藉由啟動子工程改進pichia pastoris蛋白質表達系統之產量

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 藉由啟動子工程改進 Pichia pastoris 蛋白質表達系統之產量 Improvement of recombinant protein production in Pichia pastoris by promoter engineering. 研究生：邱家鴻 Chia-Hung Chiu. 指導教授：李冠群博士 Dr. Guan-Chiun Lee. 中華民國一百零二年六月.

(2) 目錄表目錄...................................................................................................... IV 圖目錄........................................................................................................ V 附錄............................................................................................................. i 摘要............................................................................................................ ii Abstract ..................................................................................................... iii 壹、緒論.....................................................................................................1 一、微生物蛋白表達系統..................................................................1 二、嗜甲醇酵母菌 (Pichia pastoris) 蛋白表達系統 ......................1 1.表達系統元件 ............................................................................2 2.菌種品系 ....................................................................................3 3.質體轉型 ....................................................................................4 三、藉由啟動子工程改善蛋白質表達量 .........................................5 四、突變株篩選策略..........................................................................7 貳、研究目的.............................................................................................9 參、研究材料與方法 ..............................................................................10 一、微生物菌株................................................................................10 1.酵母菌 Pichia pastoris ...........................................................10 2.大腸桿菌 Escherichia coli......................................................10 二、質體構築....................................................................................10 1.質體 ..........................................................................................10 2.隨機突變的 pGAP 序列取得 ................................................ 11 3.含 pGAP 突變庫之質體構築 ................................................12 4.構築突變型啟動子於具 CRL 2 基因之質體 .......................12 三、質體的轉型................................................................................12 I.

(3) 1. E. coli 的轉型作用 .................................................................12 2. P. pastoris 的轉型作用 ..........................................................13 四、轉型株的純化............................................................................15 五、轉型菌株的鑑定........................................................................15 1.抗抗生素篩選系統 ..................................................................15 2.外源蛋白 CRL 2 表達 ...........................................................18 六、抗抗生素篩選系統建立............................................................18 1.野生型 pGAP 之強度判定與篩選系統建立 ........................18 2.突變型 pGAP 之篩選 ............................................................18 3. DNA 定序分析 (DNA sequence) .........................................19 七、外源蛋白 CRL 2 表達量之分析 .............................................19 1.菌量測定 ..................................................................................19 2.酵素表達量定量分析 ─ kinetic assays..................................19 八、套數確認與轉錄程度決定 ─ quantitative real-time PCR ......20 1.插入套數測定 ..........................................................................20 2.mRNA 表達量測定 ................................................................21 肆、結果...................................................................................................22 一、抗抗生素篩選系統建立............................................................22 1.野生型 pGAP 轉型結果 ........................................................22 2.野生型轉型株篩選 ..................................................................22 3.突變型轉型株篩選 ..................................................................23 4.插入位置判定與套數確認......................................................23 5.高濃度篩選與較強突變型啟動子取得..................................24 6.mRNA 表達量測定 ................................................................24 二、外源蛋白 CRL 2 表達量之分析 .............................................25 II.

(4) 1.外源蛋白表達量結果 ..............................................................25 2.插入位置確認結果 ..................................................................25 3.mRNA 表達量測定 ................................................................25 伍、討論...................................................................................................27 一、轉型株鑑定................................................................................28 二、抗抗生素篩選系統建立............................................................28 三、突變型 pGAP 轉型株篩選 ......................................................29 四、外源蛋白 CRL 2 表達 .............................................................30 陸、參考文獻...........................................................................................33. III.

(5) 表目錄表一：利用 PCR 方式得到 wild type pGAP 質體片段所使用的引子 ....................................................................................................37 表二：利用 Overlap extension PCR 方式得到含 mutant pGAP 質體片段所使用的引子 ........................................................................38 表三：進行 PCR 取得 mutant 啟動子 (EP1-181、EP1-194、EP2-202) 之引子 ........................................................................................39 表四：進行 colony PCR 之引子 ...........................................................40 表五：使用於 quantitative real time PCR 之引子 ................................41 表六：野生型 colony PCR 結果 ..........................................................42 表七：突變型 colony PCR 結果 ..........................................................43. IV.

(6) 圖目錄圖一：pAOX-GAP-Zeo 質體與轉型用質體片段..................................44 圖二：pGAPZαC-LIP2 質體圖 ...............................................................45 圖三：抗生素篩選系統 colony PCR 設計與各組引子產物電泳圖....46 圖四：外源蛋白質 CRL 2 系統 colony PCR 設計與各組引子產物電泳圖 ..................................................................................................47 圖五：野生型轉型株 Mut screen............................................................48 圖六：野生型轉型株 Type1 與 Type2 生長情形比較 ..........................49 圖七：野生型轉型株最低致死濃度篩選 ..............................................50 圖八：突變型轉型株篩選 ......................................................................51 圖九：突變型轉型株 Mut screen............................................................52 圖十：突變型轉型株更高濃度篩選 ......................................................53 圖十一：突變株 EP1-181、EP1-194、EP2-202 定序結果整理 ..........54 圖十二：Sh ble 基因 mRNA 表達量比較圖 .......................................55 圖十三：CRL 2 活性比較圖 ...................................................................56 圖十四：Quantitative real-time PCR for check copy number ................57 圖十五：CRL 2 mRNA 表達量比較圖 .................................................58. V.

(7) 附錄附錄 1：P. pastoris 使用在外源蛋白的啟動子 ....................................59 附錄 2：質體插入方式 ...........................................................................60. i.

(8) 摘要嗜甲醇酵母菌 (Pichia pastoris) 系統已經被廣泛使用在重組蛋白的表達。此系統具有真核生物的優點，例如轉譯後修飾、蛋白可分泌至胞外、生長快速、以及其內毒素與病毒汙染的風險較低。 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAP) 的啟動子 (PGAP) 在 P. pastoris 系統中常被使用當作重組蛋白持續性表達的啟動子。這個持續性表達的 PGAP 系統具有穩定的基因表現特性，且因表達基因時無需使用誘導物，不會造成不同細胞間的轉錄程度異質性。經基因工程改造過後所得到的不同強度啟動子，可以用來調控基因表現以得到適當的蛋白表達量。為了增進在 P. pastoris 系統中蛋白表達量，本研究透過針對 GAP 啟動子序列隨機突變，建立一個突變庫以便篩選得到強的啟動子。篩選方法是使用抗抗生素 zeocin 基因 (即 Streptoalloteichus hindustanus bleomycin gene, Sh ble gene) 當作報導基因。我們使用基因置換的轉型方式以去除多套插入的發生，避免套數多寡造成對啟動子篩選上的干擾。在高濃度的 zeocin 中，我們從 708 支轉型株中篩選到三支存活的突變株。經基因定序確認可能會影響啟動子強弱的突變位置。這些具較強轉錄活性的突變啟動子可以被應用在提高其他重組蛋白的表達。. 關鍵字：嗜甲醇酵母菌、啟動子、隨機突變、篩選. ii.

(9) Abstract The methylotrophic yeast Pichia pastoris is a well-established protein production host. It has the advantages of eukaryotes, such as eukaryotic post-translational modifications, efficient protein secretion, fast growth on economical media, and little risk of contamination with endotoxin or virus. The glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAP) promoter (PGAP) has been used for constitutive expression of heterologous proteins. The constitutive PGAP system permits steady-state gene expression and prevent the transcriptional heterogeneity in inducible expression systems. Engineered promoters with various strengths are useful genetic tools that enable the precise control of gene expression to obtain optimal yield. To improve the production of recombinant protein in P. pastoris, we created a PGAP library through random mutagenesis. Antibiotics Zeocin resistant gene (Streptoalloteichus hindustanus bleomycin gene, Sh ble gene) was used as a reporter. We performed transformation through gene replacement to rule out the multi-copy insertion events which may interfere with the promoter selection.. 3. survival mutants were selected from 708 transformants under higher Zeocin concentrations. We identified the important mutation sites in the GAP promoter regions that may cause the variant strengths. These strong mutant promoters could be used to improve the expression of other recombinant proteins.. Key word: Pichia pastoris, Promoter, Random mutagenesis, Selection. iii.

(10) 壹、緒論一、微生物蛋白表達系統在學術研究與工業用途上，微生物系統近幾十年來常被用來做大量且具有活性的重組蛋白質 (recombinant protein) 表達。微生物系統生長史短、培養容易，可以取得大量蛋白質。但不同微生物系統各有其優缺點，在原核生物的表達系統中，大腸桿菌 (Escherichia coli)因其生長快速、生產量高且成本低，故最被為廣泛使用；但因其屬原核生物，無真核生物的轉譯後修飾 (post-translational modification) 等功能，所表現的蛋白質有時會形成不正確摺疊無功能的內涵體 (inclusion body) (Daly & Hearn, 2005)，而且因其屬於革蘭陰氏菌，細胞膜上還有內毒素，若要進行活體試驗，須確認內毒素已被去除，以免影響試驗。在真核系統中，最常使用的酵母菌 Saccharomyces cerevisiae 具有轉譯後修飾、且具有穩定分裂的質體，可以用來表現重組蛋白質；但因產量不高，且表現外來基因時對細胞造成壓力而引起質體的不穩定，或生產分泌性蛋白質時，有過度醣基化現象，造成免疫抗原性的改變、活性降低等 (Van Arsdell et al., 1987)。. 二、嗜甲醇酵母菌 (Pichia pastoris) 蛋白表達系統近年來，嗜甲醇酵母菌 (Pichia pastoris) 已成為最具有潛力的重組蛋白質表達系統 (Macauley-Patrick et al., 2005)，P. pastoris 系統已廣泛使用在重組蛋白質的表達，因為其結合了原核表達系統的優點，並克服了原核表達系統的缺點 (Cregg et al., 1985)。且其具有可代謝甲醇的 Alcohol oxidase 基因 (AOX) (Cregg et al., 1989)，使其可以甲醇為碳源。P. pastoris 系統具有的優點包括：(1) 操作簡單，相關技 1.

