TMPC 與 MTMPC 與端粒片段的光產物

為了瞭解 TMPC 與 MTMPC 對於光照後是否能產生［2+2］環化加成反應而 生成共價鍵光產物，吾人透過酒精沉澱（Ethanol Precipitation）的方式欲將配體分 子溶入酒精中，並透過高濃度的酒精使難溶的DNA 在低溫下形成沉澱，進而分離

而得到共價鍵的 DNA-TMPC 或 DNA-MTMPC 光產物。實驗上的操作，首先將

螢光加成效果，故在電泳結束後，將得到無意義的實驗結果。因此在圖3.9A 中所 產生的拖曳帶極有可能是與DNA 作用較強的配體在低溫下形成共沉澱的結果，但 相對於殘餘的Hum24 訊號帶而言，已經相對微弱了許多。

圖3.15 光產物的膠體電泳圖條件表格與 A.紫外光顯影。 B. 螢光顯影相機 攝相與 C. 膠片顯影掃描系統所得。D. SYBR-GOLD 後染後的螢光

顯影相機攝影與E. 膠片顯影掃描系統所得照片。圖中黑色與黃色星 號標記 BMVC 所造成的 Hum24 拖曳帶，紅色星號則是標記由 TMPC 或 MTMPC 所造成的 Hum24 拖曳帶，黑色方框指示未受配體作用的 Hum24 電泳訊號帶

雖然所得到的酒精沉澱結果未能夠明顯得到形成共價鍵結合的對比，但是在

而使酚上的羥基鍵長延長，進而與鄰近的水分子進行質子的傳輸造成激發態能量 失去至基態如圖3.17B。相同的理論模型在腺嘌呤分子上可以發現受激發後的¹ππ^* 藉由CI 途徑內轉換至¹πσ^*能態，並同時造成X 軸上所定義的 N-H 鍵鍵長延伸。

將可能可透過質子的傳輸而使能量傳遞至附近的極性溶劑分子（圖3.17C）。⁸⁴

圖3.17 A. 酚－水的¹πσ^*能態電子分布圖。 B. 酚－水在不同的環境下 涉及的能量釋放路徑。 C. 腺嘌呤涉及¹πσ^*所造成NH 鍵延長示 意圖。⁸⁴

因此在胸腺嘧啶上也可能發生所述的高能量 ¹πσ^*能態進而與鄰近的水分子 進行質子的傳輸，在圖 3.18 中所示為胸腺嘧啶水合互變異構物在垂直基發時所得 到的相對能階。⁸³在吾人所關注的是具有涉及 N³的互變異構物 1-TW1 與 T1 之間 的差異，由最可能激發的ππ^*由紅線繪製，在兩個互變異構物上分別得到 5.13 eV 與5.17 eV 相當的接近，並且在更高的¹πσ^{*能態也僅具有}0.1 eV 的垂直基發能量 差異，因此不能排除 TMPC 透過尚可利用的 N³ 氫鍵達成水橋，而得到相對於 MTMPC 額外的 CI 路徑藉由質子的傳輸來釋放激發態的能量，並競爭形成［2+2］

環化加成的路徑。因此在電泳上才可發現 MTMPC 中第 8 與 10 行具有較明顯的拖 曳帶。反觀在 TMPC 可能參與有推測的質子傳輸途徑而造成光產物較不如

MTMPC 明顯。但唯獨此解釋卻與 TMPC 與 MTMPC 的螢光能力矛盾，但不失 為可能的推測。

圖3.18 理論計算所得含水的胸腺嘧啶互變異構物光激發能階與對應值，

ππ^*由紅線繪製，藍線則表示nπ^*。⁸³

欲了解 TMPC 與 MTMPC 是否能夠在紫外光激發之下，發生預期的與端粒 片段TTA 平行股上的胸腺嘧啶形成［2+2］環化加成而得到共價鍵的結合（圖 2.6B 的設計機制）。因此利用質譜直接在分子量上的改變預期可以確認光產物的存在 與否。樣品的配置與圖3.9 中的電泳樣品相同，在含 40 μM Hum24 的緩衝溶液中 加入3 當量配體 TMPC 或 MTMPC，於冰浴下再受紫外光 254 nm 或 365 nm 的 6 小時與12 小時，結束照光直接透過微量透析管進行透析離心 12000 rpm 下 45 分鐘，

