第四章 DNA 鑑定原理與方法
4.3 DNA 鑑定方法與技術
4.3.2 PCR (polymerase chain reaction) 技術
聚合酶連鎖反應技術即 PCR 是一種體外擴增特異 DNA 片段的技術，此種 方法操作簡單，短時間內在試管中可以獲得數百萬個複製的特異 DNA 序列
75。此技術能在體外快速複製出大量特定 DNA 的方法，於 1984 年由美國生 化學家 Kary B. Mullis 提出，由於此法操作簡單、反應快速及靈敏度高的 優點，很快地被應用到與分子生物學相關的醫學、遺傳學、動物學、植物學、
考古人類學等學科的研究，大幅縮短了人類對基因奧祕探索的時間。在鑑識 科學之生物跡証鑑定中，PCR 提供了遺傳符號快速鑑定的應用，為刑事 DNA 鑑定方法在限制片段長度多型性鑑定法被發明後的另一個里程埤，PCR 在鑑 識科學應用上具有適宜微量 DNA 與裂解 DNA 的兩個優點，使得犯罪案件中，
僅有的微量與陳舊的生物跡証，重新燃起破案的希望76。
PCR 的理論基礎，源自體內細胞的 DNA 複製，當 DNA 複製時，某些酵 素會將雙股拉開形成泡狀之環，RNA 聚合酶則分別以兩股 DNA 為模板，合成 一段 RNA 引子 (primer) ，DNA 聚合酶再延伸 RNA 引子的 3′端，合成新股 DNA。在細胞外，由於尚未找到具有能適時解開雙股 DNA 能力的酵素，因此，
只能以加熱法將雙股 DNA 變性分開，讓人工合成的小段 DNA 引子結合到互補 序列區，再以 DNA 聚合酶合成新股 DNA。在大量合成複製時，只要重複上述 步驟即可，然而，最初的方法是以大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 外的 Klenow 片段 為複製酵素，此酵素不能耐高溫，故每次在 95。C 加熱變性階段後，此酵素 即失去活性，必須重新補充，在此繁瑣勞累的步驟下，複製 DNA 是一件非常 不 容 易 的 事77。 後 來 在 美 國 黃 石 公 園 間 歇 泉 及 溫 泉 水 中 發 現 的 噬 熱 菌 (Thermus aquaticus)細胞中，可分離出 Taq DNA 聚合酶。這種已完全適應
72 鄭秀 芬，前揭註 25，頁 393。
73 鄧學 仁等，前 揭註 57，頁 32-33。
74 DNA 鑑定系 統， available at<http://www.disaster.org.tw/chinese/allen.files/dna.pdf>(last visited on Jul.1, 2005).
75 鄭秀 芬，前揭註 25，頁 102。
76 李俊 億，前揭註 43，頁 69。
77 李俊 億，前揭註 43，頁 69-70。
其環境，並可在稍低於沸點的 95。C 高溫長期培育下生存，這是能將兩股 DNA 變性分開的溫度。基本上沒有任何一種其他酵素，能在這個溫度下仍保持活 性。因此，知名的科學(Science)雜誌也遴選 Taq 作為他們 1989 年的「年度 分子」(Molecule of the Year)78。在發現耐高溫的 Taq DNA 聚合酶後，DNA 反覆加熱變性的複製工作，由於不需隨時補充酵素，變得簡單，進而設計成 自動化的 PCR 法，只要自動重複複製 20 次，DNA 量就被放大百萬倍以上，
由原來不易偵測的微量 DNA，放大到可輕易偵測的大量 DNA，充分表現了複 製 DNA 的最高效率與 PCR 在分子生物學的應用潛力79。
PCR 的主要步驟有：DNA 變性 (denaturation) 、引子結合 (primer annealing) 與引子延伸 (primer extension)，茲分述如下80：
(1) DNA 變性
基因組之雙股 DNA 以高溫加熱而分開，在溶液中維持單股游離，以 利降溫後的引子結合。
(2) 引子結合
DNA 聚合酶只對含有引子的 DNA 模板進行合成作用，因此，合成所 欲 複 製 基 因 之 雙 股 模 板 3′ 端 互 補 序 列 之 一 小 段 為 引 ， 作 複 製 區 之 兩 端，當引子結合時，藉著溶液由高溫逐漸降低，引子遂在適當的溫度下，
