TMPC 與 MTMPC 與 DNA 膠體電泳

由螢光光譜變化與解旋溫度的改變確認化合物 TMPC 與 MTMPC 可以做為 端 粒 配 體 ， 以 穩 定 端 粒 的 四 股 結 構 。 因 此 進 一 步 透 過 聚 丙 烯 醯 胺 膠 體 電 泳

（Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）上 DNA 受配體作用而穩定的拖曳帶。

實驗上，利用40％（29：1）的丙烯醯胺水溶液於含有 1x TBE（Tris-HCl, Boric acid, EDTA）緩衝液的二次去離子水，利用過硫酸銨（Ammonium persulfate, APS）做 為自由基引發劑，並以四甲基乙二胺作為催化劑活化APS，製成 20％的聚丙烯醯 胺膠體。將配置好的DNA 40 μM 與配體 40 μM（或更高濃度）的組合填入在膠體 上的樣品溝槽，透過250 伏特的電壓於低溫下進行 5 小時左右的電泳過程。

所得的膠片以含有氧化鋅的薄層系膠層析片為背景，直接以254 nm 的紫外光 燈照射膠片，所得到類似於一般有機化合物在膠片上的顯影（如圖 3.5A）。圖中

暗帶為DNA 鹼基所吸收 254 nm 的激發光，造成背景的氧化鋅無法受到激發表現 出綠光。膠片也透過黑色背景，利用365 nm 的紫外光進行對具螢光能力的配體激 發並以照相機（如圖3.5B）拍下配體的螢光亮帶，或 Typhoon 雷射膠片顯影掃描 系統（圖 3.5C）利用光電倍增管擷取螢光訊號並呈現黑色。進一步利用敏感度最 高的染劑 SYBR-GOLD 後染（Post-staining）對於未含有螢光配體分子的 DNA 進 行顯影。並以上述的拍照或掃描記錄膠片成色（如圖3.5D-E）。

圖3.5 配體濃度梯度的膠體電泳圖條件表格與 A.紫外光顯影。 B. 螢光顯 影相機攝相與 C. 膠片顯影掃描系統所得。D. SYBR-GOLD 後染後 的螢光顯影相機攝影與 E. 膠片顯影掃描系統所得照片。圖中黑色與 黃色星號標記 BMVC 所造成的 Hum24 拖曳帶，紅色星號則是標記由 TMPC 或 MTMPC 所造成的 Hum24 拖曳帶，黑色方框指示未受配體 作用的 Hum24 電泳訊號帶，藍色方框則指示 SYBER 染劑無法進行染 色的高濃度 TMPC 拖曳帶部分。

其中 SYBR-GOLD 染劑同屬為 Cyanine 基質的染劑（圖 3.6），對於 DNA 染 色的辨識也是透過對於鹼基的嵌合與堆疊，因此可以造成染劑所受環境極性降低 而造成明顯的螢光放射。因此對於端粒四股結構的四方結構將會是染劑最可能發 生辨識的位置，實驗初期也曾經透過EtBr（Ethidium Bromide）進行後染，但是無 法染上Hum24 才改採對單股也具有相當高顯影能力的 SYBR 染劑。其中在圖 3.5D 與E 中，不難發現第 7 與 8 行中，在已知有明顯拖曳帶的位置會出現白色的色塊，

這是受到配體所穩定的四股結構，但相對無法被染劑給競爭出空間顯影，因此呈 現反白的現象，類似的現象在 BMVC 所屬的幾行中也無法完整呈現 SYBR-GOLD 的綠色螢光，而是顯出 BMVC 所具有的黃色螢光與 SYBER-GOLD 疊合的黃綠 光。

圖3.6 EtBr 與 Cyanine Dye。

由實驗上的設計與對照，共得三張主要膠片結果。在圖 3.5 中，上方表格列 出樣品配置的條件與互相參照的說明，主要變因為不同濃度的不同配體對於端粒 片段 Hum24 所造成的穩定拖曳帶。首先圖 3.5A 中，方框圈起的第一行為單純四 股結構在電泳上的結果，而後面的2 到 12 行分別是 BMVC、TMPC 與 MTMPC 分別在表中所示的不同濃度梯度，想藉此呈現化合物對於四股結構穩定的能力。

BMVC 在 2－4 行中圖 3.5A 可以明顯區分出 Hum24 與被拖曳向下的穩定帶由黑色 及黃色星號所標記，特別在圖3.5B 與 C 當中可以顯示 BMVC 相對強的黃色螢光

亮帶，是為圖3.1B 中所呈現的 575 nm 明顯增強的螢光放射峰。在圖 3.5D 與 E 中，

為了顯示合成的配體與 BMVC 相同具有對四股及雙股結構 DNA 的選擇性，

因此做了圖3.7 的實驗規劃，將 LD 納入變因當中並同時利用 365 nm 的紫外光進 行於冰浴下12 小時的照光反應，所利用燈源為手持式的 6 W 雙波段紫外光燈。冰 浴下的溫度控制可以避免在長時間曝曬紫外光所造成的離心管及溶液升溫的現象，

以防止DNA 在光照過程受熱而解旋。

圖3.7 選擇性與反應性的的膠體電泳圖條件表格與 A.紫外光顯影。 B. 螢 光顯影相機攝相與 C. 膠片顯影掃描系統所得。D. SYBR-GOLD 後 染後的螢光顯影相機攝影與 E. 膠片顯影掃描系統所得照片。圖中黑 色與黃色星號標記 BMVC 所造成的 Hum24 拖曳帶，紅色星號則是標 記由 TMPC 或 MTMPC 所造成的 Hum24 拖曳帶，黑色方框指示未受 配體作用的 Hum24 電泳訊號帶，藍色鍵頭指示 TMPC-LD 的訊號帶。

在圖 3.7 上表中同樣列出樣品的配置及互相參照的說明，第 1 與 2 行做為空

合模式。反觀圖3.8B 中 MTMPC 被甲基所形成的立體障礙所滯，無法進一步得到 穩定的氫鍵結合，引此不與LD 發生較明顯的結合。對於圖 3.7B 與 C 中受 3 當量 的 TMPC 所穩定的 LD 可能具有較大的分子量，或是產生其他的結構使得訊號帶 受到遲滯。

圖3.8 推測 LD 雙股 DNA 與 A. TMPC 或 B. MTMPC 可能形成的辨識。

在 MTMPC 的訊號在圖 3.7A 中與圖 3.6A 中相仿，在 3 當量的配體也無法完 全的將四股結構造成穩定而產生完整的訊號帶消失。但是在圖 3.7C 中則出現 MTMPC 在相同透過 Typhoon 系統 457 nm 雷射掃描下收集 555 nm 的訊號條件下，

呈現出相對強於 TMPC 的異於圖 3.7B 中相機攝影的螢光結果，吾人則推測可能 TMPC 所形成的拖曳帶的濃度甚高，以雷射掃描系統所提供的氬離子雷射激發造 成在濃度較高的條件下出現自吸收而相對降低螢光強度，在手持的紫外光燈的照 射則又相對較弱而無法顯示出 MTMPC 較低濃度的拖曳帶造成的螢光訊號。另外 在圖3.7E 的第一行中，又可見到 Hum24 在訊號帶之前，被 SYBR-GOLD 所染出 的變性帶。