(11) 術發展成熟；(2) 具真核系統的轉譯後修飾，如：醣基化 (glycosylation)、甲基化 (methylation) 或雙硫鍵的形成，較容易得到具正常構型與功能之蛋白質；(3) 目前未發現任何病毒會感染 P. pastoris，避免後續步驟產生污染；(4) 目前未發現其會產生內毒素，且無嗜菌體之污染；(5) 可以生產胞內與胞外蛋白，且其本身胞外蛋白分泌少，純化較容易 (Lin-Cereghino & Cregg, 2000)；(6) 可高密度培養，每公升細胞乾重可達 300-500 克 (Werten et al., 1999)；(7) 外源基因是以同源互換 (homologous recombination) 方式插入其染色體，可提高外源基因穩定性 (Li et al., 2007)。. 1.表達系統元件使用 P. pastoris 時，會將外源基因與表達元件：啟動子 (promoter)、轉錄終止點 (terminator)、篩選標記 (selection marker) 構築在一起。啟動子可以分作兩類，一類需要物質誘導 (inducible) 才會啟動轉錄，另一類為持續性 (constitutive) 表現，不需要物質誘導就會啟動轉錄。而利用誘導型啟動子在實際應用上有些限制，例如細胞之間的轉錄程度異質性，誘導物的毒性，或因誘導物而造成的基因多效性影響，故一般食品醫藥用的蛋白質不採用此啟動子。P. pastoris 中被找到並使用在外源蛋白表達的啟動子有很多種，其中強度強又最被廣泛使用的是屬於誘導型的 Alcohol oxidase 1 啟動子 (pAOX )，與屬於持續表現型的 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 啟動子 (pGAP)，而其他 P. pastoris 的啟動子轉錄強度與特性也被整理在附錄一 (Vogl & Glieder, 2012)。而在分泌性訊號序列最常使用的是自 Saccharomyces cerevisiae 中找到的 α-mating factor secretion signal sequence (Waters et al., 2.

(12) 1988)，P. pastoris 本身的 Acid phosphatase 基因 (PHO1) 的分泌性序列也曾被使用於表達重組蛋白 (Payne et al., 1995)。常用的篩選標記有營養突變株篩選 (biosynthetic markers) 與抗生素篩選 (drug resistance markers) ，可用來篩選轉型株 (Li et al., 2007)。營養株篩選是藉由破壞菌種重要的生長代謝基因，如： Histidine dehydrogenase 基因 (his4)、PR-amidoimidazole succinocarboxamide synthase 基因 (ADE1)、Argininosuccinate lyase 基因 (ARG4) 或 Orotidine phosphate decarboxylase 基因 (URA3) 等，將外源基因與正常生長代謝基因構築在一起的質體轉入後，才可以於缺乏特殊營養成份的營養基上生長。同理，抗生素篩選也是將外源基因與抗抗生素基因構築在一起，轉型成功的轉型株才可以在具抗生素上的培養基生長，而常用的抗抗生素基因有 Kanamycin-resistance 基因 (kanR) (Lin-Cereghino et al., 2008) 或 Streptoalloteichus hindustanus bleomycin 基因 (Sh ble 基因, zeocinR) (Higgins et al., 1998)。. 2.菌種品系依實驗需求不同，P. pastoris 已經發展出不同品系的菌種。有一類是 vacuole peptidase A 基因 (pep4) 發生缺陷，為 Protease deficient host strains，此類成員有 SMD1168 及 SMD1168H。其中 vacuole peptidase A 會活化下游的 carboxypeptidase Y 與 proteinase B 等蛋白水解酶活性，造成蛋白質被降解。所以此類成員在生產重組蛋白時，可以降低重組蛋白被水解酶降解，導致產量下降的情形。另一類是 Histidine dehydrogenase 基因 (his4) 發生缺陷，這一類成員有 GS115 與 SMD1168，其無法生存在沒有 Histidine 的營養基上，可以作為營養株篩選的菌種。 3.

(13) 還有一類是以代謝甲醇的 AOX1 基因發生缺陷與否為分類。P. pastoris 中可代謝甲醇的基因有 AOX1 與 AOX2，此兩基因雖然基因相似性極高，但代謝甲醇的效率差異極大，AOX1 基因表現量較強，其負責大部份的甲醇代謝 (Cregg et al., 1989)。故 AOX1 與 AOX2 基因皆完整存在的菌株，稱為 methanol utilization plus (Mut+)，如 SMD1168、GS115，其可存在於具甲醇的環境，且屬於此類的菌種才可使用 pAOX 等須以甲醇為誘導源的啟動子。然而當培養基內甲醇含量過高時，會對細胞生長造成阻礙，如果使用的啟動子不須以大量甲醇誘導，如：pFLD1，則可使用 AOX1 基因受到破壞的 methanol utilization slow (Muts) 菌種；欲使用不含甲醇為碳源的培養基時，可以選擇 AOX1 與 AOX2 皆受到破壞的 methanol utilization minus (Mut-) 菌種 (Inan & Meagher, 2001)。這些常見的菌株如下表所示 (Daly & Hearn, 2005)： Strain. genotype. phenotype. His4, pep4. Mut+, His-, pep4-. GS115. his4. Mut+, His-. KM71. his4, aox1:ARG4;arg4. Muts, His-. X-33. Wild type. —. —. —. SMD1165. His4, prb1. Mut+, His-, prb1-. SMD1163. his4, prb1, pep4. Mut+, His-, pep4, prb1-. MC100-3. arg4 his4. Mut-, His-. SMD1168. MP-36. aox1Δ::SARG4aox2Δ:: Phis4. 3.質體轉型質體插入 P. pastoris 基因體方式有下列兩種，第一種是如同 S. 4.

(14) cerevisiae，將質體藉由限制酵素切斷成線狀，轉入細胞內時其會與 P. pastoris 染色體發生一次同源重組作用 (single homologous recombination)，使質體 DNA 穩定插入染色體中，而此方法有可能在同一位置進行多次插入，導致多套外源基因的插入，但多次插入發生機率只佔 1~10 % (Brierley, 1998)。另一種方式是藉由 5＇端 pAOX1 部分與 3＇端 AOX1 基因片段部份進行基因置換 (replacement 或稱 double homologous recombination)，把 P. pastoris 染色體上的 AOX1 基因整段置換 (replacement) 下來，而此方式前人研究發現其皆為單套插入 (Vassileva et al., 2001)。兩種插入方式如附錄二所示。. 三、藉由啟動子工程改善蛋白質表達量雖然如此廣泛被使用，但也可以發現重組蛋白質在 P. pastoris 系統的表達依蛋白質的不同而有高低差異，結果非常不一致 (Macauley-Patrick et al., 2005)。改善真菌系統重組蛋白質表達量的方法很多，例如可以由轉錄層面、後轉錄層面、轉譯層面、或後轉譯層面著手 (Mehrabi et al., 2011)。不管在原核系統或真核系統，轉錄的起始對於重組蛋白質表達是一個重要的步驟，所以高強度且可受調控的啟動子將會是一個很好的工具 (Vogl & Glieder, 2012)。在轉錄過程中，轉錄因子 (transcription factor, TF) 與核醣核酸聚合酶 (RNA polymerase) 會結合在啟動子上，轉錄因子是屬於 trans-acting factors，其可以當活化子 (activators) 或抑制子 (repressors) ，藉此可以去調控轉錄。不管在真核或原核系統都有藉由改善啟動子去調控蛋白質表達，而啟動子改善工程常用的策略有兩種，其中一種是藉由啟動子序列分析，針對預測位置進行工 5.

(15) 程改善；另一種是直接在啟動子序列上做隨機突變，建立突變庫。其中在酵母菌系統中前人研究曾用 S. cerevisiae 常使用的 DAN1 啟動子做為材料進行隨機突變 (Nevoigt et al., 2007)，DAN1 啟動子需在完全無氧的環境下才會被啟動，此特性優點是可以防止其他雜菌叢生，造成污染，但是相對的也是其缺點，因其極度厭氧之特性，若要將其使用在工業大量表達上，所要耗費金錢與時間較多，難度也較大，不符合經濟成本。所以該篇研究藉由隨機突變欲得到在較不厭氧條件下能被誘導的啟動子，這樣在工業使用上較方便也可以節省成本。pAOX 是一個強而需要被誘導的啟動子，前人研究則是使用序列分析軟體，分析 pAOX 內轉錄因子結合位，並在這些位置上分別進行 deletion 或 duplication 建立突變資料庫，在這資料庫中其活性由 6 %到 160 %皆有 (Hartner et al., 2008)。這種需要誘導的啟動子可以協助調控基因表達，但是也會受限於轉錄的異質性或誘導物毒性，所以持續性表達的啟動子或許可以提供穩定的基因表現。 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 是糖解作用第六步的酵素，它的啟動子在以葡萄糖為碳源時，強度與 pAOX 相當 (Waterham et al., 1997)，所以也很常被使用在重組蛋白質的表達。而在不同碳源中，以 pGAP 為啟動子的轉錄表現量，葡萄糖是最佳的，甘油次之，甲醇最少 (Waterham et al., 1997)。Qin 等人使用隨機突變的方式，在 pGAP 的位置以 error prone PCR 方式，將突變率設定在 1 ─ 4 %，建立一個突變庫，其以螢光蛋白為報導基因，由螢光蛋白表現強弱篩選不同強度的啟動子，並藉由 quantitative real-time PCR 方式確認其皆為單套插入，故表達結果不會因套數而有所影響 (Qin et al., 2011)。篩選近 30000 突變株後，選取其中 33 個突變株，這些突變型啟動子所產生的螢光強度相對於野生型 pGAP 約在 6.