結合上的兩條引子之 3′端相對。由於引子濃度很高，有利引子與 DNA 模板之結合，使得 DNA 模板間再相互結合的可能性降低。
(3) 引子延伸
當引子結合後，DNA 聚合酶即依 DNA 模板序列，於引子之端開始催 化互補鹼基聚合作用，延伸方向由引子 3′端開始，由 5′至 3′，直 到模板終點或進入下一個循環之加熱變性為止，複製之新股 DNA 包含引 子與延伸部分。兩條引子延伸的方向正好相對，在第一個循環之變性、
結合、延伸後，形成兩倍量之 PCR 複製產物。第二個循環時，除原 DNA 模板外，新股 DNA 亦為其模板，複製後，產生四倍量。第三個循環，產 生八倍量，依次以等比級數增加。到了第二十個循環，即產生一百萬倍 以上之複製 DNA。
PCR 只是 DNA 鑑定的一種前處理技術而已，並不是一種鑑定法，也就 是說，PCR 所提供的僅是複製 DNA 序列中某一特異序列而已，至於所複製出 來的 PCR 產物，必須再藉由其他的方法(如電泳分離、定序、點墨雜交等)，
將其多型性呈現出來81。由於能夠擴增甚至僅 1 分子的 DNA，極微量的污染 使可能導致假陽性的結果，PCR 中污染源有四種，即標本間的交叉污染、實
78 Howard Coleman 等著，何 美瑩譯 ，前 揭註 1，頁 145。
79 李俊 億，前揭註 43，頁 70。
80 李俊 億，前揭註 43，頁 70-73。
81 鄧學 仁、嚴祖 照、高 一書 合著， 前揭註 57，頁 33。
驗室中非人 DNA 污染、技術人員的 DNA 污染(如頭皮屑、脫落細胞和毛髮)、
PCR 產物的污染，亦稱殘留污染，最後一種中污染源最為嚴重82。 4.3.3 VNTR 鑑定法（variable number of tandem repeat）
基因組 DNA 中存在一類串聯重複序列，其串聯重複單位 (核心序列) 數 目在人群中存在較大差異，具有高度多型性，稱此重複為可變串聯重複序列 (VNTR) ，根據重複單位長度，分為兩類，重複單位長度為 6~70bp，稱為小 衛星，2~6bp 稱為微衛星或 STR83。重複 DNA 因比重與其他大部分 DNA 不同，
而在氯化銫梯度離心試驗時被分開，相對於主要 DNA 而言，稱為衛星 DNA。
長度多型 DNA 可由 RFLP 分析結果，確認 VNTR 基因，VNTR 多型基因有兩類，
一 是 酵 素 切 位 存 在 重 複 序 列 區 外 者 ， 此 類 多 型 將 表 現 出 重 複 序 列 之 重 複 次 數，即 DNA 長度多型，另一是酵素切位存在重複序列區中，在重複序列中不 時出現而形成複雜的長度多型。VNTR 是多型性的 minisatellite DNA，但 minisatellite DNA 卻不盡然是 VNTR。VNTR 之形成是由於插入(insertion) 或缺失(deletion)造成重複 DNA 總長度的增加或減少，可能原因為 DNA 複製 時整個重複單位的遺漏，或相連重複序列間之不對稱重組84。
Jeffreys 發展了第一小衛星探針，這些探針(33.15 與 33.6)包含核心 單位為(AGGGCTGGAGG)被重複 18 次，且其(AGAGGTG GGCAGGTGG) 被重複 29 次。在 Jeffreys 的多基因座探針，每一個體大約有 17 個易變 DNA 片斷是可 被觀察到的，依其大小排列從 3.5 到大於 20 千氮鹼基。許多較小的 DNA 片 斷也是存在，但是分析中易被忽略，因他們經電泳後不容易被決定85。根據 VNTR 基因座側翼序列，設計、合成與側翼互補的寡核苷酸作為 PCR 引物，
應用 PCR 技術擴增包含 VNTR 基因座側翼和重複單位序列，凝膠電泳分離片 段長度不同的擴增產物，根據擴增片段長度差異確定其基因型。因此，稱這 種 用 PCR 技 術 檢 測 VNTR 基 因 座 多 型 性 的 分 析 為 擴 增 片 段 長 度 多 型 性 (amplified fragment length polymorphism, AMP-FLP) 分析，它充分發揮 了兩個優勢：一是基因組 VNTR 基因座具有高度多型性優勢，二是 PCR 快速、
