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先前實驗室(陳杏芳,2004)已篩選出的五個:ENO1、TPI1、GPM1、PYK1、

PGK1 等,其基因表現可能和致病力、型態變化有關係的醣解酵素基因,

再此利用北方墨點法,於誘導菌絲生長環境(加血清)或誘導藥物感受性 發生的環境中,進一步分析且比較此五個基因是否受抗藥性相關活性所調 控,試圖尋找出同時會涉及致病力/型態變化及抗藥性的基因。

誘導菌絲生長的培養條件為將隔夜菌體轉養至含有血清(血清體積/YPD 體積比值為 1/5)的 YPD 培養液,於 37℃生長四小時,轉速為 200 rpm,

誘導菌絲生長的環境,比較其在不同突變株中之表現量差異。另外,為了 解藥物誘發之表現,培養條件為將隔夜菌體轉養至 YPD 培養液,於 37℃

生長三小時,且在三小時結束後,加入藥物miconazole 10μg/ml,再繼續 培養一小時,比較其在不同突變株中之表現量差異。以下為各基因之北方 墨點法結果:

4.2.1 ENO1 之基因表現量

4.2.1.1ENO1 於誘導菌絲生長環境中(加血清)之北方墨點法結果

ENO1 其 ORF mRNA 大小至少為 1.5Kb(440 amino acid)。判讀基準以 TEF3 作為 internal standard,ORF

3153nt,mRNA 位置大小約略低於 25S rRNA,結果顯示(圖四),ENO1 在 HLC52(CPH1/CPH1 efg1/efg1)、YLO133(Candt80/Candt80)、YLO136

(Candt80/Candt80)中表現量小於 SC5314(CPH1/CPH1 EFG1/EFG1),在 JKC19(cph1/cph1 EFG1/EFG1)、HLC54(cph1/cph1 efg1/efg1)中表現量

大於SC5314(CPH1/CPH1 EFG1/EFG1)。

4.2.1.2 ENO1 於誘導藥物感受性發生之北方墨點法結果

判讀基準以TEF3 作為 internal standard,其 ORF 為 3153nt,mRNA 位 置大小約略低於25S rRNA,結果顯示(圖五),ENO1 於 SC5314

(CPH1/CPH1 EFG1/EFG1)、HLC52(CPH1/CPH1 efg1/efg1)、JKC19

(cph1/cph1 EFG1/EFG1)、HLC54(cph1/cph1 efg1/efg1)中表現量幾乎一 致,但在YLO133(Candt80/Candt80)、YLO136(Candt80/Candt80)中表 現量略減,但差異性不明顯。

4.2.2 TPI1 之基因表現量

4.2.2.1 TPI1 於誘導菌絲生長環境中(加血清)之北方墨點法結果

TPI1 其 ORF 大小為 747nt(248 amino acid)。判讀基準以 TEF3 作為 internal standard,其 ORF 為 3153nt,mRNA 位置大小約略低於 25S rRNA。

結果顯示(圖六),其mRNA 表現在 JKC19(cph1/cph1 EFG1/EFG1)、HLC54

(cph1/cph1 efg1/efg1)中小於 SC5314(CPH1/CPH1 EFG1/EFG1),在 HLC52(CPH1/CPH1 efg1/efg1)、YLO133(Candt80/Candt80)、YLO136

(Candt80/Candt80)約等於 SC5314(CPH1/CPH1 EFG1/EFG1)。

4.2.2.2 TPI1 於誘導藥物感受性發生之北方墨點法結果

判讀基準以TEF3 作為 internal standard,其 ORF 為 3153nt,mRNA 位置 大小約略低於 25S rRNA,結果顯示(圖七),在 JKC19(cph1/cph1 EFG1/EFG1)、HLC52(CPH1/CPH1 efg1/efg1)中的表現量和在 SC5314

(CPH1/CPH1 EFG1/EFG1)相當,在 HLC54(cph1/cph1 efg1/efg1)、表 現量約小於SC5314(CPH1/CPH1 EFG1/EFG1),但差異性不到一倍。在 YLO133(Candt80/Candt80)、YLO136(Candt80/Candt80)小於 SC5314