(16) 0.006 倍至 19.6 倍這個範圍。更進一步由突變庫中選取七個不同強度的突變啟動子，來驅動另兩種蛋白 beta-galactosidase (lac z) 與 methionine adenosyltransferase (MAT) 的表達，並進行蛋白活性分析，不管是 lac z 或者是 MAT 的轉錄程度與比活性，在這七種不同強度的 pGAP 調控下，結果都與當初篩選強弱排序一致。然而，該實驗在進行螢光篩選時，為顧及培養液背景值過高可能影響流式細胞儀之判別，故培養液被限制為使用 buffered minimal dextrose (BMD) medium (with 1 % glucose)。由 Qin 結果可知，藉由螢光蛋白篩選得到的 pGAP 用於表達其他蛋白時，是可以得到類似的結果，但由於培養基成份不只會影響細胞生長情形，也會影響 pGAP 的調控，而 Qin 使用的系統若要廣泛使用在其它啟動子之篩選，因培養基成份影響可能會受到限制。所以欲得到一種可廣泛適用於各種啟動子的篩選系統，希望其限制越少。. 四、突變株篩選策略變異株篩選的策略可分為兩種，一種是 screening，此種方法表現量不管是高與低皆會被留下進行分析，故可保留不同表現量的變異株，而此方法又可細分為 facilitated screening 與 random screening，前者是在大量篩選時，藉由其明顯表現型不同去進行分類；而後者則是其表現型在未有不同情況下隨機挑選每一株進行篩選。相對於 screening 的方式，另一種篩選策略是 selection，這種方法是只留下表現量較優的突變株，而較差的突變株會被淘汰，之後將所得的突變株進行分析，而這種方法篩選數量通常較 screening 少，故其所耗費時間與實驗材料也較少，故其效率較高，而此種方法常用的篩選基因是一些抗抗生素基因 (Taylor et al., 2001)。 7.

(17) Screening 過程中常用各類螢光蛋白 (EGFP)、beta-galactosidase (lacZ) protein、human serum albumin (HAS) protein 來做為報導基因，藉此推算其啟動子強度 (Vogl & Glieder, 2012)，如上述兩篇針對 pAOX 與 pGAP 皆是使用螢光蛋白。而本研究將採用 selection 的策略，亦即使用抗抗生素基因來做為報導基因，其不但可以確認轉型株有轉型成功，另一方面也可以從轉型株抗抗生素的能力來評估啟動子強度，當轉型株可抗愈高濃度抗生素時，則可推測其啟動子強度愈強，反之亦然，並期待此方式簡化篩選過程，並加快篩選。本實驗室郭亭君學姐，曾構築使用抗 G418 基因 (即 Kanamycin-resistance 基因) 為報導基因的質體，藉由基因置換 (replacement 或稱 double homologous recombination) 方式將其轉入 P. pastoris，發現即使用了極高濃度的抗生素 G418 也無法將帶有野生型 pGAP 的菌株殺死，推測其原因是因為抗 G418 基因產物為一種酵素，一個酵素分子會不斷分解許多 G418 藥物分子，因此無法真實反映出抗藥性與啟動子強弱之關聯。故本實驗選擇以 Streptoalloteichus hindustanus bleomycin 基因 (Sh ble 基因) 為篩選標記，Sh ble 基因產物會以一對一等當量比方式結合抗生素 zeocin，使 zeocin 失去效用，其一對一的特性可真實反映啟動子強弱。. 8.

(18) 貳、研究目的本研究目的是在篩選具有高活性的突變型 pGAP，來增加重組蛋白在 P. pastoris 內表達量。建立一套抗抗生素篩選系統，在此系統中啟動子驅動的報導基因是 Sh ble 基因，Sh ble 基因產物會以一對一結合方式使抗生素 zeocin 失去效用，可以藉由改變 zeocin 濃度去推測其啟動子強弱。以隨機突變方式，針對 pGAP 做出突變庫，突變質體轉入菌株後，以抗生素篩選，並不斷增加 zeocin 濃度，在愈高濃度依舊可生長的突變株，其啟動子效率亦較佳，以此特性篩選出強的啟動子後，將篩選到的啟動子接到其它蛋白上，本研究將以 Cadida rugosa lipase 2 (CRL 2)，希望可提高其蛋白表達。. 9.

(19) 參、研究材料與方法一、微生物菌株 1.酵母菌 Pichia pastoris 本實驗以 protease-deficient host strain：SMD1168 作為表達蛋白之寄主細胞，因其屬於 protease-deficient，故不會產生 protease 分解重組蛋白，導致活性測定上之干擾。. 2.大腸桿菌 Escherichia coli 本實驗以 Escherichia coli DH5α [SupE44 Δ U169 (Φ80lacZΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1] 品系作為保存質體之寄主，其 recA 基因發生突變，recA 基因的功能主要是進行 DNA 同源重組 (homologous recombination)，故突變後，可確保送入的質體不會與 E. coli 本身的染色體 DNA 發生重組，使質體的保存較佳。. 二、質體構築 1.質體實驗中所用之篩選標記是由 pGAPZα-C 質體 (購自 Invitrogen 公司) 中由表一第一組引子以聚合酶連鎖反應 (PCR) 方式得到 Sh ble 基因，利用限制酶 SpeI 與 KpnI (BioLab，台灣) 處理，稱作插入片段 (Insert)。並從實驗室郭亭君學姊所建構 pAOX-GAP-kan 質體中以限制酶 SpeI 與 KpnI (BioLab，台灣)去除抗 G418 基因，將其作為載體 (Vector)。將 vector 與 insert 以莫耳比 1：3 標準，取適當量混合均勻，以連接酶 (ligase) 於 16 ℃作用 16 小時後，轉型到 E.coli DH5α 所得之質體命名為 pAOX-GAP-Zeo，如圖一 (A) 所 10.

(20) 示。. 2.隨機突變的 pGAP 序列取得實驗中隨機突變是藉由 error prone PCR 方式，選用 JBS dNTP-Mutagenesis kit (Jena Bioscience)，藉由添加之 dNTP analogs 與聚合酶連鎖反應 (PCR) 循環次數的不同得到不同的突變率。本實驗欲得到一高突變率及一低突變率之 pGAP 片段，高突變率組片段稱為 EP-1，低突變率組片段為 EP-2。以 pAOX-GAP-Zeo 為模板、表二第二組引子進行 PCR 反應。而 dNTP analogs 添加方式如下 ( 於總體積為 10ul 時 )：組別. 突變率. dNTP. dPTP. EP-1. 2%. 0.5 μl. -. 0.5 μl. 30. EP-2. 20 %. 0.5 μl. 0.5 μl. 0.5 μl. 30. 8-oxo-dGTP PCR cycle. PCR 條件如下：第一部份階段. 目的. 溫度. 時間(min). 循環次數. 1. Denature. 92 ℃. 5 min. 1. Denature. 92 ℃. 1 min. Annealing. 55 ℃. 1.5 min. Extend. 72 ℃. 5 min. Extend. 72 ℃. 10 min. Save. 4℃. ∞. 2. 3. 30. 1. 第二部份為去除包含易造成突變的 dNTP analog 之放大產物，取第一部份中所得的 PCR 產物 1 μl，以其為模板，進行第二次的 PCR，此次不加入 dNTP analogs，其它條件如第一部份所示，總體積為 50 μl。 11.

(21) 進行隨機突變之 pGAP 片段大小為 483 bp，而 PCR 產物大小為 526 bp，其為突變片段加上引子部份(未進行突變)。. 3.含 pGAP 突變庫之質體構築將欲進行轉型之 DNA 片段，如圖一 (B) 所示，將其分成三段，其中片段二 (EP-1 或 EP-2) 為突變的 pGAP 序列 (526 bp)。分別以表二第一組引子得到片段一 (1962 bp)，以第三組引子得到片段三 (874 bp)，之後藉由疊合聚合酶連鎖反應 (overlapping extension PCR, OE PCR) 將大小較相近的片段二與三疊合，得到片段四 (1379 bp)。再以相同方法將片段一與片段四疊合，並以表二第四組引子進行 OE PCR，所得到產物為 3132 bp。此種質體製備方式參考自 2010 年 Fernández 發表之方法 (Fernández et al., 2010)，並進行修改。. 4.構築突變型啟動子於具 CRL 2 基因之質體將挑選到之編號 EP1-181、EP1-194、EP2-202，設計引子 (如表三所列) 藉由 PCR 方式得到突變的 pGAP 序列後，使用設計於引子上之限制酶酵素 BstB1 與 Nsi1 (Roche, 台灣) 進行處理。同時使用該二限制酶酵素處理本實驗室郭亭君學姐構築之具 CRL 2 基因質體 pGAPZαC-LIP2 (如圖二所示)，去除原本之野生型 pGAP，並將上述得到之突變之 pGAP 接於已去除野生型 pGAP 的質體 pGAPZαC-LIP2 上。. 三、質體的轉型 1. E. coli 的轉型作用將構築好的質體 DNA 與 E. coli DH5α 勝任細胞以 1：10 比例 12.

