鮮菌落接種於 solid spider 培養基(Navarro-Garcia, et al., 1998)，置於 37℃七天，觀察菌落型態時，先拍攝未沖洗前菌落生長情形，以 HLC54(cph1/cph1 efg1/efg1)的沖洗狀況為基準，將培養皿置於水龍頭底下， 以水沖洗直至將培養皿上的菌落全沖洗掉離培養皿，以本研究為例，時間 為一分鐘三十秒，之後，水龍頭不關，以此固定水量和固定時間，繼續沖 洗其他培養皿，最後將沖洗過後的培養皿拍攝下來做紀錄。（觀察

tpi1/TPI1::TR 菌株其 knock down 的情形時，需於培養基的配製中加入

第

第

四

四

章

章

、

、

結

結

果

果

4.1 北方墨點法分析抗藥性基因於誘導生長菌絲環境下的表現量

為試圖了解調控azole 類藥物的抗藥性相關基因是否有可能和菌絲生長、 型態變化、致病力等有所關聯，於是利用北方墨點法，分析麥角固醇生合 成途徑上的ERG3 及 ERG11

，

其 mRNA 表現量於誘導菌絲生長環境，並作 進一步分析。

4.1.1 ERG3 之基因表現量

細胞培養條件為將隔夜菌體轉養至含有血清的YPD 培養液、於 37℃ 生長四小時。誘導菌絲生長的環境，比較其在不同突變株中的表現量差 異。圖一為ERG3 的北方墨點法結果，其判讀基準以 EFB1 作為 internal

standard（大小約等於 0.7Kb），ERG3 其 mRNA 大小至少約為 1.1Kb（ORF

有386 amino acid）。結果顯示，在低於 18S 的 band 下方有一特定 band， 略小於1.9kb，應為 ERG3 之 band，因此，ERG3 在 JKC19（cph1/cph1 EFG1/EFG1）、SC5314（CPH1/CPH1 EFG1/EFG1）中的表現量一致，而 在HLC54（cph1/cph1 efg1/efg1）及 HLC52（CPH1/CPH1 efg1/efg1）此兩 突變株中，表現量大於SC5314（CPH1/CPH1 EFG1/EFG1）。 4.1.2 ERG11 之基因表現量 細胞培養條件為將隔夜菌體轉養至含有血清的 YPD 培養液、於 37℃ 生長四小時。圖二為ERG11 的北方墨點法結果，其判讀基準以 EFB1（大

小約等於0.7Kb）作為 internal standard，ERG11 其 ORF 有 528 amino acid， mRNA 大小至少為 1.7Kb。結果顯示，ERG11 在 JKC19（cph1/cph1

EFG1/EFG1）、SC5314（CPH1/CPH1 EFG1/EFG1）中的表現量一致，而 在HLC54（cph1/cph1 efg1/efg1）及 HLC52（CPH1/CPH1 efg1/efg1）此兩 突變株中，表現量大於SC5314（CPH1/CPH1 EFG1/EFG1）。 4.2 醣解酵素基因之北方墨點法 先前實驗室(陳杏芳，2004)已篩選出的五個：ENO1、TPI1、GPM1、PYK1、 PGK1 等，其基因表現可能和致病力、型態變化有關係的醣解酵素基因， 再此利用北方墨點法，於誘導菌絲生長環境（加血清）或誘導藥物感受性 發生的環境中，進一步分析且比較此五個基因是否受抗藥性相關活性所調 控，試圖尋找出同時會涉及致病力/型態變化及抗藥性的基因。 誘導菌絲生長的培養條件為將隔夜菌體轉養至含有血清(血清體積/YPD 體積比值為 1/5)的 YPD 培養液，於 37℃生長四小時，轉速為 200 rpm， 誘導菌絲生長的環境，比較其在不同突變株中之表現量差異。另外，為了 解藥物誘發之表現，培養條件為將隔夜菌體轉養至 YPD 培養液，於 37℃ 生長三小時，且在三小時結束後，加入藥物miconazole 10μg/ml，再繼續 培養一小時，比較其在不同突變株中之表現量差異。以下為各基因之北方 墨點法結果： 4.2.1 ENO1 之基因表現量 4.2.1.1ENO1 於誘導菌絲生長環境中（加血清）之北方墨點法結果

ENO1 其 ORF mRNA 大小至少為 1.5Kb（440 amino acid）。判讀基準以

TEF3 作為 internal standard，ORF

3153nt，mRNA 位置大小約略低於 25S rRNA，結果顯示（圖四），ENO1 在 HLC52（CPH1/CPH1 efg1/efg1）、YLO133（Candt80/Candt80）、YLO136 （Candt80/Candt80）中表現量小於 SC5314（CPH1/CPH1 EFG1/EFG1），在 JKC19（cph1/cph1 EFG1/EFG1）、HLC54（cph1/cph1 efg1/efg1）中表現量

