TMPC 與 MTMPC 對端粒酶的抑制能力

M +X +nH⁺ MX nH⁺ ΔH －（式3.3）

; _i

BH⁺ B H+ ⁺ ΔH －（式3.4）

obs i

H H n H

Δ = Δ + Δ －（式3.4）

因此必須考慮不同緩衝溶液所造成的離子化焓的大小（表3.2），⁸⁰然而在本 實驗所用的Tris-HCl 則具有 48.99 KJ/mol 的極高離子化焓，相當不利於低結合常 數的滴定實驗。⁸¹此外二次水對於150 mM NaCl 高鹽濃度的稀釋作用也將提供可能 的背景值。因此在此 ITC 實驗當中，未能具有較好的配體起始濃度以及適當的滴 定緩衝條件，而無法得到所求的配體對端粒結合能力的訊息。這也是 ITC 測量上 最大的限制，也就是緩衝溶液的選擇，樣品槽內與滴定液中也必須式完全相同的 溶液以避免額外的大量熱含干擾。

表3.2 緩衝溶液分子的離子化焓與相關熱平衡係數。⁸⁰

3.4 TMPC 與 MTMPC 對端粒酶的抑制能力 

1994 年 Kim 教授所研究腫瘤與端粒酶的相關性的同時，開發出了 Telomere Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay，用於探討活體取下的腫瘤組織所含有 的端粒酶活性，裝置如圖3.12A。¹⁸

圖3.12 A.TRAP Assay 配置。 B. 多種正常及腫瘤組織細胞全萃取 TRAP 結果。¹⁸

TRAP 基本上是利用腫瘤細胞的全萃取中的端粒酶對端粒酶受體導引子 TS(5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’) ， 在 蠟 塊 上 方 進 行 端 粒 片 段 的 延 長 （ 圖 3.12A）。其中加入Tag 聚合酶再透過聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction, PCR) 在高溫的條件下溶去蠟塊，釋放蠟塊下方CX 導引子(5’-CCCTTACCCTTACCCTT ACCCTAA-3’)，並啟動 Tag 聚合酶對端粒片段放大。透過電泳分析將具有端粒酶 活性的結果呈現如圖3.12B 中的階梯狀分析帶，訊號越強代表該細胞中具有更高的 活性。

為了討論配體對於端粒酶的抑制，Mergny 教授便將 TRAP Assay 加以修改成 適合衡量配體的TRAP-G4 Assay。⁸²在TRAP-G4 Assay 的實驗，額外加入內標準 品 TSNT(5’-AATCCGTCGAGCAGAGTTAAAAGGCCGAGAAGCGAT-3’)做為參 照；且不加入組織萃取樣本，而加入標準端粒酶來源具端粒酶表現的CHAPS 細胞 株全細胞萃取。

實驗進行，如圖3.13A 所示，首先在 PCR 專用離心管中加入 CX 導引子，做 為第二階段PCR 開始作用時用來複製第一階段所生成的端粒片段。接著融入一小 塊蠟塊將CX 導引子隔離於下層，並在蠟塊上方加入可以被端粒酶辨識而延長端粒 片段的 TS 導引子，以及無法被端粒酶延長的內標準品 TSNT 導引子與第二階段 PCR 所用的 NT 反向導引子(5’-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3’)。之後加入 CHAPS

全細胞萃取，以及Tag 聚合酶分別作用於第一階段延長 TS 後方的端粒片段與第二 階段 PCR 的進行。最重要的配體也在同時加入上層液中；如果 TS 被延長出端粒 片段，則配體就有機會可以進行辨識並穩定端粒片段成為鳥嘌呤四股結構而停滯 端粒片段的延伸。當第一階段結束只有TS 導引子延長，待第二階段開始時，由於 PCR 需要先升高溫度到 95℃，此時蠟塊將會溶解，CX 導引子將與上層液混合，

Tag 聚合酶便開始量化 ST-Telo-ACX 的片段。由於在第一階段的配體會使端粒酶 作用停滯，因此所形成的端粒片段將是不均等的，因此在PCR 結束後，利用膠體 電泳即能形成階梯(Ladder)狀的分析帶了，如圖 3.13B 所示。

圖3.13 A. TRAP-G4 流程。 B. 膠體電泳結果。¹³

在膠體電泳上的分析帶有不同的強度就代表了端粒酶被抑制的強弱，如果加 入的配體有較高的抑制能力，就會表現得跟圖3.13B 中的第三分析帶一樣，呈現出 較弱的強度；對於更強的配體可能會出現向第四分析帶一樣的結果，如同是完全 沒有加入CHAPS 全細胞粹取（零端粒酶活性）。

所合成的 TMPC 與 MTMPC 在陽明大學林敬哲老師的實驗室內，由黃豐淳 學長指導進行上述的TRAP-G4 Assay 實驗。PCR 之後所得的樣品，在 10％的聚丙

烯醯胺膠體進行電泳得到圖 3.14，圖中上列指示每一行所含有的樣品條件，兩組 對照組中分別不加入配體分子以及加入RNaseA 水解掉參與 PCR 的導引子，使結 果為空白值，因此可以定義兩組訊號強度分別為對端粒酶活性抑制力為 0 與 100 的對照。再將所得到的膠片結過透過膠片分析軟體，得到的階梯狀帶的相對強度，

而推演出合成配體 TMPC 具有 IC50為3.9 μM 以及 MTMPC 具有 IC50為6.6 μM 的 端粒酶抑制能力。相對於 BMVC 的 0.1 μM 的抑制能力有一段差距。

圖3.14 BMVC 與合成配體 TMPC 及 MTMPC 所得 TRAP-G4 結果。