(22) 混合均勻，冰浴 30 分鐘後，以 42 ℃ 熱處理 45 秒，隨即冰浴 30 分鐘，之後加入 1 ml LB (1 % NaCl、0.5 % yeast extract、1 % tryptone) 培養液，震盪培養一小時後，以 12000 xg 離心 5 分鐘，留下約 150 μl 的上清液，以此上清液懸浮菌體，將其塗於終濃度為 100 μg/ml 的 Amp LB 洋菜培養基中，置於 37 ℃ 培養箱隔夜培養 (16-18 小時)。. 2. P. pastoris 的轉型作用 2.1 酵母菌 P. pastoris SMD1168 勝任細胞的製備由 -80 ℃ 菌種保存中挑取一些碎冰，劃線於不含抗生素的 YPD (2 % D-glucose、1 % yeast extract、2 % peptone) 洋菜培養基中，放置 30 ℃培養箱培養兩到三天，至其長出肉眼可見的菌落，由中挑選單一菌落，接種至 5 ml YPD 液態培養液中，於 30 ℃、225 rpm 條件下隔夜培養 (16 小時)，此為 start culture。自 start culture 中取適量菌液到 50 ml YPD 培養液中，使其 OD600 為 0.2，在 30 ℃、225 rpm 條件下培養到 OD600 約略為 1.2 ─1.5 (約兩小時)，之後以 3500 xg 離心 10 分鐘以去除培養液，加入 50 ml TE/DTT/LiCl 緩衝液回溶細胞，再以相同離心條件去除緩衝液，之後加入 1 ml TE/DTT/LiCl 緩衝液並移到微量離心管，以 30 ℃、不震盪條件下培養一小時，此步驟為鬆散細胞壁。之後在以相同離心條件移除緩衝液，加入 1 ml ice-cold 滅菌水清洗細胞，再以離心方式去除滅菌水，再次加入 1 ml 1 M sorbitol 清洗細胞，以相同條件離心去除 sorbitol，最後以 400 μl 1 M sorbitol 回溶細胞，放置於冰上備用。 2.2 轉型 DNA 製備 2.2.1 抗生素 zeocin 篩選系統使用之野生型與突變型 DNA 13.

(23) 野生型部份，藉由表一第二組引子以 pAOX-GAP-Zeo 質體為模板進行 PCR 反應，此種質體製備方式參考自 2010 年 Fernández 發表之方法 (Fernández et al., 2010)，準備進行轉型之 DNA 片段以 PCR 方式置備，取代傳統以限制酶處理質體方式。此方法可以除了可以快速取得大量轉型片段外，因引子設計時 5’ 端為添加磷酸根，故可避免其自黏，若以傳統方式，為避免轉型片段自黏需再進行去磷酸根步驟。取得 PCR 產物後，利用酒精沉澱法得到高濃度的 linear DNA，存於 -20 ℃冰箱備用。而突變型部份，直接將以 OE PCR 方式構築的 linear DNA 以酒精沉澱法獲得高濃度 DNA，存於 -20 ℃ 冰箱備用。 2.2.2 外源蛋白 CRL 2 表達使用之 DNA 使用 Viogene 廠牌之 Mini plusTM Plasmid DNA Extraction System (Cat. GF2002) 抽取含突變型 pGAP (EP1-181、EP1-194、 EP2-202) 與野生型 pGAP 的質體 pGAPZαC-LIP2 共四組。之後使用限制酶 PvuII 進行處理此四組質體，以取得 linear DNA，利用酒精沉澱法濃縮後，存於 -20 ℃ 冰箱備用。 2.3 酒精沉殿法在 PCR 所得 DNA 樣本中加入樣本體積十分之一的 3 M 醋酸鈉與樣本體積 2.5 倍的 100 %酒精混勻，置於 -20 ℃冰箱至隔夜。以 12000 xg 離心 10 分鐘，去除上清液後，加入 1 ml 70 %酒精清洗、沉澱樣本，以相同方式去除上清液後，利用抽氣機去除酒精，並回溶於適量的滅菌水中，放置於 -20 ℃ 冰箱保存。 2.4 電穿孔轉型取 80 μl SMD1168 勝任細胞與 10 μl linear DNA ( 約 5 ─ 10 μg ) 混合均勻，移至以預冷的 2 mm 電擊管中，置於冰上冷卻，而 14.

(24) 後以 1.5 Kv、25 ohm、200 uF、5 mecs 之電極參數，將 DNA 片段電轉型至酵母菌細胞內，隨即加入 1 ml 1 M sorbitol 並移置 15 ml 離心管中，再加入 1 ml YPD 培養液，放置在 30 ℃、100 rpm 的培養箱中，培養 4 小時後，離心去除大部份上清液，留下約 150 μl 上清液回溶細胞，並將其塗於含終濃度為 100 μg/ml zeocin 的 YPD 洋菜培養基，放置於 30 ℃培養箱培養三天。. 四、轉型株的純化為得到單一菌株，以滅菌牙籤挑取轉型後培養三天的洋菜基上單一菌落上的少許菌，劃線於終濃度為 100 μg/ml zeocin 的 YPD 洋菜培養基，放置於 30 ℃ 培養箱培養兩天，此為第一次純化，之後再以相同方式進行第二次純化，以得到單一菌株。. 五、轉型菌株的鑑定 1.抗抗生素篩選系統由於以置換方式插入，其基因套數為單套 (Vassileva et al., 2001)，故可藉由 colony PCR 方式確認其是否進行置換，並了解其插入位置。而在本實驗中置換方式有兩種，第一種是以外源基因取代基因體上原本的 AOX1 基因，故若置換成功，菌株會由 Mut+ 變成 Muts；而第二種是於 AOX terminator 與 3’ 端 AOX 位置進行互換，而其菌株依舊為 Mut+。故可藉由轉型株在甲醇使用上的情形再次確認其插入位置。由這兩種判斷方式可推斷其為單套插入。 1.1 外源基因 Sh ble 基因插入 P. pastoris 基因體位置鑑定─ colony PCR 1.1.1 模板的置備 15.

(25) 於 PCR 小管中放入 75 μl TE (pH=7.4) 緩衝液，以滅菌牙籤沾取純化後的單一菌落，於 TE 緩衝液中攪拌，而後蓋上蓋子放置於試管架上，避免 PCR 小管底部直接接觸微波爐底盤。放入微波爐後，將強度調整為最強，微波 3.5 分鐘後高速震盪數秒，離心 30 秒，之後重覆此步驟四次，此四次分別調整微波時間為 2 分鐘、 1.5 分鐘、1 分鐘、30 秒。將微波後的樣品放入 -80 ℃ 冰箱 10 分鐘，之後取出以 95 ℃ 加熱 2 分鐘，重覆此步驟三次，接著以 2500 rpm、15 分鐘離心，之後選取 5 μl 上清液為模板，剩餘部份冰於 -80℃ 冰箱保存，待要用之時以 95 ℃ 加熱 2 分鐘後直接取用。(參考 Pichiapink expression kit) 1.1.2 PCR 方式為確認外源基因有成功轉型並以基因置換方式插入預設位置，設計一引子位於細胞的基因體上，另一引子則位於質體上，只有經由基因置換嵌入之轉型株才可經由 PCR 方式得到預期產物；若為隨機插入方式的轉型株則無法得到 PCR 產物或其產物大小不符合預期。此 PCR 方式設計如圖三 (A) 所示，而此方式使用了四對引子進行測試，如表四所列，而 PCR 各組引子產物如圖三 (B) 所示。 1.2. 基因體中外源基因套數鑑定 ─ Mut screen 1.2.1 菌量控制─連續培養法根據 Invitrogen 公司提供的菌量控制方法如下：挑選單一菌落接種於 200 μl YPD 液態培養基，置於 96 孔盤，以無震盪方式培養於 30 ℃兩天，此為第一次培養。而後由第一次培養中取出 10 μl 置於新的 96 孔盤，加入 190 μl YPD 液態培養基，以無震盪方式培養於 30 ℃一天，此為第二次培養。再由第二次培養中取出 10 μl 置於新的 96 孔盤，加入 190 μl YPD 液態培養基，以無震盪方式培養於 16.

(26) 30 ℃一天，此為第三次培養，並再重覆第三次培養之步驟一次，該次為第四次培養。經由此連續培養方式，菌量與生長情形會達到一致，才可用作接下來之 Mut screen。 1.2.2 使用甲醇為碳源之生長情形篩選將第四次培養測定菌量後以 100 倍稀釋，而後分別吸取 2 μl 菌液點於以葡萄糖為碳源的 minimal dextrose with histidine (MDH) 洋菜培養基與以甲醇為碳源的 minimal methanol with histidine (MMH) 洋菜培養基上，並進行二重覆，以 30 ℃培養兩天，觀察其生長情形。 MDH 洋菜培養基為一對照組，以確認每一菌液之初始菌量與生長情形一致；而在 MMH 洋菜培養基上，可觀察到 Mut+ 與 Muts 生長情形的不同，將 Muts 菌株命名為第一型插入 (Type1)，而 Mut+ 菌株命名為第二型插入 (Type2)。 1.3. 確認 Type1 與 Type2 轉型株生長情形一致雖然 Type1 與 Type2 兩種不同插入位置的轉型株差異極小，但深怕此種差異會影響生長情形，故先於不同 zeocin 濃度的 YPD 洋菜培養基上培養，觀察其是否有差。隨意挑選 Type1 與 Type2 轉型株各 5 支，經由上述所提 Invitrogen 公司提供的菌量控制方法，以期其菌量與生長情形一致。之後將菌量稀釋 1000 倍，之後分別吸取 2 μl 點在不同 zeocin 濃度 (終濃度分別為 100 μg/ml、200 μg/ml、 300 μg/ml、500 μg/ml) 的 YPD 洋菜培養基上。若其結果一致則可將 Type1 與 Type2 兩種轉型株一同篩選，若不一致則需分別測得其野生型最低 zeocin 致死濃度後，分別進行篩選，避免因轉入方式不同而干擾篩選結果。. 17.