並再以兩次二次水的洗滌與透析離心並收集。所得到的樣品利用雷射輔助脫附離 子化質譜儀（MALDI-TOF）進行測試，所得到的光譜如圖 3.19 與圖 3.20。在圖 3.19 中，利用受光 365 nm 照射的 Hum24 當作對照，在 TMPC 與 MTMPC 的光譜 中，以紅色虛線方框標是預期所見的分子量，其中Hum24 利用 Wiley InterScience 旗下Current Protocals 所提供的 DNA/RNA/Protein Molecular Weight Calculator，計 算得到分子量大約在7575 D 附近，而當與 TMPC（分子量為 449.2⁺）或 MTMPC

（分子量為463.21⁺）產生共價鍵的光產物，則分子量將可能坐落於 8020 或 8030 附近。由於在高分子量的條件下，MALDI-TOF 對於 500 道耳吞的解析度有限，並 且透析的結果不如預期理想，所帶有的金屬離子將會隨雷射激發而伴隨樣品脫附，

對所得訊號造成較寬胖的圖型。大致上僅能在紅色虛線方框中得到極少量的可能 訊號。

圖3.19 365 nm 紫外光激發後所得的 Hum24 以及可能與 TMPC 或 MTMPC 形成光產物的 MALDI-TOF 質譜圖。紅色虛線方 框標示可能存在光產物的質量位置。

受254 nm 激發光照射的樣品送樣測試。但是對照空白組中相同以 254 nm 照 射的 Hum24 中的方框，無法得到相對突出的數值，並且在 TMPC 的樣品中，甚 至無法測出基礎的 DNA 訊號。所以樣品另外使用電噴灑質譜儀（Electrospray Ionization ESI）進行測試，透過 Nanospray 具有較少的多電荷訊號產生，對於 500 道耳吞的質量變化將能較有效的解析。圖3.21 即是透過奈米電噴灑所得出的質譜，

相同利用虛線方框圈出預期的產物位置，但都未能發現可信訊號。

圖3.20 254 nm 紫外光激發後所得的 Hum24 以及可能與 TMPC 或 MTMPC 形成光產物的 MALDI-TOF 質譜圖。紅色虛線方 框標示可能存在光產物的質量位置。

圖3.21 254 nm 紫 外 光 激 發 後 所 得 的 Hum24 以 及 可 能 與 TMPC 或 MTMPC 形 成 光 產 物 的 ESI-TOF 質 譜 圖 。 紅 色虛線方框標示可能存在光產物的質量位置。

儘管在質譜訊號未能得到 TMPC 與 MTMPC 對 Hum24 受光激發形成的可能 光產物，吾人也必須再次的追究［2+2］環化加成以及胸腺嘧啶所可能具有的光物 理性質。在第一章末段對於胸腺嘧啶雙體與［2+2］反應機制與動力學上的討論中，

尚含有玄機。胸腺嘧啶雙體的形成，在雷射的實驗中證實所發生的速率相當的快 速僅需要1 皮秒即可生成，⁵⁴但是同時需要再次強調胸腺嘧啶形成的量子產率在文 獻中（圖 1.37）所量測的結果僅有 22-26x10^-4，⁵⁷遠低於在基因體或蛋白質體上研 究所常用的光親合反應的效率。主要原因即是胸腺嘧啶激發態的能階相當的稠密，

具有極快的CI（Conical intersection）內轉換的途徑，並未能像光親合反應中存在 雙自由基類的長生命期中間體以利進行侷限較少的反應。相對在胸腺嘧啶形成雙 體的過程中主要透過［2s+2a］的同步反應，受限於空間中相鄰的乙烯雙鍵的位向 必須具有C2的對稱性（如圖3.22A），透過旋轉將π軌域進行重疊而發生鍵結。相 同在模擬胸腺嘧啶形成雙體的反應機制中，也可以發現兩分子上的乙烯雙鍵皆是 透過歪斜已達成同步的鍵結生成，因此在空間中位向的限制是主要造成光產物量 子產率低落的原因。透過對機制以及光產物量子產率相對低的歸納，不難理解在 pmol 數量級的樣品所測得質譜，若含有 2％的光產物存在，也可能接近質譜儀的 解析極限而無法得證。

圖3.22 A. 兩分子乙烯進行［2s+2a］所涉及的過渡態位向。⁵¹ B. 胸腺 嘧啶透過［2s+2a］形成雙體 CPDs 的過渡態計算模型。⁶¹