第三章 結果與討論
3.1 TMPC 與 MTMPC 的光物理表現與 DNA 作用後的吸收及螢光結果
對於 TMPC 與 MTMPC 的光物理性質討論，首先將兩個化合物與對照組 BMVC 分別溶於二次去離子水中成為 10 μM 水溶液，與 2 當量的化合物對照組（分 別標記為TMPC 2x 與 MTMPC 2x）濃度為 20 μM。兩組 DNA，端粒片段 Hum24：
（TTAGGG）4以及雙股片段Linear Duplex(LD)：（GCGCAATTGCGC）溶於 Tris 緩衝溶液中酸鹼值為7.5，並具有 150 mM 的氯化鈉作為提供四股結構於 90oC 再鍊 合（Reannealing）時可以得到鈉溶液態的四股結構。所獲得配體的單純水溶液最 大吸收峰皆在430 nm 附近，但是 TMPC 與 MTMPC 吸收值相對較 BMVC 低約兩 倍左右（見圖3.1）。當分別加入LD 或 Hum24 與 BMVC 及化合物 TMPC 與 MTMPC 進行作用後。發現 BMVC 吸收峰紅移至 455 nm 及 465 nm，推測為 BMVC 與 DNA 結合後所處的環境及性教水溶液低，使基態分子的最高填滿能階（HOMO）被去 穩定而降低HOMO 與最低未填滿能階（LUMO）間的能隙減少，而有紅位移。TMPC 在LD 存在下，並無明顯的改變，然而有 Hum24 的存在下，吸收峰紅位移至 440
－450 nm 之間，推測 TMPC 與 BMVC 相仿，皆受到 DNA 的為環境極性所影響，
得到較活化的基態而紅位移。較特殊的是 MTMPC 與 BMVC 不同不受到 DNA 存 在與否的影響，皆維持最大吸收峰於430 nm 附近。
圖3.1 TMPC 與 MTMPC 水溶液態及 DNA 的 A. 吸收及 B. 螢光光譜。
未標示2x 配體與 DNA 皆為 10 mM，2x 則具有 20 mM 配體濃度。螢 光光譜皆由各吸收光譜中的最大吸收進行激發，以激發/放射光柵為 10/3 所得。
透過吸收光譜中各組訊號的吸收最大值進行激發，得到相對應的螢光放射光 譜，圖3.1B。圖中使用光柵組合為吸收/放射為 10/3。明顯發現 DNA 在此區段並 不會貢獻出螢光訊號，而且化合物的水溶液（圖3.1B 中 BMVC，TMPC 與 MTMPC 三組）也都不具有明顯的螢光性質。分別加入兩種DNA 之後，得到 BMVC 所具 有的雙股特徵螢光訊號 545 nm（BMVC+LD）與四股結構螢光訊號 575 nm
（BMVC+Hum24），符合第一章中所描述的 BMVC 所具有的感測性質（圖 1.22）。
然而 TMPC 與 MTMPC 受到胸腺嘧啶存在的快速內轉換及相對低能量的三重態影 響（圖1.40），以及於第一章中所提及胸腺嘧啶相對極低的螢光量子產率約在 10-4
（圖1.41），TMPC 與 MTMPC 在螢光的表現上都不如 BMVC 原有的明顯，在 低 光 柵 條 件 的 螢 光 光 譜 中 ， 僅 能 發 現 BMVC 的 螢 光 改 變 。 利 用 雷 射 染 料 Coumarin-6 作為參照，利用與化合物水溶液在 457 nm 的共吸收進行激發，所得 放射峰面積代入（式3.1）中，得到 TMPC 與 MTMPC 量子產率分別為 4.09x10-3 與1.98x10-3。其中Φ為量子產率，n 為溶劑折射率，A 為放射峰下面積積分值。
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圖 3.2 A. 高光柵（ex/em=10/8）條件的化合物螢光光譜與 B. 將配體於 DNA 存在時的放射峰下面積積分除去單純配體水溶液的放射峰下 面積積分所得的比例條狀圖，其中 BMVC 所得的螢光光譜取自於 圖 3.1B 中。
透過 TMPC 與 MTMPC 在雙股及四股結構 DNA 的吸收及螢光改變，推測合 成的配體可能與DNA 發生作用。因此進一步將透過 DNA 的光物理訊號變化來佐 證 TMPC 與 MTMPC 對於 Hum24 可能具有辨識結合能力。因此吾人也透過旋光 光譜來觀察化合物是否會破壞四股結構。首先，在第一章中簡介Hum22 鈉離子溶 液態的端粒片段DNA 所具有的特徵旋光度光譜（圖 1.11C），具有正值吸收於 295 nm 與 240 nm 以極負值吸收峰於 265 nm。在吾人的實驗中，圖 3.3，Hum24 旋光 光譜圖如同鍊合為四股結構Hum22 的旋光光譜圖（圖 1.11C），Hum24 的確時穩 定具有鈉離子溶液態逆平行菜籃狀的四股結構，額外所的加入配體BMVC 或 1 當 量與2 當量的合成配體 TMPC 與 MTMPC 在 Hum24 的旋光度光譜並沒有發現新 生成的吸收峰，同時也未觀測出特徵吸收峰向0 旋光度收斂。因此歸納 TMPC 與 MTMPC 如同所發表的 BMVC 分子相同，不會破壞或誘導鈉離子溶液的四股結構 發生改變。並且具有變異度不大的295 nm 四股結構特徵吸收峰，將進一步以 295 nm 的吸收峰作為參考值，觀測隨溫度變化而造成四股結構解旋。解旋溫度（Melting Point, Tm）獲得提升是配體與Hum24 作用的直接證據，將預期所合成的四股配體 具有穩定端粒片段的作用。
圖3.3 Hum24 在 150 mM 氯化鈉溶液中再鍊合所得的鈉離子四股結構旋光 度光譜，以及 Hum24 在配體分子 BMVC 或合成的 TMPC 與 MTMPC 存在下的旋光光譜圖變化。
因此透過對裝有5 μM 的 Hum24 石英樣品槽穩定提升溫度，由 10 度至 95 度 的295 nm 旋光度變化記錄於圖 3.4 中虛線，並透過對虛線的一次微分曲線並利用 以高斯鐘型分布做參考求其最低點所代表的Tm，於表3.1 列出以黑色為單純 Hum24 的解旋溫度當作空白值的相對溫度改變。利用發表的 BMVC 作為參考依據。在實 驗所測得BMVC 可以穩定端粒片段約 6.8 度， TMPC 於 1 當量時可以穩定 Tm約 3 度，2 當量時則可以進一步穩定 4.4 度。另外具有甲基修飾的 MTMPC 則在 1 當 量及2 當量時能夠各穩定 2.4 及 3 度左右，相對於 TMPC 的穩定能力較低且額外 的當量加入也沒有預期的明顯溫度上升。推測可能是甲基的取代影響到部分結合 時的區域立體障礙，造成較差的結合強度。
表3.1 由旋光度感變所測得的 Hum24 以及受配體穩定而改變的解旋溫度。
圖3.4 虛線為由旋光度為基礎的四股結構與配體分子 BMVC 以及合成的 TMPC 與 MTMPC 於 1 當量以及 2 當量存在時解旋溫度變化圖。
時線曲線則是透過一次微分求得解旋溫度變化圖的反曲點，並利 用高斯鐘型分布求得各取線最低值列於表 3.1 中。