(27) 2.外源蛋白 CRL 2 表達 2.1 外源 CRL 2 基因插入 P. pastoris 基因體位置鑑定 ─ colony PCR 該段基因插入藉由 AOX terminator 位置進行同源互換，該插入方式常出現多套之插入。使用上述所提之模版製備方式取得模版，設計兩對引子確認插入位置。第一對引子為確認是否有於 AOX terminator 位置進行同源互換，一引子位於細胞的基因體上，另一引子則位於質體上，只有於 AOX terminator 插入之轉型株才可經由 PCR 方式得到預期產物；若為隨機插入方式的轉型株則無法得到 PCR 產物或其產物大小不符合預期。第二對引子為確認該位置插入是否為單套，若該位置插入為單套則無法得到 PCR 產物，若不只一套則會出現 PCR 產物。此 PCR 方式設計如圖四 (A)、(B)所示，而兩對引子表四所列，而 PCR 各組引子產物如圖四 (C) 所示。. 六、抗抗生素篩選系統建立 1.野生型 pGAP 之強度判定與篩選系統建立隨意挑選 Type1 與 Type2 轉型株各 2 支，藉由菌量控制方法，使菌量與生長情形一致。之後將菌量分別稀釋 100、1000、10000 倍，之後分別吸取 2 μl 點在不同 zeocin 濃度 (終濃度分別為 100 μg/ml、500 μg/ml、750 μg/ml、1000 μg/ml) 的 YPD 洋菜培養基上，觀察其生長情形，找到可殺死野生型轉型株的最低致死濃度，在此濃度下無菌落的生成。並由此建立篩選系統。. 2.突變型 pGAP 之篩選將轉型、純化後的菌株依循野生型轉型株的培養方式，藉由野生型建立之篩選系統，挑出比野生型較強的菌株，並提高 zeocin 濃度， 18.

(28) 更進一步篩選出更強的 pGAP。. 3. DNA 定序分析 (DNA sequence) 此部份委託基龍米克斯公司進行。. 七、外源蛋白 CRL 2 表達量之分析將外源基因轉入 P. pastoris 細胞並進行淳化後，於培養基以牙籤輕挑些許菌，將其放入具 10 ml 新鮮 YPD 培養液錐形瓶中在 30 ℃培養箱培養五天，並於第二天、第三天、第四天、第五天分別取 1ml 菌液待測。. 1.菌量測定利用 biotech (岑祥，台灣) 之 μQuent 96 microplate 光譜儀測量 OD600 之吸光值，測量體積固定為 200 μl。. 2.酵素表達量定量分析 ─ kinetic assays 脂肪酶之活性分析以 p-nitrophenyl 呈色法進行，將 3.5 μl p-nitrophenyl butyrate 受質溶於 10 ml 之 20 mM Sodium phosphate buffer 與 2.5 % Triton X-100 的基質液中，使其終濃度為 2 mM，此即為受質液。取 10 μl 待測之樣本培養液，與 100 μl 受質液混合均勻，利用 biotech (岑祥，台灣) 之 μQuent 96 microplate 光譜儀於波長 405 nm 下進行動力學分析，反應過程中所取得之最大斜率 (ΔOD/min)，以下列公式推算其酵素活性 (unit)，比較不同轉型株之活性大小：. 19.

(29) ε：消光係數 11000 (M-1cm-1) V：反應體積 (μl) d：光徑 (cm). 活性單位 (unit) 定義為在上述反應條件下，每分鐘水解 1 μmole 的 p-nitrophenyl butyrate 所需之酵素量。. 八、套數確認與轉錄程度決定 ─ quantitative real-time PCR 藉由 quantitative real-time PCR 測定外源基因 Sh ble 基因及 CRL 2 基因插入套數與轉錄程度，並使用 P. pastoris 的 arg 基因為參考基因。合成目標基因 Sh ble 基因 (代號為 ZEO) 及 CRL 2 基因 (代號為 LIP2) 與參考基因 arg 基因 (代號為 ARG) 之引子，如表五所列。其中 ZEO 之引子合成參照 2009 年 Marx 等人之文獻 (Marx et al., 2009)。. 1.插入套數測定使用 GeneMark 廠牌之 Easy Tissue &Cell Genomic DNA Purification kit (Cat：DPD21E-150) 抽取 genomic DNA 備用。 Quantitative real time PCR 反應條件參照 Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix manual (Fermentas)，其中使用 2 ng genomic DNA 當作模板，引子最終濃度為 200 nM，於 ABI Real-time PCR 儀器進行測定，反應時間如下：階段. 目的. 溫度 20. 時間(min). 循環次數.

(30) Denature. 95 ℃. 10 min. Denature. 95 ℃. 15 sec. Annealing/Extension. 60 ℃. 1 min. 95 ℃. 15 sec. 70 ℃. 15 sec. 95 ℃. 15 sec. 1 2. 3. Melt Curve. 1 40. -. 2.mRNA 表達量測定抽取 total RNA 是使用 QIAGEN 公司之 RNeasy mini kit (Cat： 74104) 搭配其 RNase-free DNase set (Cat：79254) 抽取轉型株 total RNA 備用。而 Quantitative real time PCR 反應條件參照 Power SYBR Green RNA-to-CT one-step kit (Applied Biosystems)，其中使用 50 ng RNA 當模版，引子最終濃度為 100 nM，總體積為 20 μl。反應條件如下：目的. 溫度. 時間(min). Holding. 48 ℃. 30 min. Holding. 95 ℃. 10 min. Cycling. 95 ℃. 15 sec. (40 cycles). 60 ℃. 1 min. Melt Curve. 95 ℃. 15 sec. (optional). 70 ℃. 15 sec. 95 ℃. 15 sec. 21.

(31) 肆、結果一、抗抗生素篩選系統建立 1.野生型 pGAP 轉型結果隨意挑選 50 支轉型株，藉由 colony PCR 方式可得到有 27 支是屬於 Type1 或 Type2 插入，約占 54 %，而 27 支中有 22 支為 Type1 插入，是藉由 5’pAOX 與 3’AOX 位置進行基因置換，約占正確插入的 81.5 %；另 5 支則於 Type2 插入，是藉由 AOX terminator 與 3’AOX 位置進行基因置換，約占 18.5 %。PCR 結果如表六所示。隨意選取 Type1 與 Type2 各五支，經由連續培養法以 100 倍稀釋，而後分別吸取 2 μl 菌液點於 MDH 洋菜培養基與 MMH 洋菜培養基上，可觀察到於 MDH 洋菜培養基的菌落皆一致，不因 Type1 或 Type2 而有所差異；而 MMH 洋菜培養基中可見，Type1 生長情形略差於 Type2，其表現型符合基因型，得到預期之結果，如圖五所示。同時將此兩組的轉型株以 100 倍與 1000 倍稀釋後，吸取 2 μl 菌液點在 zeocin 終濃度分別為 100 μg/ml、200 μg/ml、300 μg/ml、 500 μg/ml 的 YPD 洋菜培養基上，觀察其生長情形，發現不管是 Type1 生長情形與 Type2 相同，而兩者同樣在 1000 倍稀釋後於 500 μg/ml 的 YPD 洋菜培養基一樣無肉眼可見菌落生成，如圖六所示。. 2.野生型轉型株篩選將經過 Mut screen 篩選的十支轉型株 (Type1 五支與 Type2 五支) 一樣經由連續培養法，之後以 1000 倍稀釋，點在含有不同 zeocin 濃度 (終濃度分別為 100 μg/ml、500 μg/ml、750 μg/ml、1000 22.

(32) μg/ml) 的 YPD 洋菜培養基上，30 ℃培養兩天後，可以發現在 100 μg/ml YPD 洋菜培養基上，100 倍與 1000 倍稀釋中皆有菌落形成，而 10000 倍稀釋雖有菌落形成，但是菌落很稀疏。500 μg/ml YPD 洋菜培養基上，只有 100 倍稀釋有稀疏的菌落形成，其餘兩種稀釋倍率皆無肉眼可見菌落形成；含 750 μg/ml zeocin 與含 1000 μg/ml zeocin 的 YPD 洋菜培養基上，任何一種稀釋倍率皆無肉眼可見菌落形成，結果如圖七所示。於是選擇稀釋倍率為 1000 倍，點在 500 μg/ml YPD 洋菜培養基上於 30 ℃培養兩天為之後突變型轉型株篩選條件，若突變型啟動子較野生型更強，其會於此培養條件下有肉眼可見菌落形成，反之亦然。. 3.突變型轉型株篩選將高突變率組 (EP-1) 與低突變率組 (EP-2) 分別轉入 SMD1168H，進行兩次純化得到單一菌株，連續培養後依照野生型篩選找出的條件：稀釋倍率為 1000 倍，點在 500 μg/ml YPD 洋菜培養基上於 30℃培養兩天，觀察其生長情形 (結果如圖八所示)，挑選生長情形較好的菌株保存，在第一輪篩選中 EP-1 組共篩選 288 株 (編號 1-288)，挑選了 51 支生長較好的菌株，而 EP-2 組篩選了 420 株 (編號 1-420)，挑選了 30 支生長較好的菌株。. 4.插入位置判定與套數確認將第一輪篩選所得的 81 支菌株進行插入位置的判定，發現其中有 55 支為隨機插入，無法判斷其插入位置；屬於 Type1 插入有 20 支；而 Type2 插入有 6 支，colony PCR 結果如表七所示。將屬於 Type1 與 Type2 的菌株 (共 26 支) 進行 Mut screen，結果如圖九所 23.

