TMPC 與 MTMPC 對 Hum24 的辨識結合能力

由於所合成配體 TMPC 與 MTMPC 對於水的溶解度較差，最高僅能配置於 100 mM 的二次水溶液當中，並且在水溶液中螢光量子產率相當的低，不利於透過 螢光滴定實驗來量測對 DNA 的結合常數。因此考慮透過微量卡計（Isothermal Titration Calometry, ITC）進行微量的低定實驗，ITC（圖 3.9）是透過樣品槽（Sample）

中的受體（Host）對於所滴加的少量的配體（Ligand）進行辨識結合所釋放或吸收 熱，造成樣品槽中的溫度為量改變，透過標準槽（Reference）對於樣品槽的熱流

（Heat Flux）的變化，在絕熱（Adiabatic）的條件下，透過微加熱線圈的加熱或放 熱平衡之間的熱流，所得到的回饋訊號（Feedback Signal）進行做圖而得到滴定曲 線，如例圖3.9B 與 C。^76-77

圖3.9 A. ITC 示意圖。⁷⁷ B. 75 μM 6nt RNA 對其互補片段 5 μM 於含 1 M NaCl 的 HEPES 緩衝溶液中所得 ITC 時間對熱的作圖與 C. 熱量對 莫爾比例作圖，得到DH= -46.1 Kcal/mol，Ka=4.3x10^-7 M^-1以及結 合當量數為 0.91。⁷⁶

對於單純辨識結合系統如配體與受體為X－M 而言，當配體每次滴加時皆會 造成熱量上的變化並同時改變樣品的體積與濃度。因此參考Wiseman Isotherm 平 衡式（式3.2），其中每次滴定造成的熱量變化為 dQ/d[X]t）而XR則為配體對受體

的莫爾比例（XR=[X]t/[M]t），其中變量ｒ中定義了ITC 的關鍵常數 c（c-value）。

[ ]

₍

₎

⎡ ⎤

∂ = Δ ⎢ + − − ⎥

⎢ ⎥

∂ ⎣ + + − ⎦

; ¹ c nK Ma

[ ]

r　= = －（式3.2）

對於ITC 所得到的結果必須將 c 值掌握在 1－1000 之間，然而如圖 3.10 所示 由c 值所決定的 ITC 滴定曲線。在分析上，過大的 c 值代表結合常數 Ka 太大或所 配置的受體濃度太高，造成滴定結果只顯示出結合時的 DH 而不具有其他熱平衡 常數的分析價值。相對的c 值過低則可能是 Ka太小或受體濃度過低，滴入配體直 接達到飽和，也不具有分析意義。因此好的滴定條件須掌握於 c 值約在 20 至 50 之間，會具有最佳的可信度。⁷⁸

圖3.10 c 值所控制的 ITC 滴定曲線圖。⁷⁸

一般非抗體抗原辨識的受體對有機化合物大約會具有 10^-6的結合常數。透過 中研原陳錦地老師實驗室的吳旻霏學姊進行 ITC 的測試，所用的 Hum24 是以 40 μM 的 280 μL 體積進行滴定，符合 c 值的最佳化區間估計約有 40。然而相對配體 受限於不佳的溶解度僅能在100 μΜ的條件中，並且滴定過程中涉及 DNA 與配體 為不同的溶液系統，DNA 溶於 pH=7.5 Tris-HCl 10 mM 且具有 150 mM NaCl 的緩

衝液中，相對配體為溶於二次水中。因此滴定結果必須扣除空白試驗以二次水滴 定DNA 的熱焓變化。圖 3.11A 紅色三角點為二次水對於 Hum24 所做的滴定曲線，

與其下方黑色方型點為TMPC 滴定 Hum24 所得的曲線。兩者皆式呈現類似的走勢，

因此在圖3.11B 中將水對 Hum24 的空白滴定扣除，則得到紊亂的點分布。在文獻 上有搜尋到類似的滴定結果，由於 ITC 所得到的滴定曲線將由軟體中所建立的模 型函數資料庫進行配對，進一步得出結合常數以及其他重要的熱平衡常數。因此 在 其 討 論 中 則 是 將 此 無 法 進 行 軟 體 分 析 的 分 布 圖 定 義 為 「 未 偵 測 出 結 合 」

（Non-detectable Binding）。⁷⁹MTMPC 也得到相同的結果。

圖3.11 A. 二次水（紅色三角點）及 TMPC（黑色方點）對 Hum24 的滴定 結果作圖。 B. 將 A 中二次水滴定空白值進行扣除所得的 TMPC 對 Hum24 滴定圖

因此進一步討論所得的圖形與空白試驗的細節，由於在ITC 的偵測訊號為整 體的放熱，因此所得結果將包含單純系統的辨識結合所釋放的熱（式3.3, ΔH），

以及錯合物生成時由緩衝溶液所提供的質子所造成的離子化焓（式3.4, ΔHi），因 此所測得將會是兩者的總合（式3.5）。⁸⁰

( );

M +X +nH⁺ MX nH⁺ ΔH －（式3.3）

; _i

BH⁺ B H+ ⁺ ΔH －（式3.4）

obs i

H H n H

Δ = Δ + Δ －（式3.4）

因此必須考慮不同緩衝溶液所造成的離子化焓的大小（表3.2），⁸⁰然而在本 實驗所用的Tris-HCl 則具有 48.99 KJ/mol 的極高離子化焓，相當不利於低結合常 數的滴定實驗。⁸¹此外二次水對於150 mM NaCl 高鹽濃度的稀釋作用也將提供可能 的背景值。因此在此 ITC 實驗當中，未能具有較好的配體起始濃度以及適當的滴 定緩衝條件，而無法得到所求的配體對端粒結合能力的訊息。這也是 ITC 測量上 最大的限制，也就是緩衝溶液的選擇，樣品槽內與滴定液中也必須式完全相同的 溶液以避免額外的大量熱含干擾。

表3.2 緩衝溶液分子的離子化焓與相關熱平衡係數。⁸⁰