3.1.1 製備 DNA 探針（DNA probe labeling）
3.1.1.1 Random-priming DIG labeling
使用Roche 廠商產品 DIG system（Cat.No.1 175 033），以 digoxigenin- 11-dUTP（DIG）標記 DNA，取欲標記的 DNA 15 μl（約 10-30 ng）置於微 量離心管中，於 95℃加熱 10 分鐘後迅速置於冰上 5 分鐘，然後加入 2 μl
使用Roche DIG Labeling mixture(Cat.No.1 1636 090)，藉由聚合酶鏈反 應直接將digoxigenin- 11-dUTP（DIG）標定在 DNA 上，將以下成分加入 已滅菌且置於冰上的微量離心管：
Reagent DIG-labeling Probe Unlabeled DNA control Template(Genomic DNA) 1μl
(300~1000 ng/μl)
1μl
(300~1000 ng/μl) PCR DIG Labeling Mix
(Roche)
2.5μl －
dNTP stock solution (Takara)
2.5μl 5μl
10 X PCR buffer (Takara) 5μl 5μl Primer F 25μM 1μl 1μl
Primer R 25μM 1μl 1μl Sterile double dist. water 37.3μl 37.3μl Taq polymerase
(Takara)
0.5μl (250 units/μl)
0.5μl (250 units/μl) Total 50μl 50μl 比1：5(山羊血清：YPD 培養液)，加入適量的山羊血清（GiBco BRL，Goat serum），37℃震盪培養（200rpm）4 小時至 O.D600nm吸光值達到約0.8~1.0，
分裝至15ml 無菌離心管，以桌上型低溫高速離心機於 4℃、3000rpm × 10
3.1.2.2 加抗真菌藥物誘導培養
將單一菌落之真菌接種至5 ml 的 YPD 培養液，於 30℃隔夜震盪培養
（200rpm），再取其中 2 ml 的菌液轉養至 50 ml 的 YPD 培養液，並再加 入適量的 YPD 培養液，調整菌液濃度，調至 OD600至 0.1~0.2，37℃震盪 培養（200rpm）3 小時，再加入 miconazole/DMSO(儲存濃度 100mg/ml，
終濃度等於10μg/ml)，37℃震盪培養（200rpm）1 小時，調至吸光值 OD600 約0.2，分裝至 15ml 無菌離心管，以桌上型低溫高速離心機於 4℃、3000rpm
× 10 min 離心，去除上清液，再加入 15ml 菌液，同樣條件下離心及去上 清液，加入2 ml 的 DEPC-treated H2O 懸浮菌體，以桌上型低溫高速離心 機於4℃、3000rpm × 10 min 離心，去除上清液，之後的操作過程皆儘可 能地置於冰上進行，儲放置於－80℃冰箱。
3.1.3 萃取 RNA（RNA extraction）
從－80℃冰箱取出收集菌體的 15ml 離心管，置於冰上，進冷房，在 菌體尚未溶解之前，加入0.5 ml 的 RNA isolation buffer 懸浮菌體，加入 1/3 倍體積的玻璃珠，vortex 5 分鐘，加入 0.5 ml 的 phenol，vortex 5 分鐘，
加入0.5 ml 的 RNA isolation buffer，vortex 5 分鐘，以桌上型低溫高速離 心機於4℃、3000rpm × 10 min 離心，將上清液移至新的 1.5 ml 微量離心 管中，以桌上型低溫高速離心機於4℃、3000rpm × 10 min 離心，將上清 液移至新的1.5 ml 微量離心管，加入等體積 phenol 混合，以微量離心機 4
℃、13,000rpm× 10 min 離心，將上清液移至新的 1.5 ml 微量離心管，加入 等量phenol 混合，以微量離心機離心機於 4℃、13,000rpm× 10 min 離心，
將上清液移至新的1.5 ml 微量離心管，加入 1/8 倍體積的 2.5 M 醋酸鈉及 2.5 倍體積的 100% -20℃冰乙醇混合均勻，置於－20℃，30 分鐘後，以微 量離心機於4℃、13,000rpm× 10 min 離心，將上清液倒掉，加入 1 ml 的 75%
-20℃冰乙醇清洗管壁沉澱物，以微量離心機於 4℃、13,000rpm× 10 min 離