(33) 示，Type 生長情形為 Muts， Type2 為 Mut+，其結果如圖五所示。在這兩實驗中基因型與表現型一致，同時在此也可確認其插入套數為單套插入。並使用 quantitative real time PCR 再進行確認套數，由表可知其插入套數與上述實驗結果符合，皆為單套。. 5.高濃度篩選與較強突變型啟動子取得將確認完套數與插入位置的 26 支突變株進行更高濃度 zeocin 的篩選，YPD 洋菜培養基中 zeocin 終濃度提高至 600 μg/ml、800 μg/ml、1000 μg/ml，生長情形如圖十所示。從中挑選到四支突變株，其在 1000 μg/ml YPD 洋菜培養基仍有肉眼可見菌落的形成，其分別為 EP-1 組的 181 (Type2 插入)、194 (Type1 插入) 與 EP-2 組的 202、 203 (Type2 插入)。將其送基龍米克斯公司定序 pGAP 部分，得到結果如圖所示，其中定序後發現 202 與 203 序列相同，結果附於圖十一上，突變結果如下表所示： Number of. Number of. Rate of. Insertion. point mutation. mutagenesis. EP1-181. 0. 3. 0.62 %. EP1-194. 0. 2. 0.41 %. EP2-202. 1. 8. 1.86 %. 菌株. 〈203〉. 6.mRNA 表達量測定以野生型 pGAP 為基準，計算 EP1-181、EP1-194、EP2-202 mRNA 表達量之相對比例。由 quantitative real time PCR 確認這三支突變株 Sh ble 基因其 mRNA 表達量較野生型轉型株佳，尤其是 EP2-202，其 mRNA 表達量為三隻突變株中最好的。結果如圖十二所 24.

(34) 示。. 二、外源蛋白 CRL 2 表達量之分析 1.外源蛋白表達量結果分別取第二天、第三天、第四天、第五天樣本進行測定，並將其活性除以 OD600 值，以取得每 OD600 的活性值，之後分別以該天野生型轉型株的每 OD600 的活性值為 1，當作基準作為突變型的比較。發現這五天裡，EP2-202 轉型株的活性都較野生型轉型株為佳；而 EP1-181、EP1-194 則是未有明顯較野生型轉型株佳的情況，結果如圖十三所示。. 2.插入位置確認結果含野生型 pGAP 與突變型 EP1-181、EP1-194、EP2-202 的 pGAP 質體藉由同源互換方式在 AOX terminator 位置插入基因體，由 colony PCR 與 quantitative real time PCR (結果如圖十四所示) 發現挑到之轉型株多數為多套，且部分發生隨機插入，因恰巧多為雙套，故本次表達使用雙套插入之轉型株，同時也確認雙套插入位置相連，由 colony PCR 與 quantitative real time PCR 結果推測所挑選之雙套插入轉型株應符合圖四 (B) 所示。未來將藉由 transcription level 探究其未有增強表現之原因。. 3.mRNA 表達量測定以野生型 pGAP 為基準，計算 EP1-181、EP1-194、EP2-202 mRNA 表達量之相對比例。由 quantitative real time PCR 確認這三支突變株 CRL 2 基因其 mRNA 表達量，發現 EP1-181、EP1-194 未 25.

(35) 有較野生型轉型株佳的結果出現，而 EP2-202，其 mRNA 表達量則是有較野生型轉型株表達量較佳。結果如圖十五所示。. 26.

(36) 伍、討論本研究採用 selection 的方法來篩選強啟動子，其中有找到一個在 CRL 2 表達上較野生型佳的啟動子。而過去文獻中，Qin 等人以 pGAP 進行突變，得到較野生型強的啟動子，這些較強的啟動子可以增強其他重組蛋白的表達，而其使用的篩選方式是採用 screening 的方式。我們亦嘗試過將 Qin 等人發表過的最佳 pGAP-G1 (NCBI 編號 JF414578) 一同拿來做 CRL 2 的表達，結果發現其蛋白質表達量在第二天相對於野生型約有 1.32 倍的增加，第三天與第四天以及第五天約是 1.13 倍的增加，與本研究中以 selection 方式得到的強啟動子在 CRL 2 表達能力相近。顯示這兩個方式篩選出的強啟動子在 CRL 2 表達能力是相近的，而在篩選數量上來說，我們以 selection 方式進行篩選的數量 (708 株) 遠少於文獻中以 screening 方式進行篩選的數量 (約 30,000 株)，但一樣可得到在 CRL 2 表達上強度相近的突變型啟動子。在本研究完成後的 2013 年 6 月 Berg 等人發表之文獻，亦使用 selection 方式進行突變株的篩選，亦是藉用抗生素 zeocin 進行篩選，由其抗藥性去評估啟動子強弱。然而其使用的是誘導型的 pAOX，並以質體形式轉入 P. pastoris 中，而非插入基因體中，不論轉入質體數多寡，直接進行其抗藥性測定，以抗藥性直接表現出其啟動子強弱 (Berg et al., 2013)。但由於未測定轉入質體套數多寡，故無法去除套數多寡對其抗藥性的影響，進而無法正確評估該啟動子強弱。而本篇則是將外來基因嵌入宿主的基因體上，並進行套數的測定，以避免套數多寡影響抗藥性，進而干擾我們對啟動子強弱的評估。除了以抗藥性篩選突變型轉型株外，再加以利用 quantitative real time PCR 直接測定啟動子驅動的 mRNA 表達量，以比較突變型轉 27.

(37) 型株能力。. 一、轉型株鑑定在抗抗生素系統中，外源基因藉由置換方式進入 P. pastoris 基因體，理想狀態下，大部分應是在預期的位置進行同源重組。而在本實驗中約有一半的插入是隨機插入，另一半則是預期中的置換插入。推測原因來自轉型所需的 DNA 是以 PCR 方式產生，而非來自質體 DNA，因為 overlapping extension PCR 所產生的 PCR 產物，兩端被用來重組的序列其完整性較差，使得辨認位置發生異常，而造成發生正確同源重組的機率下降的結果。由於質體設計，會有兩種置換插入方式，而不管是哪一種，插入套數皆為單套；由於兩種插入方式位置相近，比較預測插入位置，發現兩者插入後序列只差在其中一種的 5’pAOX 後面接的基因是 α factor，而另一種的 5’pAOX 後面接的基因是 AOX1 基因，故如預期，兩種轉型株在抗藥性上並無太大差別。而外源蛋白 CRL 2 表達系統中，外源基因是在 AOX terminator 位置以 single homologous recombination 同源互換方式進入 P. pastoris 基因體中，本實驗中此種插入方式造成高比例的多套插入，故在此是以雙套插入的轉型株進行實驗分析。. 二、抗抗生素篩選系統建立質體建構時，在 pGAP 後面接 Sh ble 基因 (抗 zeocin 基因)，預期藉由轉型株抗藥性評估 pGAP 的強度，找出野生型 pGAP 最低 zeocin 致死濃度，其亦代表野生型 pGAP 的強度。經由此方式所定出的致死濃度是可信的，其理由如下：由野生型 pGAP 轉型株中隨意挑選四支，經由連續培養法控制菌量，發現藉由此方法各轉型株之 28.

(38) 間菌量可達到一致，避免因菌量多寡不一與生長快慢不同造成篩選上的干擾。而藉由不同倍數的稀釋，找出適合點菌的濃度，確認所有菌都能接觸到含 zeocin 的 YPD 培養基表面。避免點在含 zeocin 的 YPD 培養基時，因為層疊效應，部分細胞能生長於培養基是因未接觸到 zeocin 而能生長，而非其具有抗該濃度 zeocin 之能力。而由四支隨機挑選的轉型株生長結果，其生長狀況與抗藥性一致，可以發現可能存在於其內的個體差異性在此應是可以被忽略的，並避免不同轉型株因面對環境壓力不同而產生不同之適應而干擾篩選結果，同時也由定序結果確認 pGAP 與 Sh ble 基因並未發生突變，避免可能造成之突變會影響後續結果。. 三、突變型 pGAP 轉型株篩選在此使用了 error prone PCR 的方式進行隨機突變，針對 pGAP 位置進行低突變率 (2 %) 與高突變率 (20 %) 之隨機突變。但將篩選到的轉型株定序時發現原本預計突變率為 2 % 的轉型株 EP1-181 與 EP1-194 兩株，前者突變率為 0.62 %，後者突變率為 0.41 %；而由突變率設定為 20 %中篩選到的 EP2-202 與 EP2-203 序列相同，而其突變率只有 1.86 %。不管是高突變率組或低突變率組兩組的突變率都與原本設定相差極大，推測其原因可能是進行 error prone PCR 的試劑其效力可能不如預期，又或者是在實驗過程中的誤差而導致突變率不如預期，但兩組依舊維持在一高突變率與一低突變率。原本在 500 μg/ml zeocin 的培養基中挑到的 26 支突變株，實驗中可看到，在含高濃度抗生素的洋菜培養基中能存活的愈來愈少，而最後 1000 μg/ml zeocin 的 YPD 洋菜培養基中挑到的突變株只有四株，同時也確認這四株在 500 μg/ml zeocin、600 μg/ml zeocin、800 29.