大於SC5314（CPH1/CPH1 EFG1/EFG1）。

4.2.1.2 ENO1 於誘導藥物感受性發生之北方墨點法結果

判讀基準以TEF3 作為 internal standard，其 ORF 為 3153nt，mRNA 位

置大小約略低於25S rRNA，結果顯示（圖五），ENO1 於 SC5314 （CPH1/CPH1 EFG1/EFG1）、HLC52（CPH1/CPH1 efg1/efg1）、JKC19 （cph1/cph1 EFG1/EFG1）、HLC54（cph1/cph1 efg1/efg1）中表現量幾乎一 致，但在YLO133（Candt80/Candt80）、YLO136（Candt80/Candt80）中表 現量略減，但差異性不明顯。 4.2.2 TPI1 之基因表現量 4.2.2.1 TPI1 於誘導菌絲生長環境中(加血清)之北方墨點法結果

TPI1 其 ORF 大小為 747nt（248 amino acid）。判讀基準以 TEF3 作為

internal standard，其 ORF 為 3153nt，mRNA 位置大小約略低於 25S rRNA。 結果顯示（圖六），其mRNA 表現在 JKC19（cph1/cph1 EFG1/EFG1）、HLC54 （cph1/cph1 efg1/efg1）中小於 SC5314（CPH1/CPH1 EFG1/EFG1

），

在 HLC52（CPH1/CPH1 efg1/efg1）、YLO133（Candt80/Candt80）、YLO136 （Candt80/Candt80）約等於 SC5314（CPH1/CPH1 EFG1/EFG1）。

4.2.2.2 TPI1 於誘導藥物感受性發生之北方墨點法結果

判讀基準以TEF3 作為 internal standard，其 ORF 為 3153nt，mRNA 位置

大小約略低於 25S rRNA，結果顯示（圖七），在 JKC19（cph1/cph1

EFG1/EFG1）、HLC52（CPH1/CPH1 efg1/efg1）中的表現量和在 SC5314

（CPH1/CPH1 EFG1/EFG1）相當，在 HLC54（cph1/cph1 efg1/efg1）、表

現量約小於SC5314（CPH1/CPH1 EFG1/EFG1），但差異性不到一倍。在 YLO133（Candt80/Candt80）、YLO136（Candt80/Candt80）小於 SC5314

（CPH1/CPH1 EFG1/EFG1），其差異性相差至少一倍之多。

4.2.3 GPM1 之基因表現量

4.2.3.1 GPM1 於誘導菌絲生長環境（加血清）中之北方墨點法結果

GPM1 其 ORF 為 747nt （248 amino acid）。判讀基準以TEF3 作為 internal

standard，其 ORF 為 3153nt，mRNA 位置大小約略低於 25S rRNA。結果顯 示（圖八），在JKC19（cph1/cph1 EFG1/EFG1）、HLC52（CPH1/CPH1

efg1/efg1）、HLC54（cph1/cph1 efg1/efg1）、Candt80 突變株 YLO133、YLO136

其mRNA 表現量皆明顯大於 SC5314（CPH1/CPH1 EFG1/EFG1）。 4.2.3.2 GPM1 於誘導藥物感受性發生之北方墨點法結果

判讀基準以TEF3 作為 internal standard，其 ORF 為 3153nt，mRNA 位置

大小約略低於25S rRNA。結果顯示（圖九），在 JKC19（cph1/cph1

EFG1/EFG1）、HLC52（CPH1/CPH1 efg1/efg1）、HLC54 （cph1/cph1 efg1/efg1）、Candt80 突變株（YLO136）其 mRNA 表現量皆大於 SC5314

（CPH1/CPH1 EFG1/EFG1），但在 Candt80 突變株 YLO133 的表現是等於

SC5314（CPH1/CPH1 EFG1/EFG1）。

4.2.4 PYK1 之基因表現量

4.2.4.1 PYK1 誘導菌絲生長環境中之北方墨點法結果

PYK1 其 ORF 為 1515nt （504 amino acid）。判讀基準以EFB1 作為 internal

standard，ORF 大小為 642nt，mRNA 位置大小約略低於 18S rRNA。結果顯 示（圖十），在JKC19（cph1/cph1 EFG1/EFG1）、HLC52（CPH1/CPH1

efg1/efg1）、YLO133 (Candt80/Candt80)、YLO136(Candt80/Candt80)，其

mRNA 表現量皆約等於 SC5314（CPH1/CPH1 EFG1/EFG1），但在 HLC54(cph1/cph1 efg1/efg1)中的表現量大於 SC5314(CPH1/CPH1