高效擴增的優勢。AMP-FLP 分析是 90 年代法醫 DNA 分析技術一項突破性進 展，使 DNA 分型實現了高效、快速、靈敏的目標，被稱為第二代 DNA 分型技 術86。
AMP-FLP 圖譜簡單，純合子個體只有一條帶，含有兩個長度相同的等位 基因；雜合子個體有二條帶，含有二個長度不同的等位基因。法醫學鑑定應
82 鄭秀 芬，前揭註 25，頁 122。
83 鄭秀 芬，前揭註 25，頁 18， 183。
84 李俊 億，前揭註 43，頁 25， 159-161。
85 Susan R. Barnum 著 ， 翁秉 霖等合 譯， 前揭註 19，頁 358。
86 鄭秀 芬，前揭註 25，頁 183。
用 AMP-FLP 有以下幾個特點87：
(1) 高靈敏度。PCR 技術理論上可以擴增出單個細胞基因組 DNA。
(2) 適用於陳舊、裂解、腐敗檢體。小衛星 VNTR 基因座多型片段長度多在 1kb 以下，因此模板 DNA 只要含有引物結合序列及目的的重複序列區就 可以得到擴增產物。
(3) 可以進行多個基因座複合擴增檢測。PCR 檢測的模板 DNA 用量少，可以 進行多次或多個基因座檢測，也可以將擴增條件近似的基因座安排在同 一個反應體系中進行複合擴增，增加單次檢測的數量。
(4) 具有種屬特異性。在引物設計上選擇人類特異的序列，其它物種 DNA 一般不會得到擴增。
(5) 能夠進行混合檢體的個人識別。對於單一個體，PCR 擴增產物只有一條 或二條紋。如果有二個或二個以上不同個體來源 DNA 混合在一起，擴增 圖譜中會出現三條以上的條紋。由於 PCR 反應的高靈敏度，即使二個個 體的 DNA 按 1:10 混合，也能分辨出來。
(6) 可獲得不連續的等位基因頻率。選用的 VNTR 座位的等位基因片段長度 在 1kb 以下，等位基因片段間按重複單位數成等差數列，電泳分離後等 位基因判定明確。等位基因分布呈不連續性，群體等位基因頻率可以按 顯性基因統計方法計算。
(7) 實驗週期短，設備條件和操作相對簡單。
許多小衛星 VNTR 基因座應用於法醫分析中，如 D1S80，ApoB， Pynz2 等基因座。
小衛星 VNTR DNA 雖然鑑定容易，僅需 PCR 及應用電泳分離確認產物即 可，有些甚至以瓊脂糖膠電泳即可分離，非常方便。但由於其鑑定產物分子 較大且存在等位基因間的 DNA 長度差異極大，對品質不定的刑事證物而言，
將可能影響鑑定結果88。下列因素往往會影響判讀結果：
(1) 模板 DNA 的質和量影響 PCR 擴增。模板量太少，得不到擴增產物，模板 量太多，擴增特異性會降低，非特異帶影響判讀。小衛星 VNTR DNA 的 擴增片段相對較大，靈敏度較 STR 低。有時也會出現模板量太多反而得 不到擴增，主要原因是模板 DNA 不純，含有一些 Taq DNA 聚合酶抑制劑，
如血痕中的血紅素。稀釋樣品 DNA 濃度可降低抑制物的濃度，取得良好 效果。如果在一系列濃度比例下仍得不到擴增，說明模板 DNA 液中含有 太多聚合酶抑制物，需要純化模板 DNA89。
(2) 由於 VNTR 重複單位序列較長，且重複次數差異極大，造成變異 DNA 長 度差異極大，例如 D17S5 基因之第一個等位基因型為 170bp，與第十一
87 鄭秀 芬，前揭註 25，頁 183。
88 李俊 億，前揭註 43，頁 170。
89 鄭秀 芬，前揭註 25，頁 198-199。
個等位基因 870bp，相差 700 bp，而同一樣品之 PCR 複製反應時，有利 於短 PCR 產物，因此形成短等位基因型產物較多，而長等位基因型產物 較少90。輕度裂解之模板 DNA 一般不會影響 VNTR 基因座的檢驗，但如
個等位基因 870bp，相差 700 bp，而同一樣品之 PCR 複製反應時，有利 於短 PCR 產物，因此形成短等位基因型產物較多，而長等位基因型產物 較少90。輕度裂解之模板 DNA 一般不會影響 VNTR 基因座的檢驗，但如