心，用微量吸管吸掉上清液，並將微量離心管斜放在室溫下乾燥至微乾狀 態，將RNA 溶於 35μl 的 DEPC-treated H2O 中，儲存於-80 ℃ 。
3.1.4 轉漬 RNA（Transfer）
(以下依 Roche 廠商產品操作手冊進行)
首先進行1 %洋菜膠配製，秤取 1 g 的 agarose 於 72 ml 的 DEPC- treated H2O 中，微波加熱溶解，待稍微冷卻後加入 10ml 的 10X MOPS 及 18 ml 的甲醛（37% formaldehyde）混合均勻並製成膠體。而 RNA 樣品進 行電泳前之處理： 5 μl 的 37% formaldehyde、10 μl 的 formamide、3 μl 的 dye 以及 1 μl 的 10 mg/liter ethidium bromide 及適量的 10X MOPS（最終濃 度1X MOPS ）分別加入微量離心管內並充分混合均勻，最後加入約 6μg 的RNA，於 65℃加熱 10 分鐘後置於冰上 5 分鐘。將處理好之 RNA 樣品 以微量吸管置入洋菜膠之孔洞中，以 50 伏特之電壓進行 RNA 電泳 75~100 分鐘(若用來當定量的基因與所欲觀察的基因，兩者大小相近，則可以加長 電泳時間)，電泳結束後，在電泳影像處理系統照相，之後將膠體浸泡於適 量的20X SSC 中 15~20 分鐘，接著進行轉漬。利用毛細現象之原理，引導 10X SSC 溶液向上流動，進而帶動膠體中的 RNA 脫離膠體，吸附於耐龍 膜（nylon membrane）上進行轉漬。剪裁適當於膠體大小的 Whatman 3MM 濾紙、耐龍膜（先於10X SSC 溶液浸泡）及投影片(其孔洞大小合適於膠 體大小)，依濾紙、挖空的投影片、洋菜膠、耐龍膜及 Whatman 3MM 濾紙 之順序堆置，再堆上一疊衛生紙，促進毛細作用，並於最上層放置重物。
經12-16 小時後，取出耐龍膜，於核酸快速固定儀中，利用 UV 光（254nm）
照射作兩次cross-link 將 RNA 固定於耐龍膜上。另外，當耐龍膜於 UV 光 下照射時，可觀察轉漬效果是否完全，或者將膠體透由電泳影像系統照 相，觀察RNA 在膠體上的殘留量，若轉漬約達七成，則可繼續進行雜交 反應。
3.1.5 雜交反應（Hybridization）
將耐龍膜放置在含12 ml 的 prehybridization buffer 之培養皿，於 45℃
平面震盪1~3 小時，之後將耐龍膜移至含標記探針的 12 ml 的 hybridization buffer 之培養皿中（探針濃度 50 ng/ml），於45℃平面震盪 12~18 小時後，
將耐龍膜以50 ml 的 2X Washing solution，於室溫下平面震盪 20 分鐘，再 以50 ml 的 0.5X Washing solution，於 58℃平面震盪 20 分鐘，之後再以 25 mlWashing buffer，於室溫震盪 15 分鐘兩次。
3.1.6 偵測（Detection）
耐龍膜以50 ml 的 Washing buffer 於室溫下平面震盪 20 分鐘兩次後，
以20 ml 的 Blocking buffer（Roche Blocking reagent (Cat.No.1096176)）平 面震盪30~40 分鐘後，以 15 ml 的 Antibody buffer（Roche Anti-DIG-AP (Cat.No.1093274)）平面震盪 30 分鐘，之後以 50 ml 的 Washing buffer 於 室溫下平面震盪15 分鐘兩次，接下來，將耐龍膜過 DEPC-H20 一兩次，最 後將耐龍膜放置於投影片夾層，取300μl 的 CSPD 溶液（Roche
Cat.No.1655884），均勻地加到耐龍膜上，浸濕約一分鐘，再用微量吸管吸 掉多餘的液體，37℃避光反應 20 分鐘後，在暗房內以 X 光底片進行壓片，
感光適當時間後，沖洗底片（Develop buffer 中沖洗 1 分鐘，再置於 Fix buffer 沖洗1 分鐘）。
3.1.7 定量
Internal control 之表現量應為一致，以目標基因在 SC5314(CPH1/CPH1 EFG1/EFG1)中的呈色(包含 band 的顏色深度及寬度)為基準，比較目標基因 於SC5314 和其它菌株中的呈色。若洗片後 internal control 呈色結果的不一 致，則目標基因在突變株中表現量的判讀，需加成以internal control 於突變 株和野生株中呈色的差異倍數。
3.2 檢查 TPI1 單套基因(Heterozygous knockout)破壞株