(39) μg/ml zeocin 的 YPD 洋菜培養基皆有生長，以排除這四支是因突然遭遇逆境而產生其它相對應機制而能存活於高濃度的篩選中。將具高濃度 zeocin 培養基挑選的四隻菌株 EP1-181、EP1-194、EP2-202、 EP2-203 進行定序以得到其 pGAP 序列，並確認這四支轉型株在 Sh ble 基因位置皆未發生突變，排除極端環境可能造成 Sh ble 基因突變而使其抗藥性增加，而定序結果也發現 EP2-202、EP2-203 兩株 pGAP 突變位置相同，所以接下來只以 EP2-202 進行其它實驗。而由轉錄表現量的結果也可得知在此系統中這三種突變株的轉錄強度的確高於野生型，故其可產生較多的抗 zeocin 蛋白以對抗高濃度抗生素。經由 quantitative real time PCR 測定，發現 EP2-202 其 mRNA 表現量特別高，對照圖十一突變株定序結果分析，發現 EP1-181、 EP1-194 僅發生多處單點突變，而 EP-202 除了多處單點突變的發生外，還發生了在預測的 TATA box 附近有 6 個 mer 的插入，在 EP-202 這個啟動子上，轉錄起始點與 TATA box 距離增加，推測其可能為其強度較另兩個啟動子為強之原因。. 四、外源蛋白 CRL 2 表達由實驗結果發現本實驗在抗抗生素系統篩選中，所得到的 EP1-181、EP1-194、EP2-202 其 zeocin 蛋白表現量與 mRNA 表達量皆優於野生型轉型株，此三株在接外源蛋白 CRL 2 時，其蛋白表現量與 mRNA 表達量，只有 EP2-202 有略優於野生型轉型株。但就此三種突變株而言，將抗抗生素系統篩選中 mRNA 表達量與 CRL 2 系統中 mRNA 表達量相比，可發現皆是 EP2-202 表現量較佳，但提升程度兩者並不同，而原本在抗抗生素系統中 mRNA 表達量有增加的 EP1-181、EP1-194，但在 CRL 2 系統中 mRNA 表達量 30.

(40) 卻未增加。檢查是否因插入位置造成此結果中，也發現這些菌株插入位置皆相同，故可排除因插入位置不正確造成的影響。推測原因可能來自表達 CRL 2 的 plasmid construction 及 recombination 方式與抗抗生素篩選系統不同，表達 CRL 2 基因的質體是採用 single homologous recombination，插入位置在 AOX terminator，而表達 sh ble 基因的質體是 double homologous recombination，是在 5’pAOX 與 3’ AOX 進行置換或在 AOX terminator 與 3’AOX 進行置換，可能會受 integrant 周圍不同的 regulatory elements 的影響，而有不一致的結果。 EP1-181、EP1-194 與 EP2-202 三者在表達抗 zeocin 蛋白時，比表達 CRL 2 時 (在第二天活性分別野生型的 1.12、1.04 與 1.43 倍) 有較高的表達量，此現象可由三者皆能有高抗藥能力推得，探究其原因，除了如上述是因為 plasmid construction 及 recombination 方式與抗抗生素篩選系統不同外，Waters 等人 2006 年曾提出轉錄的 mRNA 穩定度、轉譯調控、轉譯後修飾或是蛋白質穩定度的差異，皆有可能影響蛋白產量、品質及其折疊效率 (Waters et al., 2006)。在轉錄的 mRNA 穩定度方面而言，過去文獻中也曾提到最終蛋白產量多寡，該基因轉錄的 mRNA 穩定與否亦是重要原因 (Hargrove & Schmidt, 1989)。而在轉譯後修飾與蛋白質穩定度方面而言，外源蛋白表達時可能對細胞造成壓力 (大量外源蛋白折疊壓力或氧化壓力)，而活化 unfolded protein response (UPR)，其雖可促進蛋白正確折疊，但也會刺激 endoplasmic-reticulum-associated protein degradation (ERAD) 過程發生或誘發細胞死亡，最後蛋白表達量亦不佳 (Mattanovich et al., 2004)。歸究抗抗生素篩選系統中挑出較佳之轉型，在 CRL 2 表達不佳的原因，除了可能有 mRNA 穩定度與轉譯調控之影響；又因在本 31.

(41) 研究中抗 zeocin 蛋白為胞內蛋白，CRL 2 為胞外蛋白，不排除有轉譯後修飾或蛋白質穩定度差異之影響。而為釐清 CRL 2 表達量不佳是否牽涉蛋白質分泌步驟，未來將會將質體中 CRL 2 基因前的 α factor 分泌性訊號序列去除，期待其變成胞內蛋白時，扣除掉分泌步驟影響，CRL 2 表達量應是會較其為胞外蛋白時增加，而此部分未來可留於後人證實。篩選較強的啟動子尚可以 CRL 2 為 reporter，亦為可行方法之一，但此法為 screening 而非 selection，操作上篩選數量通常較 selection 大量，其所耗費時間與實驗成本也較多，故其效率會較 selection 低。. 32.

(42) 陸、參考文獻 Berg, L., Strand, T. A., Valla, S., & Brautaset, T. (2013). Combinatorial mutagenesis and selection to understand and improve yeast promoters. BioMed Research International 2013: 926985.. Brierley, R. A. (1998). Secretion of recombinant human insulin-like growth factor I (IGF-I). Methods Mol Biol 103: 149-177.. Lin-Cereghino, J., & Cregg, J. M. (2000). Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Microbiol Rev 24(1): 45-66.. Lin-Cereghino, J., Hashimoto, M. D., Moy, A., Castelo, J., Orazem, C. C., Kuo, P. & Lin-Cereghino, G. P. (2008). Direct selection of Pichia pastoris expression strains using new G418 resistance vectors. Yeast 25(4): 293-299.. Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y., & Madden, K. R. (1985). Pichia pastoris as a host system for transformations. Mol Cell Biol 5(12): 3376-3385.. Cregg, J. M., Madden, K. R., Barringer, K. J., Thill, G. P., & Stillman, C. A. (1989). Functional characterization of the two alcohol oxidase genes from the yeast Pichia pastoris. Mol Cell Biol 9(3): 1316-1323.. Daly, R., & Hearn, M. T. (2005). Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production. J Mol Recognit 18(2): 119-138. 33.

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(46) 表一：利用PCR方式得到 wild type pGAP 質體片段所使用的引子基因片段. Zeocin (381 bp). Full-length (3132 bp). 引子名稱. 序列〈5’-3’〉. 5’zeo/spe1. GACACTAGTATGGCCAAGTTGACCAG TGC ACAGGTACCTCAGTCCTGCTCCTCGG CC. 3’zeo/kpn1 5’AOX 3’AOX. AGATCTAACATCCAAAGACGAAAGG TTG GTATTTATCGCCTTGGCTCGTC. 37.

(47) 表二：利用 Overlap extension PCR 方式得到含 mutant pGAP 質體片段所使用的引子其中 5’pGAP 與 3’pGAP-5’AOX 序列有互補，為之後 OE PCR 所用疊合位置；而 3’pGAP 與 5’GAP-3’AOX 序列有互補，為 OE PCR 所用疊合位置。基因片段片段一 (1962 bp) 片段二 (526 bp) 片段三 (874 bp). 引子名稱. 序列〈5’-3’〉. 5’pic. AGATCTAACATCCAAAGACGAAAG. 3’pGAP-5’AOX ACTAGTATGGCCAAGTTGACCAGT 5’pGAP. ACTGGTCAACTTGGCCATACTAGT. 3’pGAP. ATGGCGCCATGCATGAGATC. 5’GAP-3’AOX. GATCTCATGCATGGCGCCAT. 3’pic. AGATCTTGAGATAAATTTCACGTTT. Full-length 5’AOX ((3132 bp) 3’AOX. AGATCTAACATCCAAAGACGAAAG GTTG GTATTTATCGCCTTGGCTCGTC. 38.

(48) 表三：進行 PCR 取得 mutant 啟動子 (EP1-181、EP1-194、EP2-202) 之引子編號 EP1-181 & EP1-194 (496 bp). 引子名稱. 序列〈5’-3’〉. F’GAP NsiI. ATGCATGACATCAGATCTTTTTTGTA G TTCGAAATAGTTGTTCAATTGATTGA A. R’GAP BstBI. F’GAP NsiI-b EP2-202 (512 bp). R’GAP BstBI-b. ATGCATGAGATCAGATCCCTTTTGTA G TTCGAAATAGTTGTTCAATGGATGG AA. 39.