(CPH1/CPH1 EFG1/EFG1),其差異性相差至少一倍之多。

4.2.3 GPM1 之基因表現量

4.2.3.1 GPM1 於誘導菌絲生長環境(加血清)中之北方墨點法結果 GPM1 其 ORF 為 747nt (248 amino acid)。判讀基準以TEF3 作為 internal standard,其 ORF 為 3153nt,mRNA 位置大小約略低於 25S rRNA。結果顯 示(圖八),在JKC19(cph1/cph1 EFG1/EFG1)、HLC52(CPH1/CPH1 efg1/efg1)HLC54(cph1/cph1 efg1/efg1)Candt80 突變株 YLO133、YLO136mRNA 表現量皆明顯大於 SC5314(CPH1/CPH1 EFG1/EFG1)。

4.2.3.2 GPM1 於誘導藥物感受性發生之北方墨點法結果

判讀基準以TEF3 作為 internal standard,其 ORF 為 3153nt,mRNA 位置 大小約略低於25S rRNA。結果顯示(圖九),在 JKC19(cph1/cph1

EFG1/EFG1)、HLC52(CPH1/CPH1 efg1/efg1)、HLC54 (cph1/cph1 efg1/efg1)、Candt80 突變株(YLO136)其 mRNA 表現量皆大於 SC5314

(CPH1/CPH1 EFG1/EFG1),但在 Candt80 突變株 YLO133 的表現是等於 SC5314(CPH1/CPH1 EFG1/EFG1)。

4.2.4 PYK1 之基因表現量

4.2.4.1 PYK1 誘導菌絲生長環境中之北方墨點法結果

PYK1 其 ORF 為 1515nt (504 amino acid)。判讀基準以EFB1 作為 internal standard,ORF 大小為 642nt,mRNA 位置大小約略低於 18S rRNA。結果顯 示(圖十),在JKC19(cph1/cph1 EFG1/EFG1)、HLC52(CPH1/CPH1 efg1/efg1)、YLO133 (Candt80/Candt80)、YLO136(Candt80/Candt80),其 mRNA 表現量皆約等於 SC5314(CPH1/CPH1 EFG1/EFG1),但在

HLC54(cph1/cph1 efg1/efg1)中的表現量大於 SC5314(CPH1/CPH1

EFG1/EFG1)。

4.2.4.2 PYK1 誘導藥物感受性發生之北方墨點法結果

判讀基準以TEF3 作為 internal standard,其 ORF 為 3153nt,mRNA 位置 大小約略低於25S rRNA。結果顯示(圖十一),在 JKC19(cph1/cph1 EFG1/EFG1)、YLO133(Candt80/Candt80)、YLO136(Candt80/Candt80)

,其mRNA 表現量約等於 SC5314(CPH1/CPH1 EFG1/EFG1),但在 HLC52(CPH1/CPH1 efg1/efg1)、HLC52(cph1/cph1 efg1/efg1)中表現量皆小於 SC5314(CPH1/CPH1 EFG1/EFFG1)。

4.2.5 PGK1 之基因表現量

4.2.5.1 PGK1 於誘導菌絲生長環境(加血清)中之北方墨點法結果 PGK1 其 ORF 大小約為 1254nt(417 amino acid)。判讀基準以 EFB1 作為internal standard,其 ORF 大小為 642nt,mRNA 位置大小約低於 18S rRNA。結果顯示(圖十二),在 JKC19(cph1/cph1 EFG1/EFG1)、HLC52

(CPH1/CPH1 efg1/efg1)、HLC54 (cph1/cph1 efg/1efg1)、Candt80 突變株 YLO133、Candt80 突變株 YLO136 其 mRNA 表現量皆小於 SC5314

(CPH1/CPH1 EFG1/EFG1)。

4.2.5.2 PGK1 於誘導藥物感受性發生之北方墨點法結果

判讀基準以TEF3 作為 internal standard,其 ORF 為 3153nt,mRNA 位 置大小約略低於25S rRNA。結果顯示(圖十三),PGK1 基因其 mRNA 在 JKC19(cph1/cph1 EFG1/EFG1)HLC52(CPH1/CPH1 efg1/efg1)、HLC54 (cph1/cph1 efg/1efg1)突變株中的表現量和野生株 SC5314 並無太大差異。

Candt80 突變株 YLO133、Candt80 突變株 YLO136 其 mRNA 表現量略 大於於SC5314(CPH1/CPH1 EFG1/EFG1)。