(49) 表四：進行 colony PCR 之引子 (A)抗生素篩選系統：共四組引子引子名稱. 序列〈5’-3’〉. R’bAOX/PIC 3’aF. CAATGTCACTAGGATCTTAGCAC AGCTAATGCGGAGGATG. R’bAOX/PIC B (~2.2kb) AOX1. CAATGTCACTAGGATCTTAGCAC AGTGTAGAAGGAAGCAGTCT. PCR A (~2kb). C (~1.4kb) D (~0.9kb). R-g3’AOX 5’pGAP. TGGAGCCCGTTCGGTATTAGAATTTG ACTAGTATGGCCAAGTTGACCAGT. 3’pGAP 3’zeo/kpn1. ATGGCGCCATGCATGAGATC ACAGGTACCTCAGTCCTGCTCCTCGGC C. (B) 外源蛋白 CRL 2 系統：共兩組引子 PCR. 引子名稱. 序列〈5’-3’〉. AOX1 F’ E (~1.2kb) 3’AOX. GGGGTGGTGTTTTGGACCACAG GTATTTATCGCCTTGGCTCGTC. AOX1 F’ F (~1.1kb) Sh ble F’. GGGGTGGTGTTTTGGACCACAG ACCACTCGGCGTACAGCTCGTC. G F’GAP/Nsi I ATGCATGAGATCAGATCTTTTTTGTAG (~3.7kb) 3’zeo/kpn1 ACAGGTACCTCAGTCCTGCTCCTCGGCC. 40.

(50) 表五：使用於 quantitative real time PCR 之引子 PCR 引子名稱. 序列〈5’-3’〉. 5’ARG ARG 3’ARG. TCCTCCGGTGGCAGTTCTT TCCATTGACTCCCGTTTTGAG. Sh ble F ZEO Sh ble R. ACCACTCGGCGTACAGCTCGTC CCCGGGACTTCGTGGAGGAC. LIP2. F’q R’q. GGCAGCGGCAGTGTGATCT CGGCGGGTTGGAAAAGA. 41.

(51) 表六：野生型 colony PCR 結果野生型 ( 共 50 支 ) 進行測試組別. 野生型. Type1. 1,2,4,6,8,9,13,15,20,24,25,26,27,29,31,33,34,36,37,41,42,46. Type2. 19,38,43,48,50. random. 3,5,7,10,11,12,14,16,17,18,21,22,23,28,30,32,35,39,40,44,45, 47,49. 42.

(52) 表七：突變型 colony PCR 結果組別. EP-1 組. EP-2 組. Type1. 41,47,117,132,139,176,194,24 15,55,90,91,151,159,214,263, 2 288,330,356,414. Type2. 181,223,246. random. 3,9,23,24,26,27,29,32,37,42, 7,56,62,85,128,152,170,252, 51,53,54,56,57,72,74,75,83, 293,310,357,408,417,418,419 84,95,97,101,102,104,106,118 ,125,136,146,154,157,166, 167,179,180,249,272,275. 202,203,395. 43.

(53) (A)：pAOX-GAP-Zeo 質體. (B)：轉型用質體片段. 圖一：pAOX-GAP-Zeo 質體與轉型用質體片段上圖中在 pGAP 位置前後分別設計疊合位置，使得其可以與片段三進行 OE PCR，得到片段四之後再藉由另一疊合位置，可以與片段一進行 OE PCR，以得到全長。. 44.

(54) 圖二：pGAPZαC-LIP2 質體圖. 45.

(55) (A)各組引子位置圖. (B)PCR 產物圖. 圖三：抗生素篩選系統 colony PCR 設計與各組引子產物電泳圖 A、B、C、D 分別表示表二該組引子所 PCR 結果，D 組為正控制組，確保 colony PCR 有正常進行。若結果為 A、C、D 皆有，代表其為 Type1 插入；若結果為 B、C、D 皆有，代表其為 Type2 插入；若結果只有 D 則其為隨機插入，在此實驗不討論。. 46.

(56) (A). (B). (C) PCR 產物圖 ( 1、2、3、4、5 分別指轉型成功之菌株 ). 圖四：外源蛋白質 CRL 2 系統 colony PCR 設計與各組引子產物電泳圖 NC 為未進行轉型的 SMD1168 菌株，在此當 negative control 用。 EFG 分別表示表二 (B) 所列引子 PCR 結果，E 組在未進行轉型的 SMD1168 則有產物出現，轉型成功的菌株此時不會有產物的出現，因為 extension time 設定時間是 30 秒，若轉型成功則產物約 7000 bp，故在此應無產物出現，若要有產物則需拉長 extension time。反之亦然，F 組在轉型成功的菌株會有產物的出現，而未進行轉型的 SMD1168 則沒有產物出現，同一隻菌株應該只會出現 E 組或 F 組其中一組的產物。而 G 組則是只有雙套相接連插入才會有產物的出現。 (C)圖中由左到右分別為 E、F、G 組引子進行 PCR 之電泳圖。 47.

(57) MMH. MDH. Type1 Type2 control. Mut. +. Mut. s. Mut. +. Mut. s. 圖五：野生型轉型株 Mut screen Control 組為已確認之 Mut+與 Muts。而 Type1 為 Muts，Type1 為 Mut+。在 MMH 培養基可見到兩者之不同，而在 MDH 培養基上兩者生長情形相似。. 48.

(58) 1. 2. 3. 4. 5. Type1 1/100 1/1000 100μg/ml zeocin YPD. Type2 1/100 1/1000 Type1 1/100 1/1000. 200μg/ml zeocin YPD. Type2 1/100 1/1000 Type1 1/100 1/1000. 300μg/ml zeocin YPD. Type2 1/100 1/1000 Type1 1/100 1/1000. 500μg/ml zeocin YPD. Type2 1/100 1/1000 圖六：野生型轉型株 Type1 與 Type2 生長情形比較. 轉型株 Type1 與 Type2 任意選取五支以 100 倍與 1000 倍稀釋後，吸取 2μl 菌液點在 zeocin 終濃度分別為 100μg/ml、200μg/ml、 300μg/ml、500μg/ml 的 YPD 洋菜培養基上，觀察其生長情形。. 49.

(59) 稀釋倍率. 1. 2. 3. 4. NC. 1/100 1/1000. 100μg/ml zeocin YPD. 1/10000 1/100 1/1000. 500μg/ml zeocin YPD. 1/10000 1/100 1/1000. 750μg/ml zeocin YPD. 1/10000 1/100 1/1000. 1000μg/ml zeocin YPD. 1/10000 圖七：野生型轉型株最低致死濃度篩選. 將轉型株 (Type1 五支與 Type2 五支) 經由連續培養法，之後以 100 倍及 1000 倍稀釋，點在含有不同 zeocin 濃度 (終濃度分別為 100μg/ml、500μg/ml、750μg/ml、1000μg/ml) 的 YPD 洋菜培養基上， 30℃培養兩天。NC (negative control) 為一支不具抗 zeocin 基因之轉型株。. 50.

(60) EP-1 組，共 288 支. EP-2 組共 420 支. 圖八：突變型轉型株篩選在此處的篩選中，每一培養基上皆有點隨意一支野生型的菌株做為對照組。各取 EP-1 組與 EP-2 組其中一盤篩選為例。 51.

(61) MDH plate. MMH plate 圖九：突變型轉型株 Mut screen Control 組為已確認之 Mut+與 Muts。而 Type1 為 Muts，Type1 為 Mut+。. 52.

(62) 圖十：突變型轉型株更高濃度篩選在此處的篩選中，每一培養基上皆有點隨意一支野生型的菌株做為對照組。. 53.

(63) 圖十一：突變株 EP1-181、EP1-194、EP2-202 定序結果整理此序列分析藉由 Promoter Database of Saccharomyces cerevisiae 網站分析。. 54.

(64) 圖十二：Sh ble 基因 mRNA 表達量比較圖以野生型 pGAP 為基準，計算 EP1-181、EP1-194、EP2-202 mRNA 表達量之相對比例。. 55.

(65) 圖十三：CRL 2 活性比較圖野生型 (WT) 與突變株 (EP1-181、EP1-194、EP2-202 )第二、三、四、五天。活性單位 (unit) 定義：每分鐘水解 1μmole 的 p-nitrophenol butyrate 所需的酵素量。 a：1.00 代表 0.0024 unit/OD600(D2) b：1.00 代表 0.0026 unit/OD600(D3) c：1.00 代表 0.0026 unit/OD600(D4) d：1.00 代表 0.0026 unit/OD600(D5). 56.

(66) 圖十四：Quantitative real-time PCR for check copy number 此圖表示經 Quantitative real-time PCR 測定，具 CRL 2 基因之質體插入宿主套數。Control 為一支已確認為單套插入之菌株，在此以其為基準作為比較。. 57.

(67) 圖十五：CRL 2 mRNA 表達量比較圖以野生型 pGAP 為基準，計算 EP1-181、EP1-194、EP2-202 mRNA 表達量之相對比例。. 58.

(68) 附錄 1：P. pastoris 使用在外源蛋白的啟動子下表為 P. pastoris 中被找到的啟動子，而其轉錄強度是以常用之 pAOX 與 pGAP 為基準，其它啟動子與其之相對值。表格取自 Thomas 2012 年的 review paper。. 59.

(69) 附錄 2：質體插入方式上圖為外源基因以基因置換方式插入酵母菌基因體內示意圖。其藉由兩相同基因進行置換，其轉入基因體時外源基因會取代兩相同基因內的序列。圖片取自 Invitrogen 公司之 pPIC9k 說明書。下圖為外源基因以同源互換方式插入至酵母菌基因體內示意圖。轉入質體與基因體上有相同序列，藉由相同基因進行同源互換，而將外源基因嵌入基因體內。圖片取自 Invitrogen 公司之 pGAPZ A,B and C& pGAPZα A,B and C 說明書。. 60.

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